Name: Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a isolar hepatócitos humanos primários e células não-parenquimatosas do mesmo doador com alta viabilidade. Este método viabiliza modelos in vitro de co-cultura e engenharia de tecidos hepáticos para pesquisa.

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Nós gostaríamos de agradecer Jia Li Liu pelo seu apoio na criação da figura 1. Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Projecto de Investigação (BMBF) Fígado Virtual: 0.315.741.

Nota: Todas as células foram isoladas a partir de tecido do fígado ressecado não-tumoral humana, que permaneceu após a ressecção parcial do fígado com tumores hepáticos primários ou secundários. O consentimento informado dos pacientes foi obtido de acordo com as diretrizes éticas da Charité - Universitätsmedizin Berlim. 1. Preparação de Materiais e Soluções <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos e os materiais com antecedência, para evitar a contaminação bacteriana durante o processo de isolamento. </li><li> Preparar as soluções necessárias para a perfusão da amostra de tecido do fígado, o processo de isolamento de hepatócitos e células do fígado não-parenquimatosas e o cultivo de células de fígado humanas primárias de acordo com as Tabelas 1 e 2, com excepção da digestão-solução que é preparada imediatamente antes da utilização. Todas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° C e é recomendado para usá-los dentro de 4 semanas após a preparação. </li><li> Esterilizartodas as soluções que utilizam um filtro top 0,22 garrafa. </li></ol> 2. Preparação da perfusão Equipamento <ol><li> Defina-se a equipamento para a perfusão e a digestão da amostra de tecido do fígado, como mostrado na Figura 1A. </li><li> Ajustar a temperatura do banho de água a 39 ° C para assegurar a actividade óptima P colagenase durante a perfusão e digestão. </li></ol> 3. perfusão e digestão da amostra de tecido do fígado (1,5 h) <ol><li> Seleccionar uma amostra de tecido com uma cápsula de Glisson intacta a partir do tecido ressecado fígado. Ao cortar a amostra de tecido, tentar obter uma superfície de corte pequena com boas vasos visíveis. Evitar tempos de isquemia quente pelo transporte e manuseio da amostra de tecido do fígado em gelo até perfusão. </li><li> Aqui o peso de tecido sob condições estéreis e colocar a amostra de tecido do fígado em uma placa de Petri no fluxo de ar laminar. Limpar a superfície da amostra de tecido com uma compressa estéril de remaining sangue e liberar o conjunto cânula usando 1x Perfusão-Solution I para garantir que todos cânula eram permeáveis. </li><li> Use cola de tecido para fixar as azeitonas das cânulas em alguns vasos sanguíneos maiores. Dependendo do tamanho da amostra de tecido do fígado e o número de vasos na superfície, utilizar uma cânula de definir com 3 a 8 cânulas. Teste a perfusão e verificar se há vazamentos. Fechar todos os vasos sanguíneos, que vazam clara 1x Perfusão-Solution I, com cola de tecido. </li><li> Colocar a amostra de tecido do fígado canulada para o funil de Buchner sobre o seu disco de filtro perfurado (Figura 1A). </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba peristáltica entre 7,5 ml / min e 14,6 ml / min, dependendo do número de cânulas e utilizados na resistência do tecido do fígado. Ajustar o caudal de cada vez para garantir que há uma corrente de perfusão mas lento. Perfundir o tecido até que o sangue total é lavada para fora, mas, pelo menos, 20 min. Observe o tecido se tornar mais brilhante em áreas com boas perfusiem. Nota: Em alguns casos, pode ser necessário para fixar uma das cânulas com grampos plásticos ou para aumentar a pressão interior de uma área, empurrando suavemente com uma espátula contra a cápsula do fígado, para optimizar a perfusão. A mudança de cor completa para uma luz amarela para cor acastanhada luz indica uma boa perfusão. </li><li> Mudar o fluido de perfusão à digestão-solução contendo colagenase P (Tabela 1). </li><li> Reorganizar a configuração (Figura 1A) para a etapa de digestão. Portanto, realizar um fluxo circular da digestão-Solução de acordo com a Figura 1B para até 15 minutos. Nota: É crítico para parar imediatamente a perfusão, quando a amostra de tecido de fígado digerido é suficientemente. Uma boa digestão pode ser observado, quando o tecido não mostra sinal de elasticidade tal como avaliada por manutenção de deformações da cápsula, quando é empurrado com uma espátula. </li></ol> 4. Isolamento de hepatócitos (1 h) <ol><li> Turna bomba peristáltica fora e colocar a amostra de tecido do fígado num prato de vidro. Lavar o exterior da amostra de tecido com gelo frio Stop Solution (Tabela 1). Retirar as cânulas da amostra de tecido do fígado. Usar um bisturi para abrir a amostra de tecido do fígado, por incisão no meio da área onde as cânulas foram ligados. Manter cuidado para que a cápsula Glisson&#39;s permanece intacta. </li><li> Lavar o interior da amostra de tecido e, em seguida cobrir toda a amostra de tecido com gelo frio Stop Solution. Agitar suavemente o tecido para libertar as células para fora do tecido. </li><li> Recolha a suspensão de células e filtrá-la através de um funil olhar (funil de plástico forrado com compressa de gaze) em tubos de 50 ml de plástico. Adicionar mais Stop-Solução para a amostra de tecido do fígado, até um volume final de 500 ml é consumido. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante para o isolamento de células não-parenquimatosas mais tarde. Lava-se a pelete de células com PBS (Figura 2A). </li><li> Centrifugar novamente a suspensão de células a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento em meio de incubação de hepatócitos (Tabela 2, Figura 2B). </li><li> Determinar o número de células e a viabilidade na suspensão de células resultante utilizando coloração com azul de tripano. Contar as células vivas e mortas em uma câmara de contagem Neubauer. Calcule o número de células, viabilidade e produtividade de PHH usando as fórmulas abaixo. rendimento (células contadas) = ​​células contadas x factor de diluição x volume de suspensão de células (ml) x 10.000 rendimento (hepatócitos / (g de fígado amostra de tecido)) = (rendimento (hepatócitos / (meios ml)) x volume de suspensão de células (ml)) / (peso da amostra de tecido do fígado (g)) viabilidade (%) = 100% x (número de células vivas) / (número total de células) </li></ol> 5. Purificação de hepatócitos (1 h) Nota: Este passo de purificação é recomendado, se a viabilidadeé inferior a 70%. <ol><li> Execute todas as etapas no gelo. Preparar um gradiente de densidade de 25% por mistura de 5 ml de solução de gradiente de densidade e 15 ml de PBS por centrifugação em gradiente de densidade. </li><li> Coloque um máximo de 50 células Mio total de suspensão de células de hepatócitos rico cuidadosamente e lentamente na parte superior da camada de gradiente de densidade de 25% para assegurar que uma clara separação de ambas as camadas é conseguida (Figura 2C). Colocar os tubos cuidadosamente para a centrífuga e centrifugar a 1250 x g, 20 min, 4 ° C sem travagem (Figura 2D). </li><li> Aspirar a suspensão de células remanescente e as células mortas na interfase. Dependendo do um teor de matéria gorda também pode aspirar o gradiente de densidade-solução. Nota: PHH, com baixo teor de lípido formar um sedimento denso e o gradiente de densidade pode ser completamente aspirados. PHH com elevado teor de lípidos formam um sedimento mais difusa e uma grande quantidade de células viáveis ​​podem permanecer na solução de gradiente de densidade acima do sedimento. </li><li>Re-suspender as pelotas de hepatócitos com PBS e centrifugar novamente a 50 x g, 5 min, 4 ° C. Reúnem-se os aglomerados, lavar novamente com PBS e re-suspender purificada PHH em meio Hepatócito incubação. Efectuar a contagem das células, como descrito no passo 4.6. </li></ol> 6. A cultura de hepatócitos <ol><li> Prepare os pratos de cultura de células para a semeadura do PHH revestindo-os com uma matriz extracelular, por exemplo, colagénio de cauda de rato (colagénio do tipo I). Prepare o colagénio da cauda de rato de acordo com o protocolo estabelecido por Rajan et al. 17 </li><li> Dilui-se a solução de colagénio da cauda de rato a 1: 200 em PBS. Transferência / cm solução de 100 ul 2 rat colagénio de cauda nas placas de cultura, tomando cuidado para que toda a superfície é coberta. Incubar os plásticos de cultura de células durante 20 minutos à temperatura ambiente. Aspirar a restante solução de colagénio de cauda de rato. </li><li> Semente de 15 x 10 4 hepatócitos / cm 2 em meio de incubação em Hepatócito dishe culturas revestidos com colagénio de cauda de rato. Cultivar as células numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2 durante pelo menos 4 h. Após 4 h os hepatócitos aderiram e a forma pode ser alterada. </li><li> Realizar pesquisas, dependendo da configuração experimental. Um tempo de cultura de 48 horas é recomendado para permitir que as células para recuperar do processo de isolamento. </li></ol> 7. O isolamento das células do fígado não-parenquimatosas (1,5-2 h) <ol><li> Centrifugar o sobrenadante recolhido (passo 4,5 e 4,6) a 72 x g, 5 min, 4 ° C para eliminar os eritrócitos e hepatócitos remanescentes. Reúnem-se os sobrenadantes e centrifuga-se duas vezes para obter dois sedimentos celulares: 300 xg, 5 min, 4 ° C durante a sedimentação de HSC, LEC e, em parte, KC e 650 xg, 7 min, 4 ° C durante a sedimentação do restante KC. </li><li> Piscina ambos os pellets e re-suspendê-las em HBSS. Prepare um 25% e um gradiente de densidade de 50% de mistura de solução de gradiente de densidade e PBS para Centrif gradiente de densidadeugation (25% de solução de gradiente de densidade: 5 ml de solução de gradiente de densidade e 15 ml de PBS, solução de gradiente de densidade de 50%: solução de gradiente de densidade de 10 ml e 10 ml de PBS, ver Figura 2). Coloque a solução com gradiente de densidade de 25% cuidadosamente no topo da camada de solução de gradiente de densidade de 50%. </li><li> Coloque a suspensão NPC cuidadosamente e lentamente na parte superior da camada de solução de gradiente de densidade de 25% de uma forma que é conseguida uma clara separação das duas camadas. </li><li> Centrifugar a suspensão de células em gradiente de densidade a 1800 xg, 20 min, 4 ° C sem travagem (Figura 2.2). </li><li> Aspirar as células mortas e detritos celulares a partir da camada superior. A APN estão localizadas na interface entre a camada de gradiente de densidade de 25% e 50% (Figura 2). Recolhe NPC, lavá-las com HBSS e centrifugar a suspensão de células a aplicação do passo de centrifugação acima descrito dupla (passo 7.2.). </li></ol> 8. Separação de células de Kupffer (AderênciaSeparação Passo) (1 h) <ol><li> Executar uma contagem de células para o KC na fracção NPC tal como descrito na etapa 4.6. (Para aparecimento de KC em suspensão ver Figura 3B). Centrifugar a fracção NPC com o passo de centrifugação dupla acima descrito (passo 7.2) e re-suspender o NPC na Kupffer celular meio de sementeira (Tabela 2). </li><li> Semente da fracção contendo KC em vasos de cultura de células de plástico a uma densidade de 5 x 10 5 KC / cm 2. Incubam-se as culturas KC durante 20 min numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2. KC primária aderir em plásticos de cultura de células dentro de um curto período de tempo (Figura 2.3). </li><li> Recolher o sobrenadante contendo não aderiu NPC, que consiste principalmente de LEC e HSC. Reúnem-se os sobrenadantes para a separação posterior do LEC (ver secção 9) e HSC (ver secção 10). Lava-se a KC aderente com HBSS e cultivar-los em Kupffer meio de cultura celular (Tabela 2), a 37 ° C, 5% de CO2, num incubador humidificado. </li></ol> 9. Separação de Células Endoteliais (1,5 h) <ol><li> Centrifugar o sobrenadante recolhido (passo 8.5.) A 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lava-se a pelete com PBS. Após centrifugação a 300 xg, 5 min, 4 ° C, re-suspender as células em Stellate celular / meio de separação celular endotelial e executar uma contagem de células para todas as células restantes como descrito no passo 4.6. </li><li> Re-suspender a 1 x 10 7 células Mio em 1 ml Stellate Celulares / meio de separação celular endotelial, adicionar 20 ul de solução bloqueadora do MACS-Kit e 20 ul da CD31 micro esferas de imunomarcação e incubar a suspensão resultante durante 15 min a 4 ° C de temperatura (Figura 2.4). </li><li> LEC independente de HSC, tal como descrito no protocolo MANUFACTURER&#39;S para o sistema de separação de células activadas magneticamente MACS (Figura 2.5). Eluir LEC CD31-positivo magneticamente retida e suspendê-las em C StellateEll / meio de cultura de células endoteliais (Tabela 2). </li><li> Efectuar a contagem de células para LEC tal como descrito na etapa 4.6. LEC semente em uma densidade de 1,25 x 10 5 células / cm2 em vasos de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato (ver passo 6.1). Cultivar as células a 37 ° C, 5% de CO2 num incubador humidificado. </li></ol> 10. Separação de células estreladas (0,5 h) <ol><li> Unlabeled HSC passar a coluna de separação durante o procedimento MACS. Recolher a fracção HSC (veja o passo 9.5, Figura 2.5). Efectuar a contagem das células, como descrito no passo 4.6. </li><li> HSC de sementes com uma densidade de 5 x 10 4 células / cm2 em vasos de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato (ver passo 6.1) em Stellate celular / meio de cultura de células endoteliais (Tabela 2) e cultivam-los a 37 ° C, 5% CO2 numa incubadora humidif içada. </li></ol><img alt= &quot;Tabela 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tabela 1: perfusão e solução de isolamento. <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tabela 2: Cultura e isolamento de meios de comunicação.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

O protocolo publicado descreve uma técnica para isolar pura PHH e NPC, nomeadamente KC, HSC e LEC, ao mesmo tempo de alta qualidade e pureza a partir de uma mesma amostra de tecido de fígado humano. A maioria das publicações que tratam de isolamentos de células hepáticas cobrir apenas uma dessas populações de células 18-20 e procedimentos de isolamento realizados com o tecido humano são raros (revisado por Damm et al.) 21. Adaptação de métodos estabelecidos com tecido animal (por exemp...

tecido de fígado humano é altamente complexo e consiste em duas entidades diferentes de células, células parenquimatosas e células não-parenquimatosas (NPC). células parenquimatosas do fígado incluem hepatócitos e cholangiocytes. Hepatócitos representam 60 a 70% das células do fígado totais e representam a maioria das funções metabólicas no fígado, por exemplo, ácidos biliares e complementar a síntese de factor de, biotransformação e metabolismo energético 2,3. A fracção mais pequena NPC constitui 30-40% do total de células de fígado. NPC incluem diferentes populações de células, ou seja, células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e as células estreladas hepáticas (HSC). Esta fracção de células heterogénea desempenha um papel central em processos fisiológicos do fígado. Além disso, NPC participar na mediação de lesão hepática aguda, por exemplo, lesão hepática induzida por drogas (DILI), assim como em lesões hepáticas crónicas, tais como a cirrose 4. Nos últimos anos, hcélulas do fígado uman tornaram-se cada vez mais essencial na pesquisa e desenvolvimento de testes de drogas, o desenvolvimento de drogas e identificação de novos caminhos bioquímicos em doenças do fígado. Para os testes in vitro monoculturas PHH ainda são considerados como o &quot;padrão ouro&quot; 5. A principal limitação dos modelos actuais homotípicas fígado é desdiferenciação e perda de função dos hepatócitos em poucos dias 4. O estabelecimento de 3-dimensionais (3D técnicas de cultura) mostrou que estas limitações podem ser compensadas 4,6. No entanto, mesmo modernas técnicas de cultura 3D não são capazes de exibir todos os modos hepatotóxicos de ações 7. Faltando populações NPC em modelos in vitro existentes são discutidos como uma possível razão para esta discrepância com a situação in vivo. Tem sido demonstrado que a comunicação célula-célula entre as diferentes populações de células de fígado desempenha um papel central na homeostase fisiológica, mas também em pathophysiologic processa 8. Portanto, a atenção científica se concentra cada vez mais em NPC e suas interações célula-célula. Seu uso proposital em sistemas de engenharia de tecidos co-cultura e poderia ser uma solução para a elevada procura de modelos in vitro do fígado 8,9, que são o mais próximo possível da situação in vivo quanto possível. Atualmente, o principal desafio é o desenvolvimento de um modelo de co-cultura fígado humano padronizado, que contém partes claramente definidas de PHH e NPC. Em consequência, as técnicas de isolamento para as células do fígado muito heterogéneos são necessários e aqueles tem que ser optimizado para obter populações de células puras. Enquanto protocolos padronizados para isolamento PHH existem 10, o isolamento padronizado de NPC humano ainda está em desenvolvimento. Protocolos de isolamento mais NPC publicados são baseadas em experiências com células não-humanos 11,12. Apenas algumas publicações descrevem o processo de isolamento do NPC humana e mais cobrem apenasmétodos para o isolamento de um único tipo de célula 11-16. As características mais importantes de células que foram aproveitadas para a separação de células são de tamanho, densidade, o comportamento de fixação, e a expressão de proteínas de superfície. Na base destas características foi desenvolvido um protocolo simplificado para isolar PHH, KC, LEC e HSC, o qual foi publicado anteriormente em Experimental Biology and Medicine 1. Por causa do grande interesse nesta técnica, o objectivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento de células de fígado incluindo um vídeo, o que permitirá reproduzir a técnica mais facilmente. O protocolo também inclui métodos de controlo de qualidade para avaliação do rendimento e a viabilidade, bem como para a identificação e a pureza avaliação utilizando colorações imunológicas específicas.

<table><tbody><tr><td>General Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td> pipetas Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio</td><td>Eppendorf</td> microscópio Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubadora</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urine Beaker</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>seringa perfusor 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior do frasco</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Polipropileno Tubo cônico</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno Falcon 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td> pipetas sorológicas de <td>24 poços</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, ponteiras de pipeta de 5 ml</td></tr><tr><td></td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &micro; l, 200 &micro; l, 1.000 &micro; l</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento de isolamentobanho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr> bomba <tr><td>peristáltica</td> Carl <td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>circulação termostato</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>balanças finas</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; funil chner</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>funil</td><td></td><td></td><td></td>de plástico</tr> cânulas <tr><td>de tubo</td><td></td><td></td><td></td>de silicone</tr><tr><td>com pontas</td><td></td><td></td><td></td>de azeitona</tr><tr><td>fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de prato</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr><tr><td>bisturi</td><td>Pena</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>câmara de contagem Neubauer</td><td>Levantador de células de trabalho</td><td></td><td></td>óptico</tr><tr><td></td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drape</td><td>Charit&eacute; Universidade tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>compressa</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>luvas cirúrgicas estéreis</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Cola de tecido</td><td>B. Braun</td><td>Frasco de vidro 1050052</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenase P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Solução de</td> <td>separação PercollBiochrom</td><td>L6145</td><td>Densidade 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s</td><td>PBS PAA</td><td>H15 - 002</td><td>sem Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Baixa Glicose (1 g/L) (sem L-Glutamina)</td></tr> <tr><td>Solução Tampão HEPES 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>sem L-Glutamina</td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>William' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>com GlutaMAX&trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Insulina Humana</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal para bezerro (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Nome</strong</td><td>>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento para imunocoloração</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, EUA</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído 4%</td> <td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Ao lado de hepatócitos do parênquima, o fígado é composto de células não-parenquimatosas (NPC), como as células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e células estreladas hepáticas (HSC). Bidimensional (2D) de cultura de hepatócitos humanos primários (PHH) ainda é considerado como o &quot;padrão de ouro&quot; para testes in vitro do metabolismo do fármaco e hepatotoxicidade. É bem conhecido que a monocultura 2D da PHH sofre de desdiferenciação e perda de função. Recentemente, foi mostrado que NPC hepática desempenham um papel central no fígado (pato-) fisiologia e a manutenção das funções PHH. A investigação actual centra-se na reconstrução de tecidos in vivo pela arquitectura 3d- e co-cultura de modelos para ultrapassar as limitações de monoculturas 2D. Anteriormente, publicou um método para isolar células do fígado humano e investigado o uso destas células para a sua utilização em culturas de células em Biologia Experimental e Medicina 1. Com base no amplo interesse neste technique o objetivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento das células do fígado, incluindo um vídeo, o que permitirá uma fácil reprodução desta técnica. células de fígado humano foram isoladas a partir de amostras de tecido de fígado humanas de intervenções cirúrgicas por uma técnica de perfusão P EGTA / colagenase em dois passos. PHH foram separadas a partir do APN por uma centrifugação inicial a 50 x g. Densidade passos de centrifugação de gradiente foram usadas para a remoção de células mortas. populações de células de fígado individuais foram isolados a partir da fracção enriquecida NPC usando as propriedades de células específicas e os procedimentos de separação de células. Ao lado do isolamento PHH fomos capazes de separar KC, LEC e HSC para posterior cultivo. Tomados em conjunto, o protocolo apresentado permite o isolamento de PHH e NPC em alta qualidade e a quantidade de amostra de tecido de um dador. O acesso a populações de células do fígado purificados poderia permitir a criação de in vivo como li humanamodelos Ver.

A separação em uma fracção parenquimal e não-parenquimatosas, utilizando gradiente de densidade de centrifugação como um procedimento de limpeza combinada com a utilização de propriedades de aderência e MACS leva a PHH bem sucedida e isolamento NPC. PHH e NPC pode ser isolado em alta qualidade e de quantidade. A Figura 1 mostra a configuração representativa do equipamento para a perfusão do fígado e digestão. 10% de FCS foi adicionado à colagenase P contendo Perfusion - ...

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de hepatologia e toxicologia e nos oferecer a oportunidade para o desenvolvimento de novos modelos in vitro de co-cultivo e de fígado engenharizado em tecidos. A vantagem desta nova técnica é isolar todas as populações celulares hepáticas do mesmo doador e do mesmo pequeno fragmento de tecido hepático. Para iniciar este procedimento, pese o tecido hepático recém-dissecado em condições estéreis e coloque a amostra de tecido hepático na cabine de fluxo laminar.Em seguida, remova o sangue da superfície da amostra de tecido. A seguir, lave as cânulas utilizando a solução de perfusão 1X um. Use a cola para tecidos para fixar as olivas das cânulas nos vasos sanguíneos maiores.Em seguida, teste a perfusão e verifique vazamentos nas cânulas. Posteriormente, feche todos os vasos sanguíneos que apresentem vazamento de solução de perfusão 1X clara utilizando cola tecidual. Depois disso, coloque a amostra de tecido hepático cânulado no funil de Buchner.Em seguida, ajuste a taxa de fluxo da bomba peristáltica entre 7,5 e 14,6 mililitros por minuto, dependendo do número de cânulas utilizadas e da resistência do tecido hepático. Perfunda o tecido até que todo o sangue seja removido, por pelo menos 20 minutos e no máximo 30 minutos. Em alguns casos, pode ser necessário prender uma das cânulas com grampos de plástico ou aumentar a pressão interna de uma região pressionando suavemente a cápsula hepática com uma espátula, a fim de otimizar a perfusão.Uma mudança completa de cor, de vermelho acastanhado para marrom claro ou amarelo claro, indica uma boa perfusão. Em seguida, troque o fluido de perfusão pela solução digestiva contendo colagenase P. Depois, reorganize a montagem para a etapa de digestão. Posteriormente, realize um fluxo circular da solução digestiva por até 15 minutos.Interrompa periodicamente a perfusão e verifique o grau de digestão. É essencial interromper imediatamente a perfusão com a solução de digestão quando a amostra de tecido hepático estiver suficientemente digerida. Retire o fígado do dispositivo quando estiver pronto e coloque-o em uma cuba de vidro.Lave a parte externa da amostra de tecido com Solução de Parada gelada. Remova as cânulas da amostra de tecido hepático. Em seguida, use um bisturi para abrir a amostra de tecido hepático, fazendo um corte na região central onde as cânulas foram fixadas, certificando-se de que a cápsula de Glisson permaneça intacta.Enxágue o interior da amostra tecidual e, em seguida, cubra toda a amostra tecidual com a Solução Paradora. Em seguida, agite suavemente o tecido para liberar as células. Depois, colete a suspensão celular e filtre-a através de um funil com gaze em 10 tubos plásticos de 50 mililitros.Adicione mais Solução de Parada à amostra de tecido hepático até que um volume final de 500 mililitros seja atingido. Em seguida, centrifugue a suspensão celular, colete o sobrenadante para o isolamento de NPC posteriormente e reúna os pellets celulares em tubos plásticos de 250 mililitros. Posteriormente, lave os pellets celulares com PBS.Para isso, centrifugue a suspensão celular. Colete o sobrenadante, reúna os pellets e re-suspenda o pellet em meio de incubação de hepatócitos. Em seguida, determine o número de células e a viabilidade na suspensão celular resultante utilizando coloração com azul de tripano.Para isolar as células hepáticas não parenquimatosas, centrifugue o sobrenadante coletado para eliminar os eritrócitos e hepatócitos remanescentes. Colete os sobrenadantes e centrifugue-os duas vezes para obter os pellets celulares destinados à sedimentação de HCS, LEC, parte de KC e o restante de KC. Em seguida, re-suspenda os pellets em HBSS. Então, prepare um gradiente de densidade de 25% e um de 50% misturando a solução de gradiente de densidade e PBS para a centrifugação em gradiente de densidade.Coloque cuidadosamente a solução de gradiente de densidade a 25% sobre a camada de solução de gradiente de densidade a 50%. Em seguida, adicione cuidadosa e lentamente a suspensão de NPC sobre a camada de solução de gradiente de densidade a 25% para obter uma separação nítida entre as duas camadas. Centrifugue a suspensão celular no gradiente de densidade sem interrupção.Os NPC estão localizados na interfase entre as camadas do gradiente de densidade de 25% e 50%. Aspire as células mortas e os detritos celulares da camada mais superior e colete cuidadosamente a interfase. Após dupla centrifugação, realize uma contagem celular para a fração de KC e a fração de MPC.Em seguida, centrifugue a fração de PCN com o passo de dupla centrifugação previamente descrito e re-suspenda o PCN no meio de semeadura de células de Kupffer. Semee a fração contendo CK em recipientes plásticos para cultura celular numa densidade de cinco vezes 10 à 5ª CK por centímetro quadrado. Incube as culturas de CK por 20 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Os KC primários devem aderir aos plásticos de cultura celular em um curto período de tempo. Em seguida, colete o sobrenadante contendo as NPC não aderidas, constituídas principalmente por LEC e HSC. Para separar LEC de HSC, inicie com uma centrifugação do sobrenadante.Em seguida, lave o pellet com PBS. Após a segunda centrifugação, re-suspenda as células em meio de separação de células estreladas e células endoteliais e realize uma contagem celular para todas as células restantes. A seguir, re-suspenda 10 milhões de células em um mililitro de meio de separação de células estreladas e células endoteliais.Em seguida, adicione 20 microlitros da solução bloqueadora do kit MAX e 20 microlitros das microesferas CD31 para imunomarcação e incube a suspensão resultante por 15 minutos à temperatura de quatro graus Celsius. Posteriormente, separe as LEC das HSC conforme descrito no protocolo do fabricante para o sistema de separação celular ativado magneticamente max e colete a fração de HSC. Elua as LEC positivas para CD31 retidas magneticamente e suspenda-as em meio de cultura de células endoteliais de células estreladas.Aqui, essas imagens mostram as diferentes populações de células hepáticas isoladas diretamente após o processo de isolamento, na visão de microscopia de contraste de fase. Este conjunto de imagens apresenta as células isoladas e cultivadas após 24 horas de cultivo. A caracterização baseada em imunofluorescência de diferentes frações celulares é mostrada aqui.Hepatócitos humanos primários (PHH) mostraram sinais positivos para o marcador de hepatócito CK18 24 horas após o isolamento, células de Kupffer (KC) foram positivas para o marcador CD68 24 horas após o isolamento, células endoteliais sinusoidais (LEC) mostraram sinais positivos para vimentina 72 horas após o isolamento, e células estreladas hepáticas (HSC) foram positivas para GFAP 72 horas após o isolamento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um isolamento bem-sucedido depende da digestão ideal da amostra de tecido hepático. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como controlar a digestão e como realizar a separação por gradiente de densidade, que são as etapas críticas deste procedimento.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa médica explorarem funções hepáticas e doenças em culturas celulares in vitro recém-criadas e em modelos de fígado com tecido engenharizado.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Um procedimento de duas etapas de perfusão de colagenase modificado para isolamento de hepatócitos humanos é descrita. Este método também pode ser aplicado a outros fígados de mamíferos. Os hepatócitos isolados estão disponíveis em alto rendimento e viabilidade, tornando-os um modelo adequado para a investigação científica em áreas como a regeneração do fígado, farmacocinética e toxicologia.

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

O objetivo do presente protocolo é fornecer um guia passo a passo para realizar experiências em 3-d "fígado-on-a-chip" infecção com o vírus da hepatite B.

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a isolar hepatócitos humanos primários e células não-parenquimatosas do mesmo doador com alta viabilidade. Este método viabiliza modelos in vitro de co-cultura e engenharia de tecidos hepáticos para pesquisa.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

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