Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hepatologia e toxicologia e nos oferecer a oportunidade de desenvolvimento de novos modelos de co-cultura in vitro e fígado de engenharia de tecidos. A vantagem dessa nova técnica é isolar todas as populações de células hepáticas do mesmo doador e do mesmo pequeno pedaço de tecido hepático. Para iniciar este procedimento, pese o tecido hepático recém-dissecado em condições de estilo e coloque a amostra de tecido hepático na capela de fluxo de ar laminar.

Em seguida, limpe o sangue da superfície da amostra de tecido. Em seguida, lave as cânulas usando a solução de perfusão 1X um. Use a cola de tecido para fixar as azeitonas das cânulas nos vasos sanguíneos maiores.

Em seguida, teste a perfusão e verifique se há vazamentos das cânulas. Posteriormente, feche todos os vasos sanguíneos vazando solução de perfusão 1X clara com cola de tecido. Depois disso, coloque a amostra de tecido hepático canulado no funil de Buchner.

Em seguida, defina a vazão da bomba peristáltica entre 7,5 e 14,6 mililitros por minuto, dependendo do número de cânulas utilizadas e da resistência do tecido hepático. Perfundir o tecido até que todo o sangue seja eliminado por pelo menos 20 minutos e por no máximo 30 minutos. Em alguns casos, pode ser necessário pinçar uma das cânulas com pinças de plástico ou aumentar a pressão interna de uma área pressionando suavemente contra a cápsula hepática com uma espátula para otimizar a perfusão.

Uma mudança completa de cor de vermelho acastanhado para marrom claro ou amarelo claro indica uma boa perfusão. Depois, troque o fluido de perfusão por solução de digestão contendo colagenase P.Em seguida, reorganize a configuração para a etapa de digestão. Em seguida, execute um fluxo circular de solução de digestão por até 15 minutos.

Pare periodicamente a perfusão e verifique o grau de digestão. É essencial que a perfusão com solução de digestão seja interrompida imediatamente quando a amostra de tecido hepático for digerida o suficiente. Retire o fígado do dispositivo quando estiver pronto e coloque-o em um prato de vidro.

Enxágue a parte externa da amostra de tecido com solução de parada gelada. Remova as cânulas da amostra de tecido hepático. Em seguida, use um bisturi para abrir a amostra de tecido hepático incisando o meio da área onde as cânulas foram fixadas e certifique-se de que a cápsula de Glisson permaneça intacta.

Enxágue o interior da amostra de tecido e, em seguida, cubra toda a amostra de tecido com Stop Solution. Em seguida, agite o tecido suavemente para liberar as células dele. Em seguida, colete a suspensão celular e filtre-a através de um funil de gaze em 10 tubos de plástico de 50 mililitros.

Adicione mais solução Stop à amostra de tecido hepático até que um volume final de 500 mililitros seja consumido. Depois, centrifugue a suspensão celular, colete o sobrenadante para isolamento do NPC mais tarde e agrupe os pellets celulares em tubos plásticos de 250 mililitros. Em seguida, lave os pellets celulares com PBS.

Para isso, centrifugue a suspensão celular. Colete o sobrenadante, agrupe os pellets e ressuspenda o pellet em meio de incubação de hepatócitos. Em seguida, determine o número de células e a viabilidade na suspensão celular resultante usando a coloração com azul de Trypan.

Para isolar as células hepáticas não parenquimatosas, centrifugue o sobrenadante coletado para eliminar os eritrócitos e hepatócitos restantes. Colete os sobrenadantes e centrifugue-os duas vezes para obter os grânulos de células para a sedimentação de HCS, LEC, parcialmente KC e o KC restante. Em seguida, suspenda novamente os pellets no HBSS. Em seguida, prepare um gradiente de densidade de 25% e 50% misturando a solução de gradiente de densidade e PBS para centrifugação de gradiente de densidade.

Coloque a solução de gradiente de densidade de 25% cuidadosamente em cima da camada de solução de gradiente de densidade de 50%. Em seguida, coloque a suspensão NPC com cuidado e lentamente em cima da camada de solução de gradiente de densidade de 25% para obter uma separação clara de ambas as camadas. Centrifugar a suspensão celular no gradiente de densidade sem interrupção.

Os NPCs estão localizados na interfase entre as camadas de gradiente de densidade de 25% e 50%. Aspire as células mortas e os restos celulares da camada superior e recolha cuidadosamente a interfase. Após centrifugação dupla, efetue uma contagem de células para a fração KC e MPC.

Em seguida, centrifugue a fração NPC com a etapa de centrifugação dupla descrita anteriormente e ressuspenda o NPC no meio de semeadura Kupffer Cell. Semeie a fração contendo KC nos vasos de cultura de células plásticas a uma densidade de cinco vezes 10 elevado a 5º KC por centímetro quadrado. Incube as culturas KC por 20 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono.

O KC primário deve aderir aos plásticos de cultura de células em um curto período de tempo. Em seguida, colete o sobrenadante contendo o NPC não aderido, consistindo principalmente de LEC e HSC. Para separar o LEC do HSC, comece com uma centrifugação do sobrenadante.

Em seguida, lave o pellet com PBS. Após a segunda centrifugação, ressuspenda as células no meio de separação de células endoteliais de células estreladas e faça uma contagem de células para todas as células restantes. Em seguida, ressuspenda 10 milhões de células em um mililitro de meio de separação de células endoteliais de células estreladas.

Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de bloqueio do kit MAX e 20 microlitros das microesferas CD31 para imunomarcação e incube a suspensão resultante por 15 minutos a quatro graus Celsius de temperatura. Em seguida, separar o LEC do HSC conforme descrito no protocolo do fabricante para o sistema de classificação de células ativadas magneticamente max e coletar a fração HSC. Eluir o LEC CD31 positivo retido magneticamente e suspendê-lo em meio de cultura de células endoteliais de células estreladas.

Aqui, essas imagens mostram as diferentes populações de células hepáticas isoladas diretamente após o processo de isolamento na visão de microscopia de contraste de fase. Este conjunto de imagens apresenta as células isoladas e cultivadas após 24 horas de cultivo. A caracterização baseada em imunofluorescência de diferentes frações celulares é mostrada aqui.

PHH mostrou sinais positivos para o marcador de hepatócitos CK18 24 horas após o isolamento, KC foram positivos para o marcador CD68 24 horas após o isolamento, LEC mostrou sinais positivos para vimentina 72 horas após o isolamento e HSC foram positivos para GFAP 72 horas após o isolamento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um isolamento bem-sucedido depende da digestão ideal da amostra de tecido hepático. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como controlar a digestão e como realizar a separação do gradiente de densidade, que são as etapas críticas deste procedimento.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa médica explorarem funções e doenças hepáticas em culturas de células in vitro recém-criadas e modelos de fígado de engenharia de tecidos.