Name: Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda microscopia intravital para estudar interações leucócito-endoteliais e plaqueta-leucócito em veias mesentéricas de camundongos durante inflamação. Este método permite imagens em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com a lei de proteção animal Alemão (TierSchG). Os ratos foram alojados e tratados de acordo com as boas práticas animal, definidos no FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) eo corpo bem-estar animal nacional GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). O animal comitê de bem-estar, da Universidade de Freiburg, bem como as autoridades locais (Regierungspräsidium Freiburg) aprovou todas as experiências com animais. 1. Handling Animal, Preparação e indução da inflamação <ol><li> Use 4-6 semanas de idade ratos macho com uma faixa de peso de 16-20 g. Nota: Se eles os ratinhos mais velhos são mais pesados ​​ou apresentam excesso de gordura que envolve o recipiente, o que limita a observação microscópica. </li><li> Esterilizar todas as ferramentas e mesa microscópio antes da cirurgia. </li><li> Injectar 20 mg / kg de LPS (lipopolissacárido) intraperitonealmente quatro horas antes da microscopia no rato vivo para induzir uma Inflamm bacterianação. </li><li> Pré-aquecer uma solução salina a 0,9% num banho-maria a 37 ° C para humidificar a câmara de plástico e o tecido mesentério. </li><li> Anestesiar o rato com injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) imediatamente antes do procedimento de microscopia. Anestesia alternativos podem ser utilizados, por exemplo, 2% a inalação de isoflurano. Confirme anestesia adequada pela perda de resposta à estimulação reflexa (dedo do pé ou cauda pitada com pressão firme). </li><li> Depilar o abdome utilizando uma máquina de barbear e remover cabelo solto com gaze saturada com etanol 70%. </li><li> Aplicar veterinário pomada sobre os olhos do mouse para evitar a secura, sob anestesia. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Esterilizar os abdome utilizando etanol a 70%. Este método não é um método de estéril e pode ser letal no final da experiência. </li><li> Executar uma laparotomia mediana: Abra a pele abdominal usando uma pinça pequenos, curvos e uma tesoura pequena. Identificar o epivasos gastrical e abrir o peritoneu na região da linea alba, para proteger os vasos. </li><li> Aplicar algumas gotas de solução salina pré-aquecido para dentro da cavidade abdominal para manter o tecido húmido. </li><li> Etiqueta de leucócitos e plaquetas fluorescência por injecção de 50 ul de rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitalmente, tal como descrito antes 9,10. </li><li> Exteriorizar um laço de lugar ileumand-lo em uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm e certifique-se de manter o tecido úmido, aplicando a 37 ° C pré-aquecido solução salina (0,9%) a cada dois minutos. </li></ol> 3. Microscopia intravital <ol><li> Colocar o rato sob o microscópio e trazer a veia mesentério com um diâmetro de 200-300 uM no centro de visão. Escolha uma embarcação sem arredores gordura visível. </li><li> Não toque nos vasos mesentério evitando assim a estimulação do endotélio. Pega o loop íleo cautela. </li><li> Visualize interações celulares do endotélio sanguecom um microscópio invertido ou vertical e uma câmera usando um software de microscópio. Grave sangue interações celulares do endotélio para 1 min em 4 veias diferentes por mouse. </li><li> Eutanásia o rato por luxação cervical após a conclusão de experiências de imagiologia. </li></ol> 4. Análise <ol><li> Realizar a análise off-line e cego para todos os parâmetros. Realizar análise usando qualquer programa de software adequado. </li><li> Confirme condições estáveis ​​e interindividually comparáveis ​​fluxo sanguíneo em alta resolução tempo cine-clips (taxa de quadros máxima) com foco no fluxo de glóbulos intraluminal. </li><li> Quantificar o número de leucócitos de rolamento. Therefor desenhar uma linha vertical através da veia e contar todos os leucócitos atravessam esta linha em 1 min. </li><li> Determinar a velocidade de rolamento através da medição do tempo de um único leucócitos tem de passar por uma distância de 50 mm, enquanto estavelmente rolando sobre o endotélio. Para fazer isso, desenhe duas linhas verticais em uma distância de 50 mm ttravés da veia. <ol><li> Medir o tempo de um representante de leucócitos deve começar a partir de uma linha para a other.Calculate a velocidade dos leucócitos dividindo-se 50 mm através do tempo necessário (mm / s). </li></ol></li><li> Medir a adesão de leucócitos em um campo de 0,04 mm2. Para fazer isso, desenhar um quadrado com o comprimento de 200 um lado para dentro da veia. <ol><li> Conte os leucócitos aderentes firmes, definidos como nenhum movimento visível durante 30 segundos, dentro deste quadrado. </li></ol></li><li> Contar o número de plaquetas ligadas a um dos leucócitos para quantificar interacções plaquetas-leucócitos. </li></ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
<li>Chauhan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13%3A+a+new+link+between+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, descrevemos a preparação e realização de microscopia intravital das veias mesentério de ratos in vivo. Este método nos dá a oportunidade de observar as interações leucócito-endotélio e plaquetas-endotélio 11 diretamente no organismo vivo. Como uma resposta rápida a inflamação do endotélio é ativado e interage com leucócitos e plaquetas, resultando em rolamento, adesão e transmigração 12. Mas também os leucócitos interagem com plaquetas formando os chamado...

O objectivo deste protocolo é descrever uma técnica simplificada de microscopia intravital das veias mesentério em ratos vivos para observação direta da interação leucócito-endotélio e leucócitos-plaquetas em condições inflamatórias. Microscopia intravital foi desenvolvido para estudar as interacções leucócito-endotélio in vivo sob condições inflamatórias 1,2, o que não é trivial, mas importante para compreender o recrutamento de leucócitos inflamatórios e função. O método que nós descrevemos nesse protocolo foi desenvolvido com base em publicações anteriormente publicados. Semelhante a visualização de incorporação de plaquetas num trombo crescente 3 e em paralelo com o que foi anteriormente publicado 4, uma veia mesentério exteriorizada é examinada por microscopia de luz transmitida. Existem vários outros modelos de microscopia intra-vital, como o músculo cremaster de ratos 5 ou fígado de rato e ratos 6. Microscopia intravital da veia mesentério foi desenvolvido e aplicado em estudos anteriores por vários grupos. Temos usado essa técnica para observar diferenças no recrutamento de leucócitos entre camundongos selvagens e hydroxylase1 triptofano (TPH1) - / - ratos, que são deficientes de serotonina não-neuronal e compararam os resultados aos camundongos cujos serotonina de plaquetas foi farmacologicamente esgotados por longo prazo aplicação a um inibidor seletivo da recaptação da serotonina fluoxetina 7. Examinamos, também, interações leucócito-endotélio após o tratamento com fluoxetina aguda 8. Neste protocolo nos concentramos em microscopia intravital das veias mesentério, porque este modelo pode ser realizada rapidamente, e permite medições válidas de interação leucócito-endotélio e plaquetas-leucócitos. Isto é muito mais difícil e em microscopia intravital de outros órgãos, tais como o osso, fígado, pele, músculo cremaster ou demorada. O modo del descrito aqui é ideal para a avaliação reprodutível de interacção célula-célula inflamatória após challengeing-o com um estímulo inflamatório, tal como a injecção intraperitoneal de lipopolissacarídeos.

<table><tbody><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de Escherichia coli 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

interações intravital microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial veias ratos

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Microscopia intravital é um método que pode ser usado para investigar processos diferentes em regiões diferentes e vasos em animais vivos. Neste protocolo, descrevemos microscopia intravital das veias mesentério. Esta pode ser realizada num curto período de tempo com resultados reprodutíveis mostrando interacções leucócito-endotélio in vivo. Nós descrevemos um ambiente inflamatório após LPS desafio do endotélio. Mas neste modelo pode-se aplicar muitos tipos diferentes de condições inflamatórias, como bactérias, química ou biológica e investigar a administração de drogas e seus efeitos diretos sobre o animal vivo e seu impacto sobre o recrutamento de leucócitos. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de diferentes tratamentos dos ratos e dos seus efeitos sobre a resposta inflamatória nos vasos. Descrevemos a visualização de leucócitos e plaquetas por fluorescência rotulando-os com rodamina 6G. Além disso, qualquer imagem específica pode ser PErformed usando moléculas fluorescente etiquetado alvejados.

Uma visão geral da configuração experimental descrito neste protocolo é demonstrado na Figura 1. Ela mostra um rato com um íleo-ciclo exteriorizado e seus navios, o que pode ser observado em microscopia intravital. A Figura 2 mostra certo grau de activação em animais não tratados devido a o procedimento em si. Mas não há quase nenhum rolamento lenta ou adesão firme dos leucócitos em comparação com os ratinhos tratados com LPS. A Figura 2 também mostra os diferentes resu...

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar as interações entre leucócitos, células endoteliais e plaquetas durante a inflamação in vivo. Isso é realizado primeiramente pré-tratando um camundongo com as substâncias de interesse e marcando as células sanguíneas; um alça de íleo e os vasos mesentéricos correspondentes são então exteriorizados, e as interações celulares STO que ocorrem dentro de uma veia mesentérica selecionada são visualizadas por microscopia intravital. Em última análise, as interações entre os leucócitos e as plaquetas com as células endoteliais ou entre si podem ser analisadas.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da inflamação, como quais tipos de interações leucócito-endoteliais ou plaquetas-leucócitos ocorrem in vivo durante diferentes modelos de inflamação ou após diferentes pré-tratamentos de interesse. Quatro horas antes da imagem intra-vital, injete 20 miligramas por quilograma de LPS IP em um camundongo macho de 16 a 20 gramas, com quatro a seis semanas de idade, para induzir a resposta inflamatória bacteriana simulada. Neste momento, pré-aqueça uma solução salina a 0,9% em banho-maria a 37 graus Celsius para umedecer a câmara de

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Neste vídeo, demonstramos a visualização em tempo real das interações entre células sanguíneas e endoteliais nas veias mesentéricas de um modelo de camundongo injetado intraperitonealmente com lipopolissacarídeo.

Microscopia intravital para analisar as interações células sanguíneas-endoteliais em um modelo de camundongo com inflamação

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Este protocolo apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão mesentérica e visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) em vênulas mesentéricas usando microscopia intravital. O fluxo sanguíneo na artéria mesentérica superior foi restrito por 1 h, seguido de reperfusão, permitindo a quantificação direta da adesão leucocitária e da NETose.

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Uma técnica para a realização de microscopia intravital do linfonodo inguinal (LN) é descrito. Tal técnica permite em tempo...

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Aprenda microscopia intravital para estudar interações leucócito-endoteliais e plaqueta-leucócito em veias mesentéricas de camundongos durante inflamação. Este método permite imagens em tempo real.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Explorar mais vídeos