Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

O objetivo geral deste procedimento é investigar as interações leucocitárias, endoteliais e plaquetárias durante a inflamação in vivo. Isso é feito primeiro pré-tratando, um camundongo com as substâncias de interesse e rotulando as células sanguíneas como uma alça de íleo, e os vasos mesórios que o acompanham são então exteriorizados e as interações das células STO que ocorrem dentro de uma veia mesenta selecionada são visualizadas por microscopia intravital. Em última análise, as interações entre os leucócitos e as plaquetas com o endotélio ou entre si podem ser analisadas.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação, como que tipos de interações leucocitárias endoteliais ou plaquetárias ocorrem in vivo durante diferentes modelos de inflamação ou após diferentes pré-tratamentos de interesse. Quatro horas antes da imagem intravital, injete 20 miligramas por quilograma de LPS IP em um camundongo macho de 16 a 20 gramas, com quatro a seis semanas de idade, para induzir a resposta inflamatória bacteriana simulada. Pré-aqueça uma solução salina a 0,9% em banho-maria a 37 graus Celsius para umidificar a câmara de plástico e o tecido mesório também neste momento.

Em seguida, confirme a profundidade apropriada da anestesia por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no camundongo tratado com LPS e, em seguida, aplique pomada no tamanho do animal, dete o abdômen com um barbeador, removendo qualquer cabelo solto com gaze embebida em etanol 70%. Em seguida, use uma pequena pinça curva e uma tesoura para abrir o abdômen, identificar os vasos epigástricos e abrir o peritônio na região alba linear para proteger os vasos. Aplique algumas gotas de solução salina pré-quente na cavidade abdominal para manter o tecido úmido, seguido por uma injeção retroorbital de 50 microlitros de bastonete Domine seis G para marcar as células sanguíneas circulantes.

Em seguida, coloque o camundongo em uma placa de Petri de 10 centímetros, exteriorize uma alça de ílio e administre a solução salina pré-aquecida a cada dois minutos para manter o tecido úmido. Para visualizar a resposta inflamatória por microscopia intravital, coloque o camundongo embaixo do microscópio e traga uma veia mesérmica com diâmetro de 200 a 300 micrômetros e o mínimo possível de gordura circundante visível para o campo de visão. Usando o software de microscópio apropriado.

Registre as interações endoteliais das células sanguíneas por um minuto em quatro veias diferentes por camundongo. Em seguida, analise as respostas célula a célula para confirmar a estabilidade e inserir individualmente as condições de fluxo sanguíneo. Para quantificar o número de leucócitos rolantes, desenhe uma linha vertical através da veia e conte manualmente todos os leucócitos que cruzam essa linha em um minuto.

Para determinar a velocidade de rolamento, desenhe duas linhas verticais através da veia a 50 micrômetros de distância e meça o tempo que um único leucócito leva para cruzar entre as linhas enquanto rola de forma estável no endotélio. Para medir a adesão leucocitária, desenhe um quadrado de 200 por 200 micrômetros na veia. Em seguida, conte manualmente os leucócitos firmemente aderentes que exibem nenhum movimento visível dentro do quadrado por 30 segundos.

Finalmente, para quantificar as interações dos leucócitos plaquetários, conte manualmente o número de plaquetas ligadas a um leucócito. Embora haja um certo grau de ativação em animais não tratados devido ao procedimento em si, quase não há rolamento lento ou adesão firme de leucócitos não tratados. De fato, um número maior de leucócitos rolantes e aderentes é observado com uma diminuição na velocidade de rolamento das células sanguíneas circulantes em camundongos desafiados com LPS.

Neste experimento, a microscopia intravital foi realizada sem desafio adicional com LPS imediatamente após o tratamento intraperitoneal agudo com fluoxetina. Observe que o maior número de leucócitos firmemente aderentes e as velocidades de rolamento mais baixas nos animais tratados com fluoxetina indicam uma influência do tratamento agudo com fluoxetina nas interações endoteliais leucocitárias. Além disso, como observado nesta imagem representativa das interações dos leucócitos plaquetários com uma veia mesentérica durante a peritonite induzida por LPS, pode-se observar uma combinação das plaquetas ao redor dos leucócitos, bem como as interações desses complexos com a parede do vaso.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a microscopia inal para investigar as interações endoteliais de leucócitos e leucócitos plaquetários.