Name: Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Leer intravitale microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten interacties in mesenteriale venen van muizen. Deze methode maakt real-time beeldvorming van inflammatoire processen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenbescherming recht (TierSchG). De muizen werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met de goede praktijken dier, zoals gedefinieerd door FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) en de nationale dierenwelzijn lichaam GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Het dierenwelzijn commissie van de universiteit van Freiburg, evenals de lokale overheden (Regierungspräsidium Freiburg) goedgekeurd alle dierproeven. 1. Dierlijke Handling, Voorbereiding en inductie van de ontsteking <ol><li> Gebruik 4-6 weken oude mannelijke muizen met een gewicht bereik van 16 - 20 g. Opmerking: Als de muizen ouder of zwaarder ze aanwezig overtollig vet rond het vat, het beperken van de microscopische observatie. </li><li> Steriliseren alle gereedschappen en microscoop tafel voorafgaand aan de operatie. </li><li> Injecteer 20 mg / kg LPS (lipopolysaccharide) intraperitoneaal 4 uur voorafgaand aan microscopie in het levende muis een bacteriële Inflamm inducerenatie. </li><li> Voorverwarmen een 0,9% zoutoplossing in een waterbad bij 37 ° C om de plastic kamer en het mesenterium weefsel bevochtigen. </li><li> Verdoven de muis met intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) direct voor de procedure microscopie. Alternatieve anesthesie worden gebruikt, bijvoorbeeld 2% isofluraan inhalatie. Bevestig de juiste verdoving door het verlies van respons op reflex stimulatie (teen of staart knijpen met stevige druk). </li><li> Ontharen de buik met een scheerapparaat en verwijder losse haren met gaas verzadigd met ethanol 70%. </li><li> Breng vet zalf op de ogen van de muis tot droog te voorkomen, terwijl onder narcose. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Steriliseer de buik middels 70% ethanol. Deze methode is geen steriel werkwijze en dodelijk eind van het experiment zijn. </li><li> Voer een mediane laparotomie: Open de buikhuid met behulp van kleine, gebogen pincet en een klein schaartje. Identificeer de epigastrical schepen en open het peritoneum in het gebied van de linea alba, om de vaten te beschermen. </li><li> Breng enkele druppels voorverwarmde zoutoplossing in de buikholte om het weefsel vochtig. </li><li> Label leukocyten en bloedplaatjes fluorescent door het injecteren van 50 gl rhodamine 6G (1 mg / ml) retro-orbitaal zoals eerder beschreven 9,10. </li><li> Exterioriseren een lus van ileumand plaats het in een petrischaal met een diameter van 10 cm en zorg ervoor dat het weefsel vochtig te houden door toepassing van de 37 ° C voorverwarmde zoutoplossing (0,9%) om de andere minuut. </li></ol> 3. Intravitale Microscopie <ol><li> Plaats de muis onder de microscoop en breng het mesenterium ader met een diameter van 200-300 urn in het midden van weergave. Kies een schip zonder zichtbare vet omgeving. </li><li> Laat het mesenterium vaten waardoor stimulatie van het endotheel te vermijden niet aanraken. Behandel de ileum loop voorzichtig. </li><li> Visualiseer bloedcel-endotheel interactiesmet een omgekeerde of rechtop microscoop en een camera met behulp van een microscoop software. Neem bloedcel-endotheliale interacties 1 min bij 4 verschillende aders per muis. </li><li> Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie na de voltooiing van plaatsbepalingen. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Voer de analyse offline en verblind voor alle parameters. Uit te voeren analyse met behulp van een geschikte software-programma. </li><li> Bevestig stabiel en interindividually vergelijkbare bloedstroom omstandigheden in hoog tijd-resolutie cine-clips (maximale frame rate) gericht op intraluminale bloedcellen flow. </li><li> Kwantificeren van het aantal rollende leukocyten. Daarom trek een verticale lijn door de ader en tel alle leukocyten oversteken deze lijn in 1 min. </li><li> Bepaal rolsnelheid door meting van de tijd één leukocyt nodig heeft om een ​​afstand van 50 micrometer passeren, terwijl stabiel rollen op endotheel. Om dit te doen, trek twee verticale lijnen op een afstand van 50 pm through de ader. <ol><li> Meet de tijd een vertegenwoordiger leukocyten nodig heeft om van de ene lijn naar de other.Calculate de snelheid van de leukocyten door het verdelen van 50 pm door de tijd die nodig is (um / s). </li></ol></li><li> Meet leukocyt adhesie op een gebied van 0,04 mm 2. Om dit te doen, trek een vierkant met de zijkant lengte van 200 urn in de ader. <ol><li> Tel de firma aanhangend leukocyten, gedefinieerd als geen zichtbare beweging voor 30 sec, binnen dit plein. </li></ol></li><li> Tel het aantal bloedplaatjes gebonden aan een leukocyt bloedplaatjes-leukocyt interacties te kwantificeren. </li></ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
<li>Chauhan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13%3A+a+new+link+between+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin beschrijven we de voorbereiding en uitvoering van intravitale microscopie van mesenterium aderen van muizen in vivo. Deze methode geeft ons de mogelijkheid om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-endotheel interacties 11 direct waar te nemen in het levende organisme. Als een vroege reactie op het endotheel ontsteking wordt geactiveerd en interageert met leukocyten en bloedplaatjes resulteert in rollen, adhesie en transmigratie 12. Maar leukocyten ook in...

Het doel van dit protocol is een vereenvoudigde methode van intravitale microscopie van mesenterium aderen beschrijven levende muizen directe observatie van leukocyt-endotheel leukocyt en bloedplaatjes interacties onder ontstekingsaandoeningen. Intravitale microscopie werd ontwikkeld om leukocyt-endotheel interacties in vivo te bestuderen onder ontstekingsaandoeningen 1,2, wat niet triviaal, maar belangrijk voor het begrijpen van inflammatoire leukocyten rekrutering en functie. De werkwijze beschrijven we in dit protocol is ontwikkeld op basis van eerder gepubliceerde publicaties. Soortgelijke visualiseren bloedplaatjes bijmenging in een groeiende trombus 3 en parallel aan wat eerder is gepubliceerd 4, een geëxterioriseerde mesenterium ader wordt onderzocht door doorvallend licht microscopie. Er zijn diverse andere modellen van intra-vitale microscopie zoals de cremaster spier van ratten 5 of lever van muizen en ratten 6. Intravitale microscopie van mesenterium ader is ontwikkeld en in eerdere studies toegepast door verscheidene groepen. We hebben deze techniek gebruikt om de verschillen in de rekrutering van leukocyten tussen wild type muizen en tryptofaan hydroxylase1 (Tph1) te observeren - / - muizen, die een tekort van niet-neuronale serotonine en vergeleken de resultaten met muizen waarvan de plaatjes serotonine werd farmacologisch uitgeput door de lange termijn zijn de toepassing van de selectieve serotonine heropname remmers fluoxetine 7. We hebben ook onderzocht leukocyten-endotheel interacties na de acute behandeling met fluoxetine 8. In dit protocol richten we ons op intravitale microscopie van mesenterium aders, omdat dit model snel kan worden uitgevoerd en maakt valide metingen van leukocyt-endotheel en bloedplaatjes-leukocyt interacties. Dit is veel moeilijker en tijdrovender in intravitale microscopie van andere organen, zoals bot, lever, huid of spier cremaster. The model beschreven ideaal voor reproduceerbare beoordeling van inflammatoire interactie cel-cel na challengeing met een inflammatoire stimulus, zoals intraperitoneale injectie van lipopolysaccharide.

<table><tbody><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides uit Escherichia coli 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

intravitale microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten interactions in mesenteriale veins in muizen

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravitale microscopie is een werkwijze die kan worden gebruikt om verschillende processen in verschillende regio&#39;s en schepen in levende dieren te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we intravitale microscopie van mesenterium aderen. Dit kan worden uitgevoerd in een korte tijd met reproduceerbare resultaten tonen leukocyt-endotheel interacties in vivo. We beschrijven een inflammatoire instelling na LPS uitdaging van het endotheel. Maar in dit model kan men veel verschillende soorten van toepassing van inflammatoire aandoeningen, zoals bacteriële, chemische of biologische en onderzoek de toediening van geneesmiddelen en hun directe effecten op het leven van dieren en de impact ervan op leukocyten werving. Dit protocol is met succes toegepast op een aantal verschillende behandelingen muizen en hun effect op ontstekingsreactie in vaten. Hierin beschrijven we de visualisatie van leukocyten en bloedplaatjes door fluorescent labelen die met rhodamine 6G. Bovendien kan een specifieke pe beeldvorming zijnrformed met behulp van gericht fluorescerend gemerkte moleculen.

Een overzicht van de experimentele instelling in dit protocol beschreven in figuur 1. Het toont een muis met een geëxterioriseerde ileum-lus en de vaten, die worden waargenomen in opklaren. Figuur 2 toont zekere activatie in onbehandelde dieren wegens de procedure zelf. Er is bijna geen langzame walsen of stevige adhesie van leukocyten vergeleken met LPS behandelde muizen. Figuur 2 bevat eveneens de resultaten van intravitale microscopie in wildtype muizen hetzij behand...

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Het algemene doel van deze procedure is om de interacties tussen leukocyten, endotheelcellen en bloedplaatjes tijdens in vivo inflammatie te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een muis voor te behandelen met de betreffende stoffen en de bloedcellen te labelen; vervolgens worden een ileumlus en de bijbehorende mesenteriale vaten geëxterioriseerd, waarna de interacties tussen de cellen die plaatsvinden binnen een geselecteerde mesenteriale vene worden gevisualiseerd met intravitale microscopie. Uiteindelijk kunnen de interacties tussen de leukocyten en de bloedplaatjes met het endotheel of met elkaar worden geanalyseerd.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van inflammatie, zoals welke soorten interacties tussen leukocyten en endotheel, of tussen bloedplaatjes en leukocyten in vivo optreden tijdens verschillende inflammatiemodellen of na diverse relevante voorbehandelingen. Injecteer vier uur voor de intravitale beeldvorming 20 mg/kg LPS IP in een mannelijke muis van 16 tot 20 g en vier tot zes weken oud om de mock bacteriële ontstekingsreactie op te wekken. Verwarm op dit moment ook een 0,9% zoutoplossing voor in een waterbad van 37 °C om d

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Dit protocol presenteert een methode voor het induceren van mesenteriale ischemie-reperfusieschade en het visualiseren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in mesenteriale venulen met behulp van intravitale microscopie. De bloedstroom in de superieure mesenteriale slagader werd gedurende 1 uur beperkt, gevolgd door reperfusie, waardoor directe kwantificering van leukocytenadhesie en NETosis mogelijk was.

Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

Een techniek voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de lies lymfeklier (LN) is geschetst. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk voor...

Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

Leer intravitale microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten interacties in mesenteriale venen van muizen. Deze methode maakt real-time beeldvorming van inflammatoire processen mogelijk.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Meer video's verkennen