Name: Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a criar andaimes poliméricos com liberação controlada de biomoléculas usando fibras de complexação polieletrólito interfacial. Este método permite entrega sustentada para engenharia de tecidos.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura administrado por um dos seus centros de investigação de excelência, o Instituto mechanobiology, Cingapura. MFAC é apoiada pela Agência da Ciência, Tecnologia e Pesquisa (Singapura) e Agência Nacional de Investigação (França) programa conjunto com o número 1122703037. BKKT projeto é apoiado pelo Instituto mechanobiology. Agradecemos ao Sr. Daniel HC Wong para o manuscrito e Ms. Amanhecer JH Neo para auxiliar na produção de vídeo de leitura de prova.

1. Preparação de Soluções de polielectrólito <ol><li> Purifica-se o quitosano, conforme detalhado na Liao et ai. Resumidamente, criar uma solução a 1% de quitosano em 2% (w / v) (v / v) de ácido acético e de vácuo filtro usando papel de filtro de grau 93. Neutraliza-se o filtrado utilizando NaOH 5M até que o pH estabilizou a 7. Centrifugar o quitosano precipitado a 1.200 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante e adicionar água desionizada para lavar o quitosano. Repetir o passo de lavagem e centrifugação mais duas vezes. Congelar a quitosana precipitado a -80 ° C e liofilizar O / N para se obter a forma purificada. Armazenar quitosana purificada num armário desumidificado. </li><li> Pesar 1 g de quitosana purificada em um estéril de cultura de tecidos prato. Coloque a quitosana no prato de cultura de tecidos tão perto quanto possível a luz UV na câmara de segurança biológica e expor à luz UV durante 15 min. Utilizando uma pinça estéril, colocar a quitosana esterilizado em um recipiente de vidro. Dissolver quitosana usando filtrada 0.15M de ácido acético até uma concentração final entre 0,5% e 1% (w / v). </li><li> Pesar 0,1 g de sal de sódio do ácido algínico e dissolver em 10 mL de água desionizada (DDI) de água destilada para se obter um 1% (w / v) de solução. Misturar o sal de sódio do ácido algínico, durante pelo menos 2 horas no misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Filtra-se a solução de alginato através de filtro de seringa de 0,2 um. Guardar a solução de alginato a 4 ° C. </li><li> Reconstituir factores de crescimento recombinantes humanas tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou beta - fator de crescimento neural (NGF), como recomendado pelo fabricante. </li></ol> 2. Desenho de Fibras IPC <ol><li> Misturar proteínas, factores de crescimento ou outras biomoléculas em 10-20 ul alíquota da solução de polielectrólito que tem uma carga global semelhante. Moléculas biológicas com carga negativa (por exemplo, soro albumina bovina [BSA]) líquido deve ser misturado com solução de alginato. As moléculas biológicas com carga positiva (por exemplo, VEGF) deve ser misturado comsolução de quitosano. </li><li> Coloque pequenas aliquotas (10-20 ul) de quitosana e alginato sobre uma superfície plana e estável que é coberta com parafilme. As gotas de alginato de chitosano e deve ser colocado em estreita proximidade, mas não estão em contacto uns com os outros. </li><li> Levemente mergulhe cada ponta em um par de fórceps nas gotículas de quitosana e alginato. Traga as gotas de polieletrólitos em conjunto por beliscar a pinça. Quando as gotículas entram em contacto uns com os outros, lentamente puxar a pinça na vertical para cima, para chamar a fibra IPC a partir da interface das duas gotas (Figura 1A). </li><li> Com cuidado, coloque a extremidade da fibra desenhada IPC sobre a pinça sobre um coletor, como um andaime polimérico plano aposta em um mandril rotativo (consulte a secção 3 e 4). Rodar o mandril a uma velocidade constante de 10 mm / s para permitir a formação de fibras uniforme e beadless IPC. Aumentando a velocidade de desenho das fibras IPC irá formar grânulos, que irá causar uma libertação brusca de incorporadaterminação de fibra bioquímica e prematura. 10 </li><li> Para determinar a eficiência de incorporação, recolher todos os líquidos remanescentes deixado no parafilme por diluição com 500 mL de 1X tampão fosfato salino (PBS). Medir o teor de proteína com factor de crescimento ou no resíduo através de ensaio BCA (para BSA), ELISA (para o VEGF e o NGF) ou um ensaio adequado para detectar biomolécula incorporada. </li></ol> 3. Fabricação de Composite Hidrogel Andaime de pululano-dextrano (PD) polissacarídeo e Fibras IPC <ol><li> Fabricando quadro pululano sacrificial para a coleta de fibra IPC <ol><li> Pesar pululano polissacárido e misturar com água desionizada destilada (DDI) de água para criar uma 20% (w / v) de solução aquosa. Misturar a solução de pululano O / N para assegurar a homogeneidade. </li><li> De molde 15 g de uma solução de pululano em de 10 cm de diâmetro de poliestireno de cultura de tecidos (TCPS) prato. Seca-se a solução de pululano O / N a 37 ° C. Corte os filmes de pululano em 7mm x 7 milímetros quadros quadrados. </li></ol></li><li> Preparar solução de polissacárido pululano-dextrano <ol><li> Criar uma solução a 30% dos polissacáridos de pululano e dextrano (w / v) (3: 1) em água DDI. Misturar O / N para assegurar a homogeneidade da solução de polissacárido. Adiciona-se lentamente em bicarbonato de sódio à solução de polissacárido para atingir uma concentração final de 20% (w / v). Misturar O / N para assegurar a homogeneidade da solução. Guardar a solução de polissacárido, a 4 ° C. </li></ol></li><li> Coletando fibras IPC no quadro pululano <ol><li> Apor a moldura pululano sacrificial (ponto 3.1) usando um jacaré. Furar o jacaré e estrutura pululano no final do mandril rotativo usando fita adesiva revestida de plástico. Rodar o mandril com o quadro afixada a uma velocidade constante de 10 mm / seg. O quadro de pululano pode ser afixada sobre o mandril em rotação em orientações desejadas. </li></ol></li><li> Desenhe as fibras IPC usando um par de fórceps (seção 1) e attach, a fim de as fibras desenhada IPC sobre a armação rotativa pululano. Desenhe as fibras IPC a uma velocidade constante. Ao alcançar a extremidade terminal da fibra IPC, secar o construto fibras ó-em-quadro / N à temperatura ambiente. </li><li> Incorporação fibras IPC em PD hidrogel andaime </li><li> Para reticular cada grama de solução de pululano-dextrano, adicionar 100 ul de 11% (w / v), trimetafosfato de sódio e solução aquosa de hidróxido de sódio 10M 100 ul. 7 Misture a solução a 60 rpm usando um stirplate para 1 a 2 min. Após a adição de trimetafosfato de sódio e hidróxido de sódio, a solução de polissacárido vai reticular quase imediatamente. Despeje a solução de polissacarídeo viscoso para a construção de fibras-on-frame para incorporar totalmente as fibras do IPC. Incubar as fibras de pululano-dextrano combinado IPC (IPC-PD), a 60 ° C durante 30 minutos para formar um andaimes compostos quimicamente reticulados (Figura 1B). </li><li> CUIDADO: Execute o passo 3.3.2 no exaustor e utilizar equi proteção adequadovolvimento como o ácido acético é um corrosivo e inflamável. </li><li> Para induzir a formação de poros no andaime PD-CIP, submergir todo o andaime em 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min. </li><li> Remover os reagentes que não reagiram por lavagem andaimes PD-CIP em 1X PBS durante 5 min, agitando a 100 rpm. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Retire o excesso de PBS e congelar imediatamente os andaimes PD-IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar os andaimes, pelo menos, 24 horas antes da utilização em quaisquer ensaios de libertação ou de bioatividade controladas. </li></ol> 4. Fabricação de Composite Andaime de PCL e Fibras IPC CUIDADO: Diclorometano é um material perigoso. Use a coifa e equipamentos de proteção individual ao manusear diclorometano. <ol><li> Criação de substratos PDMS puras e padronizadas <ol><li> Criar um polidimetilsiloxano intocada (PDMS) substrato elastomérico usando um pedaço de TCPS de dimensão desejada usando o processo de litografia macia. Criar pattePDMS rned substratos, usando métodos padrão suaves litográficas de poli (metacrilato de metilo) moldes com a topografia desejada. 12 </li></ol></li><li> Confecção de sacrifício PCL quadro para a recolha de fibra IPC <ol><li> Pesar PCL e dissolver em diclorometano, para se criar um 0,9% (w / v) de solução. Para cada 1 cm2 de área do substrato PDMS, gota a 500 ul de solução a 0,9% de PCL. Permitir que todo o solvente se evapore completamente diclorometano, na hotte. Repetir o processo de fundição 0,9% de PCL para engrossar a película com a espessura desejada. Remover a película de PCL seca a partir do substrato de PDMS. Criar um buraco no PCL quadro usando um perfurador de dimensões adequadas. 2 </li></ol></li><li> Coletando fibras IPC na armação PCL <ol><li> Apor a moldura PCL sacrificial com furo (de 4.2.1) em um jacaré. Furar o jacaré para o mandril rotativo usando fita adesiva revestida de plástico. Fixe a extremidade da fibra desenhada IPC para o fram PCLe antes de iniciar a rotação a uma velocidade constante de 10 mm / sec (seção 2). Após o final do estiramento de fibra IPC, secar a fibra-a-quadro constructo O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incorporação de fibra-on-frame construção em substrato PCL modelado <ol><li> Gota a 500 ul de solução a 0,9% de PCL sobre o substrato PDMS para criar uma base de PCL ou modelado como novo, como necessário. Fundido múltiplas camadas de uma solução de PCL 0,9% para se obter um andaime com a espessura desejada. Permitir que todo o solvente se evapore completamente diclorometano, na hotte. </li><li> Coloque a construção de fibra-a-quadro (secção 4.3.1) na parte superior da base de PCL. Adicionar solução de 0,9% de PCL sobre os vários tempos de fibra-a-quadro construir para obter a espessura desejada e incorporar totalmente as fibras IPC, fabricando um andaime composta IPC-PCL (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 5. Medição da disseminação de agentes biológicos a partir Composite IPC Andaimes <ol><li> Coloque compósito PD-IPC ouAndaimes PCL-IPC e stand-alone fibras IPC separadamente em uma placa de 24 poços. </li><li> Mergulhe o andaime e stand-alone fibras IPC com 500 mL de 1X PBS. Incubar as amostras a 37 ° C. Recolhe PBS a vários pontos de tempo (libertação media) e substituir com 500 ul de PBS 1X. </li><li> Medir a quantidade de proteína ou de factor de crescimento nos meios de libertação utilizando um ensaio BCA (BSA), ELISA (VEGF e NGF) ou outro teste adequado para calcular o perfil de libertação cumulativa para a biomolécula incorporada. </li></ol> 6. Sementeira de Células no Composite IPC Andaimes para testar Bioatividade de Agentes Biológicos Lançado <ol><li> Esterilizar os scaffolds compostos PD-IPC ou PCL-IPC liofilizados utilizando luz UV na cabine de segurança biológica por pelo menos 20 min. </li><li> Utilizar técnicas padrão de cultura de células para se obter uma suspensão de células de 2 x 10 5 células em 200 ul de meio de crescimento. Semente da suspensão de células concentradas sobre os scaffolds compostos. After 20 min, top-up o volume de meio de crescimento para submergir completamente os andaimes. </li><li> Medir a atividade das células através de técnicas convencionais, tais como ensaio de actividade Alamar azul metabólica, ensaio excrescência de neurites PC12 ou imunofluorescência. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

IPC fibras são formados pela interacção de dois polielectrólitos de cargas opostas. O processo utiliza a extracção do complexo a partir da interface de os polielectrólitos, facilitar um processo de auto-montagem para a formação da fibra estável. O mecanismo de formação da fibra IPC assegura que qualquer biomolécula adicionados a um polielectrólito de forma semelhante carregada pode ser incorporado durante o processo de complexação. 10,11 Inversamente, a adição de uma biomolécula para o polielectrólito de carg...

A matriz extracelular tem pistas bioquímicas e biofísicas inerentes que direcionam o comportamento celular. Imitar esse microambiente fisiológico tridimensional (3D) é uma estratégia amplamente explorada para aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Por exemplo, substratos de origem natural e sintéticos foram modificados com pistas topográficas como um meio de imitar o ambiente celular biofísico. 1 Por exemplo, andaimes de policaprolactona (PCL) podem ser facilmente padronizados por fundição em substratos PDMS padronizados. 2 No entanto, a maioria dos andaimes sintéticos recapitula inadequadamente o ambiente bioquímico controlado in vivo. A modificação em massa ou na superfície de materiais sintéticos apresenta apenas pistas bioquímicas para a fixação celular, mas ainda carece de regulação temporal da entrega bioquímica. 3 Assim, há necessidade de andaimes ideais que possam imitar o sistema de entrega bioquímica regulado temporalmente da matriz extracelular. 
Os sistemas de entrega bioquímica, como as microesferas, são atormentados por problemas de perda de bioatividade e baixa eficiência de incorporação devido à gravidade e complexidade do processo de síntese em várias etapas. 4-6 Métodos alternativos que usam um método de fabricação e incorporação em uma etapa provaram ter excelente potencial para criar um microambiente bioquímico favorável sem a ineficiência na incorporação e perda de bioatividade. Uma solução viável é o uso de fibras de complexação polieletrolítica interfacial (IPC) para fornecer e proteger agentes biológicos. Quando duas soluções aquosas de polieletrólitos de carga oposta são reunidas, as fibras IPC podem ser retiradas da interface. Praticamente qualquer tipo de biomolécula hidrofílica em solução aquosa pode ser adicionada à solução de polieletrólito carregada negativa ou positivamente, facilitando assim a incorporação de biomoléculas úteis na fibra IPC durante o processo de complexação. Além disso, este processo requer apenas condições aquosas e ambientais, diminuindo assim o risco de perda de bioatividade. Usando este método, fatores de crescimento ativos2,7 até células8,9 foram entregues com sucesso. Além disso, o método simples de formação de fibras IPC permite a moldagem em qualquer forma ou orientação. A estabilidade de tais fibras tem sido vantajosa em sua incorporação em polímeros hidrofóbicos2 e hidrofílicos7 para criar scaffolds compostos. Esses andaimes compostos com fibras IPC são benéficos para criar um ambiente bioquímico fisiologicamente relevante, ao mesmo tempo em que fornecem ancoragem física para as células. 
Neste estudo, mostramos um método para incorporar fibras IPC em um scaffold hidrofílico e hidrofóbico com topografia para liberação controlada de biomoléculas ativas. Como prova de conceito, incorporamos fibras IPC feitas de quitosana e alginato no hidrogel hidrofílico pululano-dextrano biocompatível, não imunogênico e não antigênico ou no andaime hidrofóbico de policaprolactona biocompatível.

<table><tbody><tr><td>Pululano&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc Okayama Japão</td><td></td><td>Peso molecular (MW) 200 kDa. Este material é pullulan de grau farmacêutico usado para fazer armações de pullulan e andaimes PD-IPC.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Este material não está mais sendo produzido pela Sigma Aldrich. A alternativa sugerida é o número de catálogo 31392 (Sigma Aldrich). Este material é usado para fazer andaimes PD-IPC.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>O bicarbonato de sódio deve ser adicionado lentamente à solução de polissacarídeo pululano-dextrano. A adição rápida de bicarbonato de sódio resultará em precipitação.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trimetafosfato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Este produto químico é higroscópico e deve ser armazenado no gabinete de desumidificação. A solução aquosa de trimetafosfato de sódio deve ser sempre fresca.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Este material é perigoso e deve ser manuseado com equipamento de proteção adequado, como luvas de nitrilo.</td></tr><tr><td>Quitosana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Grau de acetilação de 75% a 85%. A purificação da quitosana é necessária para criar fibras IPC estáveis.</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td></td><td>Isso pode ser substituído por outro tipo de marca. Este material é corrosivo e inflamável. Equipamentos de proteção como protetor facial, luvas de nitrilo, jaleco e capa de sapato devem ser usados ao manusear este produto químico na capela de exaustão.</td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido algínico de algas marrons, baixa viscosidade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Dissolver em água durante a noite. Filtre através de estéril 0.2&nbsp; &micro; m antes de usar. Armazene a 4 ° C.</td></tr>O <tr>reagente <td></td> químico bovino de <td>Sinopharm</td> da <td>albumina</td> do soro <td>dissolve em PBS estéril e no filtro usando 0,2 &micro; m antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Este kit foi usado para medir a liberação de BSA de andaimes PD-IPC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fator de crescimento endotelial vascular recombinante humano</td><td>R& D systems</td><td>293-VE</td><td>Dissolver o fator de crescimento em solução de heparina a 0,2% até uma concentração final de 5&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica de</td> suínos <td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Isso pode ser substituído por outro tipo de marca. Dissolva o sal de heparina em água estéril na concentração final de 1% e filtre através de 0,2 &micro; m antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Este tipo de célula primária foi usado no ensaio para determinar a bioatividade do VEGF após a liberação dos scaffolds PD-IPC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Isso é usado para medir a atividade metabólica celular. Incube o azul de Alamar com células e mantenha em condições padrão de cultura de células por 2 a 4 horas. Meça a absorbância a 570 nm para determinar a redução percentual do azul de Alamar, que está correlacionada com a atividade celular.</td></tr><tr><td>ScanVac Coolsafe Liofilizador</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Este é um liofilizador não programável que opera de -105 a -110&nbsp; &deg;C. Isso pode ser substituído por outros liofilizadores de laboratório padrão.</td></tr><tr><td>Policaprolactona (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Isso não está mais sendo fabricado pela Sigma Aldrich. Isso pode ser substituído pelo número de catálogo Sigma Aldrich 704105.</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Isso pode ser substituído por outro tipo de marca. Este material é perigoso e deve ser manuseado na hotte. Equipamento de proteção deve ser usado o tempo todo ao manusear este produto químico.</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS; 184 Kit de Elastômero de Silicone)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>O kit de elastômero vem com base de polímero e reticulador. Misturar a base de polímero e o reticulador em diferentes proporções resultará em diferentes rigidezes do PDMS.</td></tr><tr><td>Fator de crescimento do nervo beta recombinante humano (NGF)</td><td>R& D systems</td><td>256-GF</td><td>Reconstituído em água DI estéril até uma concentração final de 100&nbsp; &micro; g&#8288;/&#8288;ml. Alíquota e armazenar em -20 &deg; C até o uso.</td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais humanas (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Este tipo de célula foi usado no ensaio para determinar o efeito sinérgico do NGF e da nanotopografia.</td></tr><tr><td>Células de Feocromocitoma PC12 de Rato</td><td>ATCC</td><td></td><td>Este tipo de célula foi usado no ensaio de crescimento de neuritos para determinar a bioatividade do NGF. Após a exposição ao meio de liberação com NGF, meça o número de células com extensões de neurite e normalize para o número total de células.</td></tr><tr><td>Papel de filtro de grau 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>É usado para a purificação de quitosana após sua precipitação com hidróxido de sódio em pH&nbsp;7.</td></tr><tr><td>Centrífuga de caçamba oscilante</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Para ser usada durante a purificação da quitosana usando a velocidade de 1.200 x g.</td></tr><tr><td>Motor com mandril girando a velocidade constante</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>O motor é utilizado para a fabricação de fibras IPC em pullulan ou estrutura PCL.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Esterilizar através de filtração (0,2 &micro; m) e autoclave.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Poliestireno para Cultura de Tecidos de 10 mm de diâmetro (TCPS)</td><td>Greiner</td><td></td><td>A placa TCPS é usada para fundição de estrutura de pululan.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit ELISA VEGF humano</td><td>R& Sistemas D</td><td>DVE00</td><td>O kit ELISA é utilizado para a detecção de VEGF no meio de libertação.</td></tr><tr><td>Kit ELISA NGF humano</td><td>R& D sistemas</td><td>DY256</td><td>O kit ELISA é usado para detecção de NGF no meio de liberação.</td></tr><tr><td>Fita adesiva revestida de plástico</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>A fita adesiva é usada para colar com segurança o clipe jacaré no mandril rotativo</td></tr></tbody></table>

andaimes de mistura de fibras interfacial polieletrólito para lançamento temporalmente controlada de biomoléculas

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Vários andaimes usados na engenharia de tecidos requerem um ambiente bioquímico controlado para imitar o nicho fisiológico da célula. As fibras de complexação polieletrolítica interfacial (IPC) podem ser usadas para entrega controlada de vários agentes biológicos, como medicamentos de moléculas pequenas, células, proteínas e fatores de crescimento. A simplicidade da metodologia na fabricação de fibras IPC dá flexibilidade em sua aplicação para entrega controlada de biomoléculas. Aqui, descrevemos um método de incorporação de fibras IPC em dois andaimes poliméricos diferentes, polissacarídeo hidrofílico e policaprolactona hidrofóbica, para criar um andaime composto multicomponente. Mostramos que as fibras de IPC podem ser facilmente incorporadas a essas estruturas poliméricas, aumentando a capacidade de liberação sustentada e melhor preservação de biomoléculas. Também criamos um andaime polimérico composto com pistas topográficas e liberação bioquímica sustentada que pode ter efeitos sinérgicos no comportamento celular. Scaffolds poliméricos compostos com fibras IPC representam um método novo e simples de recriar o nicho celular.

Neste artigo, buscou-se criar scaffolds compósitos com fibras de IPC para a libertação controlada de várias biomoléculas. Características das biomoléculas utilizadas neste estudo encontram-se na Tabela 1. Fibras de IPC foram incorporados primeiramente em um hidrogel hidrofílico PD para criar um andaime composta PD-CIP (Figura 1B). Molécula modelo BSA foi testado pela primeira vez para determinar a viabilidade da utilização de um andaime composto para liberação controlada de biomoléculas...

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma liberação controlada de biomoléculas com controle espacial para imitar o nicho celular a partir de scaffolds compostos poliméricos hidrofílicos ou hidrofóbicos. Isso é realizado primeiramente criando uma estrutura sacrificável de polímeros desejados para fornecer o arranjo espacial das fibras que liberam biomoléculas, chamadas de polieletrólito interfacial, ou fibras IPC. O segundo passo é incorporar fibras IPC contendo a biomolécula hidrofílica alvo em um suporte sacrificável.Em seguida, as fibras de IPC em estruturas sobre moldura são incorporadas a um esqueleto maior utilizando um substrato com padrão micro como molde de fundição, incorporando sinais topográficos no substrato. O passo final consiste em permitir a completa assimilação das fibras na moldura, na estrutura e a solidificação dos polímeros para criar substratos sem padrão ou com padrão micro. Por fim, ensaios padrão podem ser utilizados para demonstrar os perfis de liberação e a bioatividade das moléculas-alvo.A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes, como a microencapsulação, é que a incorporação de biomoléculas hidrofílicas em uma ampla variedade de scaffolds poliméricos hidrofílicos ou hidrofóbicos agora é possível por meio de um processo simples de incorporação e fabricação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de liberação de fármacos, incluindo a liberação bioquímica regulada múltipla, gradientes bioquímicos e o efeito sinérgico de pistas topográficas e liberação bioquímica sustentada sobre o comportamento celular. A demonstração visual da formação de fibras de polieletrólito é essencial, pois os passos são difíceis de aprender.A velocidade, a concentração e a pureza da solução de polieletrólito são todos fatores críticos na formação estável de fibras de CIP. Para começar, misture proteínas, fatores de crescimento ou outras biomoléculas de interesse em alíquotas de 10 a 20 microlitros das soluções de polieletrólito conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Em seguida, coloque pequenas gotas de 10 a 20 microlitros de quitosana e alginato sobre uma superfície plana e estável revestida com parafina. As gotas de quitosana e alginato devem ser colocadas em proximidade próxima, mas sem entrar em contato umas com as outras.Mergulhe levemente uma ponta de um par de pin&ccedil;as na gota de solu&ccedil;&atilde;o de alginato e a outra ponta na gota de solu&ccedil;&atilde;o de quitosana. Em seguida, junte as gotas dos polieletr&oacute;litos apertando as pin&ccedil;as. Quando as gotas entrarem em contato uma com a outra, puxe lentamente as pin&ccedil;as na dire&ccedil;&atilde;o vertical para extrair a fibra formada pela complexa&ccedil;&atilde;o interfacial de polieletr&oacute;litos, conhecida como fibra IPC, a partir da interface entre as duas gotas.Coloque cuidadosamente a extremidade da fibra de IPC estirada sobre um coletor composto por uma estrutura polimérica plana fixada em um mandril rotativo. Gire o mandril a uma velocidade constante de 10 milímetros por segundo para permitir a formação de fibras de IPC uniformes e sem glóbulos. Aumentar a velocidade de estiramento das fibras de IPC formará glóbulos, o que causará uma liberação abrupta dos compostos bioquímicos incorporados e a terminação prematura da fibra.De acordo com a observação de Liao et al. e KO et al., quando a fibra terminar, dilua o líquido remanescente com 500 microlitros de PBS e meça a concentração do conteúdo proteico ou de fator de crescimento restante no resíduo. Para determinar a eficiência de incorporação das biomoléculas, pese três gramas de polissacarídeo da Polônia e adicione a 15 mililitros de água destilada desionizada.Para criar uma solução aquosa a 20%, misture a solução Poland durante a noite para garantir homogeneidade no dia seguinte. Despeje 15 mililitros da solução Poland em uma placa de poliestireno para cultura de tecidos com diâmetro de 10 centímetros. Seque a solução durante a noite a 37 graus Celsius; uma vez seca, corte os filmes em quadros sacrificáveis de sete milímetros por sete milímetros em formato quadrado de Poland.Em seguida, prepare uma solução a 30% dos polissacarídeos Poland e dextrina em água destilada e desionizada numa proporção de três para um. Misture durante a noite para garantir homogeneidade e adicione lentamente bicarbonato de sódio à solução de polissacarídeos para atingir uma concentração final de 20%. Misture a solução durante a noite e armazene a solução final de polissacarídeos a quatro graus Celsius até o momento de uso. Fixe o quadro sacrificial de Poland na orientação desejada ao mandril rotativo utilizando um clipe de metal e uma fita adesiva revestida de plástico.Gire o mandril com o quadro fixado em uma velocidade constante de 10 milímetros por segundo. Em seguida, comece a puxar as fibras IPC conforme mostrado na seção anterior. No entanto, desta vez, fixe a extremidade puxada das fibras IPC no quadro giratório da Polônia.Aguarde o término da puxação da fibra IPC. Seque as fibras no suporte durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, solte o suporte do mandril rotativo removendo-o do clipe de jacaré.Coloque o construto na tampa de um tubo de microcentrífuga. Em seguida, coloque cinco gramas da solução de dextrina da Polônia em um béquer e comece a agitar a 60 rpm. Usando uma placa de agitação, adicione 500 microlitros de uma solução a 11% de fosfato de sódio trimeta, e 500 microlitros de hidróxido de sódio 10 molar.Para promover a reticulação da solução. Continue misturando a solução por um a dois minutos e, em seguida, despeje a solução viscosa de polissacarídeo sobre as fibras no suporte estrutural para incorporar completamente as fibras de IPC. Incube o suporte a 60 graus Celsius por 30 minutos para formar um suporte compósito quimicamente reticulado e induzir a formação de poros no suporte compósito.Mergulhe completamente o suporte em uma solução de ácido acético 20% por 20 minutos. Em seguida, lave o suporte três vezes em PBS por cinco minutos sob agitação a 100 rpm. Para remover qualquer reagente remanescente não reagido, remova o excesso de PBS e congele imediatamente os suportes compostos a menos 80 graus Celsius durante a noite.Em seguida, liofilize as estruturas por pelo menos 24 horas antes de utilizá-las em ensaios de liberação controlada ou de bioatividade. Comece criando um substrato de PDMS imaculado e padronizado com uma topografia desejada utilizando métodos padrão de litografia macia. Em seguida, prepare tanto o quadro sacrificável de PCL para a coleta de fibras IPC quanto a base de PCL padronizada, primeiramente dissolvendo 0,9% de PCL em diclorometano.Para cada centímetro quadrado da área do molde de moldagem do filme de PDMS, coloque 500 microlitros da solução de PCL 0,9% sobre o molde. Deixe o solvente evaporar completamente na câmara de fluxo, e então repita o processo de aplicação da solução de PCL 0,9% para aumentar a espessura do filme. Em seguida, prepare o quadro sacrificial colocando 500 microlitros de cada vez da solução de PCL 0,9% sobre um substrato de PDMS separado e imaculado.Para criar um molde base de PCL imaculado, aplique várias camadas de PCL para obter um andamento com a espessura desejada. Deixe o solvente cloreto de metila evaporar completamente na cabine de segurança assim que a espessura desejada for atingida. Remova o filme seco de PCL do substrato de PDMS imaculado e faça um orifício na estrutura de PCL utilizando um furador de tamanho PSAP.Em seguida, monte o quadro de PCL no mandril coletor e comece a puxar a fibra de IPC sobre o quadro conforme descrito anteriormente. Quando o puxamento da fibra de IPC terminar, remova o conjunto de fibra no quadro e deixe secar durante a noite a 25 graus Celsius. Coloque o conjunto de fibra no quadro sobre a base de PCL padronizada e adicione a solução de PCL 0,9% sobre o conjunto de fibra no quadro várias vezes para obter a espessura desejada e garantir que as fibras de IPC estejam completamente embutidas.A albumina sérica bovina ou BSA liberada do compósito de dextrina da Polônia IPD apresentou cinética quase linear, com uma liberação inicial em surto atenuado seguida por um estado estacionário concomitante. Após dois meses, a BSA atingiu uma liberação total de 97%. Em contraste, fibras IPC isoladas exibiram uma liberação rápida de 80% da BSA em quatro horas. Utilizando esse mesmo compósito, o fator de crescimento vascular também pôde ser liberado de forma sustentada pelas fibras, usando células endoteliais de veia umbilical humana como plataforma de teste.O fator de crescimento liberado mostrou-se bioativo após sua liberação em cada ponto temporal. Neste exemplo, o fator de crescimento nervoso foi carregado nas fibras ao longo de 18 dias. Aproximadamente 80% do fator de crescimento nervoso carregado foi liberado do compósito P-C-L-I-P-C de forma sustentada e linear, conforme demonstrado por um ensaio de crescimento de neuritos em células PC12.A quantidade de fator de crescimento nervoso bioativo liberada do suporte e no meio em cada ponto temporal teve um efeito semelhante sobre o crescimento dos neuritos, comparável à adição de 30 nanogramas por mililitro de fator de crescimento nervoso ao meio simples. Os suportes compostos P-C-L-I-P-C, que contêm tanto topografia quanto liberação controlada de fator de crescimento nervoso, podem ter um efeito sinérgico sobre o comportamento celular. Células-tronco mesenquimais humanas cultivadas em suportes compostos com nanoestrutura apresentaram um nível mais elevado de diferenciação neuronal em comparação com células expostas apenas à topografia ou ao fator de crescimento isoladamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de misturar a molécula hidrofílica desejada na solução de polieletrólito de mesma carga líquida para incorporá-la nas fibras. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um suporte polimérico compósito com capacidade de liberação controlada de moléculas terapêuticas. O grande avanço apresentado neste vídeo deverá permitir que você crie um suporte pulmonar com capacidade de liberação sustentada de fatores de crescimento, liberação de múltiplos fatores de crescimento e a criação de um gradiente de sinais bioquímicos que recapitule o nicho fisiológico.Não se esqueça de que trabalhar com ácido acético, hidróxido de sódio e cloreto de metila pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamento de proteção individual e capela de exaustão, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O processo de eletrofiação polímeros para engenharia de tecidos e de cultura de células é abordada neste artigo. Especificamente, o electrospinning de macromers fotorreativas com capacidades de processamento adicional de photopatterning e multi-polímero eletrofiação é descrito.

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Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis ​​para Engenharia de Tecidos

Neste vídeo, vamos demonstrar técnicas de modificação de implantes metálicos porosos para melhorar a sua funcionalidade e para controlar a migração celular. As técnicas incluem o desenvolvimento de gradientes de poros para controlar o movimento de células em 3D e a produção da membrana basal imita para controlar o movimento de células em 2-D. Além disso, um método baseado em HPLC para o acompanhamento da integração do implante in vivo através de análise de proteínas do sangue é descrito.

Modificação Multi-Escala de implantes metálicos com gradientes de poros, polieletrólitos e sua monitorização indirecta<em&gt; In vivo</em

Este protocolo combina eletrofiação e microesferas para desenvolver andaimes de engenharia de tecidos para direcionar os neurônios. O fator de crescimento nervoso foi encapsulado em microesferas de PLGA e eletrofiado em arcabouços fibrosos de ácido hialurônico (HA).  A bioatividade da proteína foi testada semeando os scaffolds com gânglios primários da raiz dorsal do pintinho e cultivando por 4-6 dias.

Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar andaimes electrospun nanofibras com organização gradated de fibras e explorar suas aplicações na regulação da morfologia celular / orientação. Gradientes no que diz respeito às propriedades físicas e químicas dos scaffolds nanofibras oferecer uma ampla variedade de aplicações na área biomédica.

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

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Fabricação de uma baseada em PCL Bioativos, &quot;Self-fitting&quot; Memória de Forma Polymer Andaime

Materiais poliméricos super-hidrofóbicos bidimensionais e tridimensionais são preparados por eletrofiação ou eletropulverização de polímeros biodegradáveis misturados com um polímero de menor energia superficial de composição semelhante.

Fabricação de super-hidrofóbicas Materiais Poliméricos para aplicações biomédicas

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A Facile e Eco-friendly rota para fabricar poli (ácido láctico) Scaffolds com Graded Pore Tamanho

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Expansão de duas dimensões Electrospun nanofibras esteiras em três dimensões andaimes

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Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

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