Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

O objetivo geral deste procedimento é fornecer entrega controlada de biomoléculas com controle espacial para imitar o nicho celular de andaimes de compósitos poliméricos hidrofílicos ou hidrofóbicos. Isso é feito criando primeiro uma estrutura sacrificial de polímeros desejados para fornecer o arranjo espacial das fibras liberadoras de biomoléculas chamadas polieletrólitos interfaciais, ou fibras IPC. O segundo passo é incorporar fibras IPC contendo a biomolécula hidrofílica direcionada em uma estrutura de sacrifício.

Em seguida, as fibras IPC nas construções da estrutura são incorporadas em um andaime maior usando um substrato de micro padrão como um molde de fundição incorporando pistas topográficas no substrato. A etapa final é permitir a assimilação total das fibras na estrutura, construção e solidificação dos polímeros para criar substratos não padronizados ou micro padronizados. Em última análise, ensaios padrão podem ser usados para mostrar os perfis de liberação e bioatividade das moléculas-alvo.

A principal vantagem desta técnica oferece outro método existente, como a microencapsulação, que a incorporação de biomolécula hidrofílica em uma ampla gama de andaimes de polímeros hidrofílicos ou hidrofóbicos agora é possível de ser feita em um processo simples de incorporação e fabricação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da entrega de medicamentos, incluindo gradiente bioquímico de liberação bioquímica regulada múltipla e esse efeito sinérgico de pistas topográficas e liberação bioquímica sustentada no comportamento celular. A demonstração visual da formação de fibras polieletrolíticas é crítica, pois as etapas são difíceis de aprender.

A velocidade, a concentração e a pureza da solução polieletrolítica são críticas na formação estável de fibras IPC Para começar, misture proteínas, fatores de crescimento ou outras biomoléculas de interesse em alíquotas de 10 a 20 microlitros das soluções polieletrolíticas, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, coloque pequenas gotículas de 10 a 20 microlitros de quitosana e alginato em uma superfície plana estável coberta com paraforma. As gotículas de quitosana e alginato devem ser colocadas próximas, mas não em contato umas com as outras.

Mergulhe levemente uma ponta de um par de pinças na gota de areia das pipas e a outra ponta na gota de alginato. Em seguida, junte as gotículas de eletrólitos poli apertando a pinça. Quando as gotículas entrarem em contato umas com as outras, puxe lentamente a pinça verticalmente para extrair a fibra de complexação polieletrolítica interfacial, conhecida como fibra IPC, da interface das duas gotículas.

Coloque cuidadosamente a extremidade da fibra IPC trefilada em um coletor que consiste em um andaime polimérico plano afixado em um mandril rotativo. Gire o mandril a uma velocidade fixa de 10 milímetros por segundo para permitir a formação de fibras IPC uniformes e sem cordões. Aumentar a velocidade de trefilação das fibras IPC formará grânulos, o que causará uma liberação de ruptura de bioquímica incorporada e terminação prematura da fibra.

Em concordância com a observação de liao et al, e KO et al. Quando a fibra terminar, dilua o líquido restante com 500 microlitros de PBS, meça a concentração da proteína restante ou o teor de fator de crescimento no resíduo. Para determinar a eficiência de incorporação das biomoléculas, pesar três gramas de polissacarídeo Poland e adicioná-lo a 15 mililitros de água destilada deionizada.

Para criar uma solução aquosa a 20%, misture a solução Poland durante a noite para garantir a homogeneidade no dia seguinte. Despeje 15 mililitros da solução de Polônia em um prato de poliestireno para cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro. Seque a solução durante a noite a 37 graus Celsius depois de seca, corte os filmes em quadros quadrados de sete milímetros por sete milímetros de Polônia de sacrifício.

Em seguida, crie uma solução a 30% dos polissacarídeos Polônia e dextrina em água destilada deionizada na proporção de três para um. Misture durante a noite para garantir a homogeneidade, adicione lentamente bicarbonato de sódio à solução de polissacarídeo para atingir uma concentração final de 20% Misture a solução durante a noite e armazene a solução final de polissacarídeo a quatro graus Celsius até que seja necessário. Fixe a moldura de sacrifício da Polônia na orientação desejada ao mandl rotativo usando um clipe jacaré e um pouco de fita adesiva revestida de plástico.

Gire o mandl com a estrutura afixada a uma velocidade constante de 10 milímetros por segundo. Em seguida, comece a desenhar as fibras IPC conforme mostrado na seção anterior. No entanto, desta vez, prenda a extremidade treinada das fibras IPC na estrutura rotativa da Polônia.

Aguarde o final do desenho da fibra IPC depois. Seque as fibras na construção do quadro durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, solte a construção do mandl giratório removendo-o do clipe jacaré.

Coloque a construção em uma tampa de tubo de microcentrífuga. Em seguida, coloque cinco gramas da solução de dextrina da Polônia em um béquer e comece a mexer a 60 RPMs. Usando uma placa de agitação, adicione 500 microlitros de uma solução de fosfato de sódio a 11% e 500 microlitros de hidróxido de sódio 10 molar.

Para fazer a ligação cruzada da solução. Continue misturando a solução por um a dois minutos e, em seguida, despeje a solução de polissacarídeo viscoso nas fibras na construção da estrutura para incorporar totalmente as fibras IPC. Incube a construção a 60 graus Celsius por 30 minutos para formar um andaime composto quimicamente reticulado para induzir a formação de poros no andaime composto.

Mergulhe todo o andaime em uma solução de ácido acético a 20% por 20 minutos. Em seguida, lave o andaime três vezes em PBS por cinco minutos enquanto agita a 100 RPMs. Para remover quaisquer reagentes não reativos restantes, remova o excesso de PBS e congele imediatamente os andaimes compostos a menos 80 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, liofilize os andaimes por pelo menos 24 horas antes de serem usados em qualquer liberação controlada ou ensaios de bioatividade. Comece criando um substrato PDMS imaculado e padronizado com uma topografia desejada usando métodos litográficos macios padrão. Em seguida, prepare a estrutura sacrificial do PCL para coleta de fibras IPC e a base PCL padronizada, dissolvendo primeiro 0,9% PCL em di clorometano.

Para cada área de um centímetro quadrado do molde de fundição de filme PDMS, coloque 500 microlitros da solução de 0,9% PCL no molde. Deixe o solvente evaporar completamente na capela e, em seguida, repita o processo de fundição de 0,9% PCL para engrossar o filme. Em seguida, prepare a estrutura de sacrifício colocando 500 microlitros de cada vez da solução de 0,9% PCL em um substrato PDMS intocado separado.

Para criar uma base PCL imaculada, molde várias camadas de PCL para obter um andaime com a espessura desejada. Deixar evaporar completamente todo o solvente clorometano na hotte quando a espessura desejada for atingida. Remova o filme PCL seco do substrato PDMS imaculado e faça um furo na estrutura PCL usando um perfurador de tamanho PSAP.

Em seguida, monte a estrutura PCL no mandril de coleta e comece a desenhar a fibra IPC na estrutura conforme descrito anteriormente. Quando o desenho da fibra IPC terminar, remova a fibra na construção da estrutura e deixe-a secar durante a noite a 25 graus Celsius. Coloque a fibra na construção do quadro em cima da base PCL padronizada e adicione a solução de 0,9% PCL na construção da fibra no quadro várias vezes para obter a espessura desejada e garantir que as fibras IPC estejam totalmente incorporadas.

A albumina sérica bovina ou BSA liberada do composto IPD de dextrina da Polônia mostrou cinética quase linear com uma liberação inicial atenuada seguida por um estado estacionário concomitante. Após dois meses, a BSA alcançou uma liberação total de 97%Em contraste, as fibras IPC autônomas exibiram uma liberação rápida de 80% da BSA em quatro horas. O uso desse mesmo fator de crescimento vascular composto também foi capaz de ser liberado de forma sustentável das fibras usando células endoteliais da veia umbilical humana como plataforma de teste.

O fator de crescimento liberado foi considerado bioativo após sua liberação em cada momento. Ponto. Neste exemplo, o fator de crescimento nervoso foi carregado nas fibras ao longo de 18 dias. Aproximadamente 80% do fator de crescimento nervoso carregado foi liberado do compósito P-C-L-I-P-C em uma liberação linear sustentada usando um ensaio de crescimento de neuritos PC 12.

A quantidade de fator de crescimento nervoso bioativo liberada do andaime para o meio em cada ponto de tempo teve um efeito semelhante no crescimento de neuritos como a adição de 30 nanogramas por mililitro de fator de crescimento nervoso ao meio simples. Os andaimes compostos P-C-L-I-P-C que contêm topografia e liberação controlada do fator de crescimento nervoso podem ter um efeito sinérgico no comportamento celular. As células-tronco mesenquimais humanas cultivadas em andaimes compostos de padrão nano mostraram um nível mais alto de diferenciação neuronal em comparação com as células expostas apenas à topografia ou ao fator de crescimento.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de misturar a molécula hidrofílica desejada na solução polieletrolítica da mesma carga líquida para incorporá-la às fibras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um andaime poli composto com a capacidade de controlar a liberação de moléculas de barra. O grande ganho neste vídeo deve permitir que você crie andaimes pulmonares com a capacidade de liberação sustentada de fator de crescimento, liberação de fator de crescimento múltiplo e crie um gradiente de pistas bioquímicas que recapitularão o nicho fisiológico.

Não se esqueça de que trabalhar com ácido ácido, hidróxido de sódio e cloro metano pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual e a capa de filme devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.