Name: Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative In Vitro Modelo Experimental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a criar redes neurais 3D em microesferas de vidro acopladas a matrizes de microeletrodos para estudos eletrofisiológicos avançados. Este modelo inovador supera as limitações das culturas 2D tradicionais.

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Os autores agradecem Giorgio Carlini pelo apoio técnico no desenvolvimento da estrutura de confinamento e dott. Ornella LoBrutto para a revisão completa do manuscrito. A investigação conducente a estes resultados beneficiaram de financiamento do 7º Programa-Quadro da União Europeia (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET jovens exploradores esquema), sob acordo de subvenção 284.772 CÉREBRO BOW (www.brainbowproject.eu).

O protocolo experimental foi aprovado pelo Animal Care Legislação Europeia (2010/63 / UE), pelo Ministério da Saúde italiano, de acordo com o DL 116/1992 e pelas diretrizes da Universidade de Genova (Prot. N. 13.130, de maio 2011). Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais para o projeto e para minimizar o seu sofrimento. 1. Preparação de Materiais e Suportes <ol><li> Construir o molde para construir as PDMS (Poly-dimetil-siloxano) de restrição por meio de um CNC (Controle Numérico Computadorizado) fresadora. Tal molde realiza-se em policarbonato com o cilindro central de politetrafluoroetileno (PTFE). Este material permite uma extracção fácil da máscara uma vez que o PDMS tem endurecido. NOTA: O projeto do molde foi realizada por Computer-Aided-Design (CAD) e, em seguida, entregue ao fresadora CNC. </li><li> Prepara-se o elastómero PDMS. PDMS é um polímero orgânico. Ele é constituído por dois elementos, Um agente de cura e um polímero. Misture-os por uma relação de volume de 1:10, uma parte do agente de cura e nove partes de polímero. Colocar os dois componentes em uma placa de Petri, e inserir agitar a mistura na câmara de vácuo durante 10 minutos para eliminar as bolhas de ar. 3 g de PDMS são suficientes para uma restrição. </li><li> Construa a restrição PDMS. Inserir o material PDMS no moldador e colocá-la no forno durante 30 minutos a 120 ° C. A restrição de PDMS tem a forma de um cilindro ideal, com um diâmetro interior e exterior de 22,0 e 3,0 mm, respectivamente, e uma altura de 650 microns. </li><li> Um dia antes do chapeamento, casal a máscara para a área ativa das matrizes Micro-Eletrodo (AMA) por meio de uma pinça sob microscópio estereoscópico e esterilizar a máscara PDMS no forno a 120 ° C. </li><li> Esterilizar a microesferas de vidro (diâmetro nominal de 40 ± 2 uM; diâmetro médio certificado de 42,3 ± 1,1 uM) em etanol a 70% durante 2 horas num frasco cónico e girar every 30 min para expor todas as micropérolas. </li><li> Remover a solução de etanol a partir do frasco e lavar as micro-esferas duas vezes com água esterilizada. </li><li> Condiciona-se a parte central da área de MEA delimitada pela máscara de PDMS (diâmetro igual a 3,0 mm) com 24 ul de solução de mistura de poli-D-lisina e laminina em 0,05 ug / ml. </li><li> Revestir as micropérolas com proteínas de adesão, a laminina e poli-D-lisina na 0,05 ug / ml e deixá-los durante a noite na incubadora a 37 ° C, para se obter uma rede neuronal estável e de longa duração. </li><li> Remover os factores de adesão, tanto a partir da superfície de vidro da MEA e para as microesferas de vidro. Aspirar aproximadamente 95% da solução de revestimento com uma pipeta e aplicar uma pequena volume- 24μl- de água estéril sobre a superfície do MEA. Aspirar novamente mais do que 95% da água e deixar secar o MEA sob o capô laminar durante 1 h antes do plaqueamento das células. NOTA: No caso de micro-esferas em vez disso, o revestimento aspirarsolução e fazer uma primeira lavagem com água esterilizada e um segundo com o meio basal e seu complemento, tais como B27, a fim de condicionar a superfície do vidro, onde os neurónios vai ser revestida. Não deixe que as microesferas de seca. Deixar-los em suspensão no meio de cultura no interior do frasco. </li><li> Distribuir, por meio de uma pipeta -200 μl-, a suspensão de micro-esferas tratadas (cerca de 32.000) numa placa com múltiplas cavidades com pastilha de membrana (diâmetro de poro de 0,4 um), onde eles se auto-montam formando uma camada uniforme. </li><li> Encher cada poço da membrana com 0,5 ml de meio e colocá-lo na incubadora (T = 37,0 ° C, CO2 = 5%) até que os neurónios estão prontos a ser revestida (3,2). </li></ol> 2. Dissecção de Embriões e dissociação de Tissue <ol><li> Ratas adultas Casa (200-250 g) a uma temperatura constante (22 ± 1 ° C) e humidade relativa (50%), sob um horário de luz-escuro normal (em 7 de luz-AM-7 PM) nabiotério. Certifique-se de que os alimentos e água estão disponíveis gratuitamente. </li><li> Anestesiar um rato fêmea grávida após 18 dias de desenvolvimento (E18), utilizando 3% de isoflurano. Então, sacrificar o animal por deslocamento cervical. </li><li> Remover hipocampos de cada embrião de rato e colocá-los em solução salina equilibrada de Hank gelada sem Ca2 + e Mg2 +. No dia 18 de desenvolvimento do hipocampo e do córtex tecidos são muito suaves e não precisa de ser cortado em pequenos pedaços. Mais detalhes podem ser encontrados 18,19. </li><li> Dissociar o tecido em solução de 0,125% de tripsina / de Hank contendo 0,05% de DNAse, durante 18-20 min a 37 ° C. </li><li> Remover a solução de sobrenadante com uma pipeta Pasteur e parar a digestão enzimática pela adição de meio com 10% de soro fetal de bovino (FBS) durante 5 min. </li><li> Remover o meio com FBS e lavar uma vez com o meio com suplemento a, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. Retirar novamente o meio com um pip Pasteurette e encher de novo com uma pequena quantidade (500 uL) de meio de crescimento com o seu complemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. </li><li> Dissociar o sedimento tecido mecanicamente com uma pipeta Pasteur estreita até uma suspensão leitosa de células é aparente. Não é necessário centrifugar a suspensão de células. </li><li> Dilui-se a pequeno volume de suspensão de células com o meio de crescimento para se obter um volume final de 2,0 ml. Contagem celular a concentração obtida com uma câmara de hemocitómetro. Dilui-se esta concentração de 1: 5 a fim de se obter a concentração desejada de células de 600-700 células / mL. </li></ol> 3. celular Galvanização <ol><li> As células em placas a uma densidade de cerca de 2.000 células / mm 2 sobre a área activa do MEA, definidos pela restrição PDMS para criar uma rede neuronal 2D. Nota: Cada hipocampo contém cerca de 5 x 10 5 células, (1 x 10 6 para um único embrião). Dissecar 6 embriões para obter um montante total de 6 x 106 células em 2 ml e uma concentração estimada de 3.000 células / mL. Dilui-se esta concentração de 1: 5 a fim de se obter a concentração de células desejada e placa cerca de 600-700 células / mL. Se a área de MEA delimitado pela restrição PDMS é de cerca de 7.065 mm 2, e o número total de células plaqueadas 600 células / mL x 24 mL = 14.400 células, a densidade final de 2.038 células / mm 2. </li><li> Colocar os dispositivos de MEA na incubadora humidificada com CO 2 ambiente (5%) a 37 ° C. </li><li> Distribuir 160 ul da suspensão com uma concentração de células de 600-700 células / ul (cerca de 100.000 células) sobre a superfície da monocamada micropérolas posicionado no interior das placas com múltiplas cavidades para completar o passo preliminar para a construção de cultura tri-dimensional. Colocar as placas com múltiplas cavidades na incubadora humidificada com CO 2 ambiente (5%) a 37 ° C. </li></ol> 4. Construção 3D Rede Neuronal <ol><li> 6-8 horas após o plaqueamento, transferir a suspensão (micropérolas com neurónios) a partir das placas com múltiplas cavidades com muito cuidado dentro da área delimitada pela restrição PDMS usando uma pipeta para definir um volume de cerca de 30-40 ul. Depois de cada transferência, espere por cerca de meio minuto, para permitir que as microesferas para se juntam em uma estrutura compacta hexagonal. </li><li> Uma vez que todas as camadas são depositadas e espontaneamente montado, encher com uma grande gota de cerca de 300 ul de meio do topo da área delimitada pela restrição de PDMS. </li><li> Coloque a estrutura 3D acoplado a MEA na incubadora (T = 37,0 ° C, CO2 = 5%) durante 48 horas antes da adição de um volume final (cerca de 1 ml) de meio de cultura de crescimento com o seu complemento. NOTA: Considere o número total de grânulos sobre as placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana (30,000) e o número de pérolas numa única camada sobre o dispositivo MEA (6000). A estrutura 3D resultante é composto por 5 camadas de microbeads e células. Levando-se em conta que a rede neuronal 3D não é geometricamente perfeita, a estrutura em 3D resultante pode ser composta de 5-8 camadas. </li><li> No dia após o plaqueamento, adicionar cuidadosamente o volume final do meio (cerca de 900 uL) no interior do anel de MEA. Manter as culturas 3D em uma atmosfera humidificada de CO 2 (5%) a 37 ° C durante 4-5 semanas. Substituir metade do meio de uma vez por semana. </li></ol> 5. Microscopia Confocal Aquisição <ol><li> Fixar as amostras biológicas para a fase de microscópio de um suporte. Defina a laser (argônio, 496-555 nm), a velocidade de verificação (400 Hz) em que adquirir a imagem, o ganho e offset (-0,3%), da PMT para cada imagem para capturar o filtro de emissão de banda correta e em ordem para evitar a saturação e para aumentar a relação sinal-ruído. A seção de resultados informa os valores utilizados para adquirir as imagens da Figura 4. </li><li> Para a aquisição da sequência Z -stack, abetost selecionar, o valor da posição z da parte superior e a camada inferior da amostra, e em seguida, selecione o tamanho do passo para fazer a aquisição. </li></ol>

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<li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S%22%5BJournal%5D)">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li>
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<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li>
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<li>3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste trabalho, um romance experimental em plataforma vitro composta de 3D ​​engenharia culturas neuronais acoplados a AAM para eletrofisiologia rede foi apresentada. A utilização de micropérolas como andaime para permitir que o crescimento neurítico ao longo da -axis Z foi adaptado para ser integrado com o MEA planar. Desta forma, os resultados obtidos micro-sistema em um modelo in vitro 3D válido e confiável para estudar a dinâmica eletrofisiológicos emergentes 16. <p...

Em bidimensionais redes neurais (2D) vitro acoplados a Micro-Arrays eletrodo (AMA) arethe modelo experimental padrão-ouro adotada para estudar a interação entre a dinâmica neuronal e a conectividade subjacente. Durante o desenvolvimento, os neurônios recriar redes complexas que mostrar bem actividade definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (ou seja, explosões, rajadas de rede, atividade spiking aleatório). AAM registrar a atividade eletrofisiológica de muitos sites (de dezenas a milhares de microeletrodos), permitindo uma investigação detalhada da dinâmica expressos no nível da rede. Além disso, a utilização de culturas dissociadas faz possibile para conceber-redes modificadas. É mais fácil de entender, desta forma as relações funcionais entre a atividade eletrofisiológica registradas e os parâmetros da organização em rede como densidade de células 3, grau de modularidade 4,5, presença de pop neuronal heterogêneoulations 6, etc. No entanto, todos os estudos in vitro em células cultivadas dissociados são baseados em redes neuronais 2D. Esta abordagem conduz a simplificações em relação à (, intrinsecamente 3-dimensional 3D) Sistema in vivo: (I) num modelo em 2D, somata e cones de crescimento se encontram achatados e a excrescência axónios-dendrites não pode propagar em todas as direcções 7. (ii) 2D in vitro redes exposição estereotipada dinâmica eletrofisiológicos dominadas por atividade envolvendo a maior parte dos neurônios da rede 8 estourando. Recentemente, soluções diferentes têm sido desenvolvidos para permitir que a construção in vitro de 3D ​​redes neuronais dissociadas. A idéia comum consiste na criação de um andaime onde os neurônios pode crescer de uma forma 3D. Um tal andaime pode ser realizada com géis de polímeros e matrizes sólidas porosas 9-13. Ao explorar as propriedades mecânicas dos polímeros, é possível incorporar no interior das células Tse estruturas através da definição de um bloco uniforme de culturas 3D de neurospheres 11. A principal característica dessa abordagem é a propriedade mecânica rígida das neuroesferas 9,12. No entanto, estes materiais têm porosidade limitada, e eles não garantem a migração de células no interior da matriz. Para superar esta desvantagem, uma possível solução consiste em cortar a matriz em módulos «unidade». Infelizmente, o tamanho e forma das partículas de diversidade pode dificultar a embalagem em estruturas em camadas regulares. Em 7 de Cullen e colaboradores projetou uma construção neuronal 3D feito de neurônios e / ou astrócitos dentro de um extracelular andaime bioativo à base de matriz. Um tecido neural, tais engenharia permitida em investigações in vitro para estudar e manipular as respostas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistiu em neurónios e glia distribuídas por toda a matriz extracelular (ECM) e / ou andaimes de hidrogel (500-600 mm de espessura). Neste condition, uma viabilidade celular óptima (maior do que 90%) foi encontrado por plaqueamento de células, a uma densidade de cerca de 3,750 definitiva - 5000 células / mm3. Deve-se notar que um tal valor de densidade é muito menor do que a da condição in vivo, onde a densidade das células do córtex cerebral do rato é de cerca de 90.000 células / mm 3 14. Para superar esta limitação Pautot e colaboradores 15 realizado um sistema 3D in vitro em que a densidade celular e a conectividade de rede são controladas para se assemelhar a condições in vivo, permitindo simultaneamente imagens em tempo real da rede. Na prática, este método baseia-se no conceito de que os neurónios dissociados em cultura são capazes de crescer em microesferas de sílica. Estas contas fornecem uma superfície de crescimento grande o suficiente para os corpos celulares neuronais para aderir e para as suas arborizações para crescer, amadurecer, se estendem, e definem contatos sinápticos para outros neurônios. Este método explora as propriedades espontâneas de montagem de contas monodispersas para form 3D em camadas matrizes hexagonais contendo subconjuntos distintos de neurônios em diferentes camadas com conectividade restrita entre os neurônios em diferentes esferas. A densidade celular obtida com este método foi de cerca de 75.000 células / mm3. Recentemente, nós adaptamos o método de Pautot aos MEA 16: os resultados obtidos mostram que a atividade eletrofisiológica 3D apresenta um repertório mais vasto de actividades do que aquela expressa por redes 2D. Culturas maduras 3D exibem uma dinâmica reforçada em que ambos estouro de rede e aleatória coexistem pico de atividade. Da mesma forma, Tang-Schomer e colaboradores 17 realizado um andaime poroso à base de proteína de seda que mantém uma cultura primária cortical in vitro para alguns meses, e registada a actividade electrofisiológica por meio de um eléctrodo de tungsténio. Neste trabalho, os procedimentos experimentais para construir redes neuronais 3D acoplados aos MEA será descrito.

<table><tbody><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>0.05 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>0.05 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de tripsina</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>0,125% diluído 1:2 em HBSS sem CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0,05% diluído&nbsp; em solução de Hanks</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21103049 meio de</td><td>cultura</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% de meio supleente</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>gentamicina 0,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>Poli-Dimetil-Siloxano (PDMS)</td><td>Corning Sigma</td><td>481939</td><td>agente de cura e o polímero</td></tr><tr><td>Micro-Electrode Arrays</td><td>Multi Channel Systems (MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA com: Grelha de eléctrodos 8x8; Espaçamento e diâmetro dos eletrodos 200 e 30 &micro; m, respectivamente; anel de plástico sem rosca</td></tr><tr><td>Microbead</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp; 1 gr Peça de Vidro. Tamanho Stds 40 &micro; m</td></tr><tr><td>Placas</td> multipoços <td>Transwell Costar Sigma</td><td>CLS 3413</td><td>com inserção de membrana (6,5 mm de diâmetro poroso 0,4 &micro; m)</td></tr><tr><td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solução Tampão</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Teflon</td><td>Sigma</td><td>430935-5G</td><td>politetrafluoretileno</td></tr><tr><td>Rato</td><td>Sprague Dawley</td><td>Wistar Rato</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Confocal Vertical</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 Objetivo de ÁGUA</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 Objetiva de ÁGUA</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 Objetiva ÁGUA</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

interface 3d engineered culturas neuronais para micro-arrays eletrodo: an innovative<em&gt; in vitro</em&gt; modelo experimental

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Atualmente, redes de grande escala derivadas de neurônios dissociados crescendo e se desenvolvendo in vitro em dispositivos microtransdutores extracelulares são o modelo experimental padrão-ouro para estudar mecanismos neurofisiológicos básicos envolvidos na formação e manutenção de conjuntos de células neuronais. No entanto, os estudos in vitro têm se limitado ao registro da atividade eletrofisiológica gerada por redes neurais bidimensionais (2D). No entanto, dada a intrincada relação entre estrutura e dinâmica, uma melhoria significativa é necessária para investigar a formação e a dinâmica de desenvolvimento de redes tridimensionais (3D). Neste trabalho, é apresentada uma nova plataforma experimental na qual redes hipocampais ou corticais 3D são acopladas a Micro-Electrode Arrays (MEAs) planares. As redes 3D são realizadas semeando neurônios em um andaime constituído de microesferas de vidro (30-40 μm de diâmetro) nas quais os neurônios são capazes de crescer e formar conjuntos 3D complexos interconectados. Desta forma, é possível projetar redes 3D projetadas compostas por 5-8 camadas com uma densidade celular final esperada. A crescente complexidade na organização morfológica da montagem 3D induz um aumento dos padrões eletrofisiológicos exibidos por este tipo de redes. Em comparação com as redes 2D padrão, onde surge uma atividade de bursting altamente estereotipada, a estrutura 3D altera a atividade de bursting em termos de duração e frequência, além de permitir a observação de atividades de pico mais aleatórias. Nesse sentido, o modelo 3D desenvolvido se assemelha mais às redes neurais in vivo.

. Neste procedimento experimental, um papel relevante é reproduzida pelas microesferas que definem o andaime mecânica para o crescimento da rede neuronal 3D Figuras visor 1A e B, o arranjo das microesferas (diâmetro nominal de 40 ± 2 uM; diâmetro médio autenticada 42,3 ± 1,1 uM) no plano. A particularidade deste tipo de estruturas é que micropérolas espontaneamente auto-montar definindo uma geometria hexagonal compacto (Figura 1B e C). O andaime assim gerado garante uma...

Neste trabalho, um novo modelo experimental no qual culturas neuronais 3D são acopladas a matrizes planares de microeletrodos (MEAs) é presented. 3D redes são construídas semeando neurônios em um andaime composto de microesferas de vidro nas quais os neurônios crescem e formam estruturas 3D interconectadas.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um novo modelo de redes neuronais tridimensionais in vitro acopladas a matrizes de microeletrodos. Isso é realizado primeiramente condicionando a parte central da MEA com uma solução mista de polilisina e laminina, seguido pelo revestimento dos microesferas com proteínas de adesão, laminina e polilisina. O segundo passo consiste em distribuir a suspensão de microesferas tratadas em uma placa de múltiplos poços, onde elas se auto-organizarão e formarão uma camada uniforme.O terceiro passo do procedimento é semear as células na área ativa da MEA com uma densidade de 2000 células por milímetro quadrado para criar redes neurais em 2D. De seis a oito horas após a semeadura, a suspensão é transferida das placas de múltiplos poços para a MEA e as microesferas são deixadas livres para se autoorganizarem em uma estrutura compacta hexagonal. Por fim, a microscopia confocal é utilizada para visualizar as redes em 3D, que são comparadas às redes neurais convencionais em 2D cultivadas sobre MEA.A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como culturas celulares tridimensionais in vitro, é que em um modelo tridimensional, os somatos e os cones de crescimento são achatados, e os axônios não conseguem se espalhar em todas as direções. Além disso, a atividade em rajadas domina a dinâmica eletrofisiológica das redes tridimensionais, enquanto em uma rede tridimensional, também coexiste uma atividade aleatória e esparsa. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao ler o artigo de pesquisa de Sophie Potto, publicado na Nature Methods em 2008, no qual ela utilizou MICROBITS como um suporte para construir redes neurais tridimensionais.Em seguida, adaptamos este método para realizar os primeiros registros tridimensionais in vitro. Para preparar o elastômero de PDMS, misture o agente de cura e um polímero na proporção de volume de um para nove em uma placa de Petri. Em seguida, agite a mistura e coloque-a na câmara de vácuo por 10 minutos para eliminar bolhas de ar.Para construir a restrição de PDMS, insira o material de PDMS no moldador; em seguida, coloque-o no forno por 30 minutos a 120 graus Celsius. A restrição de PDMS deve ter a forma de um cilindro com diâmetro externo e interno de 22,0 e 3,0 milímetros, respectivamente, e altura de 650 micrômetros no dia anterior ao plaqueamento. Acople a máscara à área ativa da MEA sob um microscópio estereoscópico e, então, esterilize a máscara de PDMS no forno a 120 graus Celsius.Em seguida, esterilize as microesferas de vidro em um frasco cônico contendo etanol 70% por duas horas, invertendo a cada 30 minutos para expor todas as microesferas posteriormente. Remova a solução de etanol do frasco e lave as microesferas duas vezes com água esterilizada. Em seguida, condicione a parte central da área de MEA delimitada pela máscara de PDMS com 24 microlitros de solução mista de polilisina e laminina a 0,05 microgramas por mililitro.Cubra as microesferas com proteínas de adesão, laminina e polilisina a 0,05 microgramas por mililitro. Posteriormente, coloque-as no incubador durante a noite a 37 graus Celsius para obter uma rede neuronal estável e duradoura. Em seguida, distribua a suspensão das microesferas tratadas em uma placa de múltiplos poços com inserto de membrana, onde elas se auto-organizarão e formarão uma camada uniforme.Em seguida, preencha cada poço da membrana com 0,5 mililitros de meio. Coloque-o no incubador a 37 °C e 5% de CO₂ até que os neurônios estejam prontos para serem semeados nesta etapa. Após sacrificar uma rata prenhe E18, obtenha os embriões de rato e, em seguida, remova os hipocampos de cada embrião de rato.Coloque-os em solução salina de Hanks gelada, sem cálcio e magnésio. Em seguida, dissocie o tecido em solução de Hanks com 0,125% de tripsina contendo 0,05% de DNAse por 18 a 20 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, remova o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur. Interrompa a digestão enzimática adicionando meio contendo 10% de FBS por cinco minutos. Em seguida, remova o meio com FBS e lave uma vez com o meio de crescimento, seu suplemento 1% de L-glutamina e Gentamicina a 10 microgramas por mililitro.Posteriormente, remova o meio. Reponha novamente com 500 microlitros de meio de crescimento. Suplemente com 1% de L-glutamina e gentamicina a 10 microgramas por mililitro.Dissocie o pellet de tecido mecanicamente com uma pipeta de vidro estreita até que uma suspensão esbranquiçada de células seja visível. Em seguida, dilua um pequeno volume da suspensão celular com o meio de crescimento para obter um volume final de 2,0 mililitros. Determine a concentração celular obtida utilizando uma câmara de contagem hemocitométrica.Em seguida, dilua essa concentração na proporção de um para cinco para obter a concentração desejada de 600 a 700 células por microlitro. Plaque as células numa densidade de 2000 células por milímetro quadrado na área ativa da MEA definida pelo limite de PDMS para criar uma rede neuronal 2D. A seguir, coloque o dispositivo MEA no incubador com atmosfera de dióxido de carbono umidificado a 5% a 37 graus Celsius.Para concluir a etapa preliminar para a construção do cultivo 3D, distribua 160 microlitros da suspensão com uma concentração celular de 600 a 700 células por microlitro sobre a superfície da monocamada de microesferas posicionada dentro das placas de múltiplos poços. Em seguida, coloque as placas de múltiplos poços no incubador com atmosfera úmida de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius; seis a oito horas após o plaqueamento, transfira 30 a 40 microlitros da suspensão contendo microesferas e neurônios para a área da MEA delimitada pela restrição de PDMS. Após cada transferência, espere cerca de meio minuto para permitir que as microesferas se autoorganizem em uma estrutura hexagonal.Uma vez que todas as camadas são depositadas e auto-organizadas com 300 microlitros de meio na parte superior da área delimitada pela restrição de PDMS. Coloque a estrutura 3D acoplada à MEA no incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Após esse período, adicione um mililitro de meio de crescimento com seu suplemento; após três semanas in vitro, a estrutura 3D está estável também sem a restrição de PDMS, conforme demonstrado.Aqui está uma imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) de uma única camada de microesferas acopladas à superfície da MEA. A posição dos pontos pretos representa a disposição espacial dos eletrodos. A coloração imunofluorescente para a proteína map2, indicada pelo sinal vermelho, mostra a distribuição da arborização dendrítica e da ADA dos neurônios ao redor das microesferas diretamente acopladas ao plano de eletrodos da MEA.Esta imagem mostra a projeção máxima de uma sequência Zack de um cultivo 3D exibindo uma rede altamente interconectada na qual os neurônios são marcados para a nova N expressa em neurônios maduros pós-mitóticos. E para GABA, este é o registro eletrofisiológico representativo das redes do hipocampo em configuração 3D. E este é o registro eletrofisiológico representativo das redes do hipocampo em configuração 2D.Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em sete horas. No entanto, vale ressaltar que, como o procedimento possui várias etapas realizadas em dias diferentes, a estimativa de tempo para a realização de todo o procedimento é meramente indicativa. Ao tentar executar este procedimento, é importante lembrar-se de primeiro semear uma camada 2D de neurônios diuréticos sobre o eletrodo da MEA e, em seguida, transferir com muito cuidado a suspensão de microfragmentos e neurônios da placa de múltiplos poços para a MEA, a fim de obter a estrutura 3D após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência computacional explorarem como a conectividade da rede pode moldar a dinâmica emergente da rede. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir uma rede neuronal tridimensional in vitro acoplada a matrizes de microeletrodos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo fornece as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas na AAM.

Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de uma cultura neuronal 3D acoplada a uma matriz de microeletrodos planares com neurônios do hipocampo. Os neurônios isolados formam uma rede 2D na área ativa do conjunto de microeletrodos e aderem a microesferas de vidro em uma placa de vários poços com uma inserção de membrana. Ao transferir essas microesferas revestidas de neurônios para o eletrodo, elas se organizam em uma rede neural 3D interconectada.

Construindo redes neuronais tridimensionais acopladas a matrizes de microeletrodos

Este vídeo demonstra o procedimento de uso da matriz de multieletrodos (MEA) para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D. Este método permite entender a dinâmica da rede neural e a atividade de explosão da rede sináptica dentro das esferas 3D.

Utilizando matrizes de multieletrodos para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D

Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.

Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.

Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal

A impressão 3D em escala micrométrica permite a prototipagem rápida de dispositivos poliméricos para culturas de células neuronais. Como prova de princípio, as conexões estruturais entre os neurônios foram restringidas pela criação de barreiras e canais que influenciam o crescimento dos neuritos, enquanto as consequências funcionais de tal manipulação foram observadas pela eletrofisiologia extracelular.

Polimerização de dois fótons Impressão 3D de dispositivos de cultura de células neuronais em microescala

Aqui, empregamos HD-MEA para nos aprofundarmos na dinâmica computacional de conjuntos neuronais de grande escala, particularmente em hipocampo, circuitos de bulbos olfativos e redes neuronais humanas. A captura da atividade espaço-temporal, combinada com ferramentas computacionais, fornece insights sobre a complexidade do conjunto neuronal. O método melhora a compreensão das funções cerebrais, potencialmente identificando biomarcadores e tratamentos para distúrbios neurológicos.

Gravação e Análise da Dinâmica Multimodal de Conjuntos Neuronais em Larga Escala em Microeletrodos de Alta Densidade Integrados CMOS

Este protocolo visa colocar de forma estável assembleias dorsais-ventrais fundidas em matrizes de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia in vitro.

Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a criar redes neurais 3D em microesferas de vidro acopladas a matrizes de microeletrodos para estudos eletrofisiológicos avançados. Este modelo inovador supera as limitações das culturas 2D tradicionais.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative

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