Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative In Vitro Modelo Experimental

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um novo modelo de redes neuronais tridimensionais in vitro acopladas a micro arranjos de eletrodos. Isso é feito primeiro condicionando, a parte central do MEA com uma solução mista de poli de lisina e laminina e, em seguida, revestindo as microesferas com proteínas de adesão, laminina e polilisina. O segundo passo é distribuir a suspensão das microesferas tratadas em uma placa de vários poços, onde elas se automontarão e formarão uma camada uniforme.

A terceira etapa do procedimento é colocar as células na área ativa do MEA a uma densidade de 2000 células por milímetro quadrado para criar redes neuronais 2D. Seis a oito horas após o revestimento, a suspensão é transferida das placas de vários poços para o MEA e as microesferas podem se auto-montar em uma estrutura compacta hexagonal. Em última análise, a microscopia confocal é usada para visualizar as redes 3D, que são comparadas às redes neuronais 2D convencionais cultivadas ao longo do MEA.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como culturas de células dimensionais BDI in vitro, é que em um modelo dimensional BDI, somata e cones de crescimento são achatados, Andon e ascensão não podem se espalhar em todas as direções. Além disso, a atividade de explosão domina a dinâmica eletrofisiológica das redes dimensionais BDI, enquanto em uma tridimensional, também coexiste uma atividade de specking aleatório. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando lemos o trabalho de pesquisa de Sophie Potto publicado na Nature Method em 2008, no qual ela usou MICROBITS como um andaime para construir redes ne tridimensionais.

Em seguida, adaptamos esse método para mim para fazer os primeiros registros tridimensionais in vitro. Para preparar o elastômero PDMS, misture o agente de cura e um polímero por uma proporção de volume de um para nove em uma placa de Petri. Em seguida, agite a mistura e coloque-a na câmara de vácuo por 10 minutos para eliminar as bolhas de ar.

Para construir a restrição PDMS, insira o material PDMS no moldador mais antigo depois disso, coloque-o no forno por 30 minutos a 120 graus Celsius. A restrição PDMS deve ter a forma de um cilindro com diâmetro externo e interno de 22,0 e 3,0 milímetros, respectivamente, e uma altura de 650 micrômetros no dia anterior ao revestimento. Acople a máscara à área ativa do MEA sob um microscópio estéreo e, em seguida, esterilize a máscara PDMS no forno a 120 graus Celsius.

Em seguida, esterilize as microesferas de vidro em um frasco cônico de 70% de etanol por duas horas, girado a cada 30 minutos para expor todas as microesferas depois. Remova a solução de etanol do frasco e enxágue as microesferas duas vezes com água esterilizada. Em seguida, condicione a parte central da área MEA delimitada pela máscara PDMS com 24 microlitros de solução mista de polilisina e laminina a 0,05 microgramas por mililitro.

Cubra as microesferas com proteínas de adesão, laminado e polilisina a 0,05 microgramas por mililitro. Posteriormente, coloque-os na incubadora durante a noite a 37 graus Celsius para obter uma rede neuronal estável e duradoura. Em seguida, distribua a suspensão das microesferas tratadas na placa de vários poços com uma inserção de membrana onde elas se automontarão e formarão uma camada uniforme.

Em seguida, encha cada poço da membrana com 0,5 mililitros de meio. Coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que os neurônios estejam prontos para serem plaqueados nesta etapa. Depois de sacrificar uma rata grávida E 18, obtenha os embriões de rato e, em seguida, remova os campos de hipopótamo de cada embrião de rato.

Coloque-os em Hanks gelados. Equilibre a solução salina sem cálcio e magnésio. Em seguida, dissocie o tecido em 0,125% de solução de tryin Hanks contendo 0,05% de DNAs por 18 a 20 minutos a 37 graus Celsius.

Depois disso, remova o sobrenadante com uma pipeta peor. Pare a digestão enzimática adicionando meio com 10% FBS por cinco minutos. Em seguida, remova o meio com FBS e lave uma vez com o meio de crescimento, seu suplemento 1%L-glutamina e Gentamicina a 10 microgramas por mililitro.

Em seguida, remova o meio. Reabasteça-o novamente com 500 microlitros de crescimento. Média. Seu suplemento 1%L-glutamina e Gentamicina a 10 microgramas por mililitro.

Dissocie o pellet de tecido mecanicamente com uma pipeta estreita de PEs até que uma suspensão leitosa de células seja aparente. Em seguida, diluir um pequeno volume de suspensão celular com o meio de crescimento para obter um volume final de 2,0 mililitros. Conte a concentração celular obtida com a câmara do hemocitômetro.

Em seguida, dilua essa concentração na proporção de um para cinco, a fim de obter a concentração celular desejada de 600 a 700 células por microlitro. Coloque as células com uma densidade de 2000 células por milímetro quadrado na área ativa do MEA definida pela restrição PDMS para criar uma rede neuronal 2D. Em seguida, coloque o dispositivo MEA na incubadora com 5% de atmosfera de dióxido de carbono umidificado a 37 graus Celsius.

Para completar a etapa preliminar para a construção da cultura 3D, distribua 160 microlitros da suspensão com uma concentração de células de 600 a 700 células por microlitro na superfície da monocamada de microesferas posicionada dentro das placas de poços múltiplos. Em seguida, coloque as placas multipoços na incubadora com atmosfera de dióxido de carbono a 5% umidificada a 37 graus Celsius, seis a oito horas após o plaqueamento, transfira 30 a 40 microlitros da suspensão com microesferas e neurônios para a área do MEA delimitada pela restrição PDMS. Após cada transferência, espere cerca de meio minuto para permitir que as microesferas se automontem em uma estrutura hexagonal.

Uma vez que todas as camadas são depositadas e montadas espontaneamente a 300 microlitros de meio no topo da área delimitada pela restrição PDMS. Coloque a estrutura 3D acoplada ao MEA na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Depois disso, adicione um mililitro de meio de crescimento com seu suplemento após três semanas in vitro, a estrutura 3D é estável também sem a restrição PDMS mostrada.

Aqui está uma imagem DIC de uma única camada de contas acopladas à superfície MEA. A posição dos pontos pretos representa o layout espacial dos eletrodos. A coloração imunofluorescente para o mapa dois, que é refletida pelo sinal vermelho, exibe a distribuição da arborização dendrítica e ADA dos neurônios ao redor das microesferas diretamente acopladas ao plano do eletrodo do MEA.

Esta imagem mostra a projeção máxima de uma sequência Zack de uma cultura 3D exibindo uma rede altamente interconectada onde os neurônios são marcados para novos N expressos em neurônios pós-mitóticos maduros. E para o gaba, aqui está o registro eletrofisiológico representativo das redes do hipocampo em configuração 3D. E aqui está o registro eletrofisiológico representativo das redes do hipocampo em configuração 2D.

Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em sete horas. No entanto, vale ressaltar que, como o procedimento possui várias etapas que foram realizadas em dias diferentes, a estimativa do tempo para realizar todo o procedimento é apenas uma indicação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de primeiro colocar uma camada 2D de neurônio diurético no eletrodo do mea e, em seguida, transferir com muito cuidado a suspensão de microbits e neurônios da placa de vários poços para o mea, a fim de realizar a estrutura 3D após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência computacional explorarem como a conectividade de rede pode moldar a dinâmica de rede emergente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir uma rede neuronal tridimensional in vitro acoplada a micro matrizes de eletrodos.