Name: 3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprenda a cultivar condrócitos articulares em hidrogéis 3D biomiméticos para engenharia de cartilagem humana. Este método permite expandir e maturar células mantendo sua fisiologia e fenótipo nativos.

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Os autores gostariam de agradecer ao Departamento de Cirurgia Ortopédica de Stanford e ao Stanford Coulter Translational Seed Grant pelo financiamento. J.H.L. gostaria de agradecer à National Science Foundation Graduate Fellowship e à DARE Doctoral Fellowship pelo apoio.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações dos sujeitos Stanford University Humanos e aprovado protocolo Institutional Review Board. 1. Articular condrócitos Isolamento <ol><li> Obter cartilagem a partir de tecido descartado durante artroplastia total do joelho e dissecar como descrito anteriormente 8. </li><li> Visualmente seleccionar os côndilos femorais mediais ou laterais de amostras de cartilagem de superfícies lisas e fazer incisão na superfície da cartilagem por meio de um bisturi de forma a remover as biópsias 4-5 mm de cartilagem sem afectar o osso subcondral. </li><li> Isolar condrócitos a partir da matriz extracelular por dissociação enzimática do tecido com tratamento / N O com colagenase purificados. Use proporção 1: 1 de colagenase II (125 U / ml) e a colagenase IV (160 U / mL) em meio de crescimento de condrócitos a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, filtra-se o tecido digerido contendo as células dissociadas através de uma 70mm tamanho dos poros da malha de nylon. Lavar duas vezes com 20 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 5 min. </li><li> Placa os condrócitos isoladas a uma densidade de 1 x 10 6 células / 60 mm prato de cultura a seguir re-suspensão em meio DMEM / F12 suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 25 ug / ascorbato mL, 2 mM de L-glutamina, antimicrobianos (100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,25 ug / ml de fungizona). Manter as placas a 37 ° C e manter as culturas de condrócitos primários como uma monocamada de alta densidade antes da encapsulação em hidrogéis biomiméticos. </li></ol> 2. Biomimético Hidrogel Fabrication NOTA: Este método permite a síntese de um hidrogel biomimética contendo poli (etileno-glicol diacrilato) (PEGDA, PM 5000 g / mol), sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) em DPBS. A adição de foto-iniciador de reticulação permite fotoactivado. A composição de hidrogel final contém 7% pesart / volume (w / v) de PEGDA, 3% w / v de CS-MA, e 0,05% w / v do foto-iniciador. <ol><li> Sintetizar CS-MA por funcionalização polímero CS com grupos de metacrilato. <ol><li> Preparar uma solução tamponada de 50 mM de ácido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) 0,5 M e cloreto de sódio (NaCl) por dissolução de 1,952 g de MES e 5,84 g de NaCl em 200 ml de água desionizada (DIH 2 O). Dissolve-se 5 g de sal de sulfato de condroitina de sódio na solução tamponada. </li><li> Adicionar 0,532 g (4,62 mmol) de N-hidroxissuccinimida (NHS) e 1,771 g (9,24 mmol) de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) (proporção molar de NHS: EDC = 1: 2) para a solução e agita-se durante 5 min. </li><li> Adicionar 0,765 g (4,62 mmol) de metacrilato de 2-aminoetilo (AEMA) (proporção molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) à solução e manter a reacção à temperatura ambiente durante 24 h. </li><li> Purifica-se a mistura através de diálise contra água desionizada (DIH 2 O) durante 4 dias, utilizando tubagem de diálise (MWCO de 12-14 kDa). </li><li> Filtra-se a purified solução através de um filtro de 0,22 um e coloque os tubos abertos contendo a solução no exsicador de vácuo e S / N. Assegurar que todos os tubos são protegidas da luz. Armazenar o polímero dissolvido à temperatura de -20 ° C ao abrigo da luz e humidade. </li></ol></li></ol> Encapsulation 3. celular <ol><li> Autoclave o filme e cilíndricas hastes de PCR (para perfurar os hidrogéis 3D de células-laden) e esterilizar o molde gel cilíndrico feito por encomenda por submersão em 0,2 m filtrada 70% de etanol em cultura de tecidos capô sob luz UV. </li><li> Fecha-se o fundo do molde de gel com película de PCR autoclavado sem bolhas de ar ou aberturas para evitar a fuga. Mantê-lo em um estéril placa de 150 mm. </li><li> O dia antes da encapsulação de células em hidrogel biomimética, dissociar a condrócitos de monocamada de alta densidade com tratamento / N O em colagenase II e solução de colagenase IV. Use 125 U / ml para a colagenase II e 160 U / ml de colagenase para cada VI em meios de crescimento de condrócitosa 37 ° C. </li><li> Tomar um tubo de 50 ml e adicionam-se 5% em peso / volume (w / v) (diacrilato de etileno-glicol) poli (PEGDA, PM = 5.000 g / mol), 3% w / v de sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA), e 0,05% w / v fotoiniciador em DPBS. Vortex do tubo para misturar a solução e mantê-lo de lado. Proteger o tubo de luz. </li><li> Recolher as células dissociadas num tubo Falcon de 50 ml, contar e centrifugar a 460 xg durante 5 min. Aspirar todo o material da tubo de células e adicionar o material de gel misturado acima para re-suspender as células a uma densidade de 15 x 10 6 células / ml. Misturá-lo 30 vezes completamente, evitando a formação de bolhas de ar. </li><li> Pipetar 72 ul da suspensão de células de hidrogel ou hidrogel sozinho para dentro do molde de gel cilíndrico feito por encomenda e induzir a gelificação por exposição à luz UV (365 nm de comprimento de onda) a 3 mW / m 2 durante 5 min. Prepare alguma solução de hidrogel sem conteúdo celular. Use essas construções como controlos negativos para o futuro de testes bioquímicos e mecânica. Measure a intensidade da luz UV com um medidor de intensidade da radiação UV. Para ajustar a intensidade, alterar a distância entre a fonte de luz UV e o andaime hidrogel durante a gelificação. Observação: Uma vez que o hidrogel contém CS, a contribuição acelular é subtraído do conteúdo de GAG ​​bioquímica dos hidrogéis de células carregadas para representar apenas o GAG celular. </li><li> Use um bisturi para cortar o filme para fácil peel off e com cuidado remova-o. Com a ajuda das hastes cilíndricas, empurrar para fora do gel para uma placa de 6 poços com 5 ml de DPBS estéril para lavar gel não polimerizado e células soltas. </li><li> Cultura os hidrogéis de células carregadas em placas de 24 poços contendo 1,5 mL de meio de crescimento de condrócitos em cada poço. Usar uma espátula descartável para transferir os hidrogéis lavou no bem. </li><li> Avaliar a viabilidade celular por mortos vivem coloração 24 horas pós-encapsulamento usando um kit de viabilidade / citotoxicidade. Cultura os hidrogéis de células-laden e os hidrogéis vazios para 3-6 semanas mudando para gro de condrócitos frescoswth mídia a cada 2 dias antes da colheita para as análises. </li></ol> 4. RNA Extração e Análise de Expressão Gênica <ol><li> Aspirar cuidadosamente a mídia e colocar estéril PBS 1X na célula-laden, bem como os hidrogéis de controle vazios. </li><li> Com a ajuda de uma espátula estéril, transferir cada um hidrogel a um tubo eppendorf de 1,5 ml limpo e adicionar 250 ul de Tri-reagente a cada tubo. Siga as instruções do fabricante para isolar RNA. </li><li> Após o isolamento de RNA e quantificação utilização de 1 ug de cada amostra que e efectuar uma transcrição invertida em ADNc utilizando o High Capacity cDNA Kit de Transcrição Reversa. </li><li> Para PCR quantitativo usar TaqMan Gene Expression Arrays para exame da expressão de seus genes de interesse. Normalizar os níveis de expressão do gene de GAPDH internamente. </li><li> Para as condições de PCR incluem a 2 min de incubação a 50 ° C para inactivar amplicões anteriores com glicosilase de uracilo de ADN, seguido por um 1060; min de incubação a 95 ° C para activar a polimerase de Taq. Em seguida, executar ciclos de PCR quarenta, que consistem de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. </li></ol> 5. As análises bioquímicas <ol><li> Para cada estruturas celulares de hidrogel quantificar DNA e glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) produção como acompanhamento. </li><li> Aspirar cuidadosamente a mídia e colocar estéril PBS 1X na célula-laden, bem como os hidrogéis de controle vazios. Pesar um tubo vazio e colocar o hidrogel dentro após a secagem-lo em papel de seda e registrar o peso ou peso úmido dos hidrogéis. </li><li> Congelar cada hidrogel à temperatura de -20 ° C em um tubo Eppendorf de 1,5 ml separado para a digestão enzimática e depois usar-se uma alíquota do produto digerido a executar ensaio de Picogreen (para o DNA) e dimetil-metileno ensaio de azul (por GAG). </li><li> Preparar a solução de papainase por digestão enzimática dos hidrogéis. <ol><li> Primeiro prepare o tampão PBE por pesando 7,1 g de sódio phosphate dibico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g do ácido etilenodiaminotetracético, sal dissódico (EDTA-Na2). Dissolver em 500 ml de dH 2 O, ajustar o pH para 6,5 e a solução purificada filtrar através de um filtro de 0,22 mm. </li><li> Dissolve-se 0,035 g de L-cisteína em 20 ml de tampão de PBE. Filtra-se a solução e 100 ul de enzima papaína estéril. </li></ol></li><li> Quando estiver pronto para realizar os ensaios, levar os tubos de -20 ° C e adicionar 300 ul da solução de papaína pronto para os hidrogéis congelados. Esmagar o gel com um almofariz e pilão e misture bem com o pilão motor. </li><li> Levar o volume para 500 ul com solução de papaína adicional. Realizar o mesmo procedimento para os geles de controlo. Incubar a 60 ° C durante 16 horas 3,9. A solução contendo o hidrogel pode digerido por conseguinte, utilizados para quantificação de ADN e de GAG. Medir o teor de ADN, utilizando o ensaio de Picogreen com fago lambda de ADN como padrão seguinte PR do fabricanteotocol. </li><li> Quantificar o conteúdo sulfatada-GAG utilizando o azul 1,9-dimetilmetileno (DMMB) ensaio de ligação de corante com sulfato de condroitina tubarão como padrão 10. Determinar o teor de GAG ​​dividindo-se a quantidade de GAG ​​para o peso húmido correspondente. </li></ol> 6. Ensaios Mecânicos <ol><li> Realizar ensaios de compressão simples, utilizando um Instron 5944 sistema de testes equipada com uma célula de carga de 10 N. <ol><li> Depois dos dias desejados de cultura in vitro, execute o teste de compressão no cadafalso célula-hidrogel e os hidrogéis de controle acelular. </li><li> Submergir as amostras em um banho de PBS à temperatura ambiente e comprimir a uma taxa de 1% de deformação / seg para uma tensão máxima de 15% 11,12 desde o esforço fisiológico experimentado por tecido de cartilagem sob condições de carga tem sido relatada como sendo de 10-20% 13,14. </li></ol></li><li> Criar estresse vs. curvas de tensão e ajuste de curva usando uma equação polinomial de terceira ordem. Determinar os comprmódulo tangente essive partir da curva de ajuste equação em valores de deformação de 15%. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Conforme relatado no presente protocolo, os hidrogéis 3D são capazes de manter condrócitos fenótipo na cultura, evitando o processo de desdiferenciação celular em células fibrocartilagem normalmente encontrados com culturas em monocamada 15. Além disso, as culturas a longo prazo do construto hidrogel chondrocytes- revelou um ambiente favorável que mantém as características intrínsecas de células associadas com a idade e a doença. A utilização de um hidrogel biomimética 3D tem várias vantagens. Em primeiro lugar, a inclusão de sulfato de condroitina (CS), um componente principal encontrado na cartilagem articular, permitir que as células de degradar a matriz de hidrogel através da secreção de condroitinase e deitou-se cartilagem recém-sintetizado extra-celular da matriz 5, 16. Além disso, o CS foi mostrado que têm propriedades anti-inflamatórias nas articulações artríticas. O hidrogel biomimética também pode ser utilizado como um material de andaimes para entrega em células de reparação de cartilagem, e podem ser quimicamente modificadospara facilitar uma melhor integração 17,18 tecido-biomaterial. A utilização de hidrogeles de PEG-CS permite culturas a longo prazo de condrócitos e a avaliação das propriedades bioquímicas e mecânicas. Aqui mostramos como esta plataforma pode ser útil para as análises comparativas de diferentes fontes de condrócitos diferenciados, a fim de definir o tipo celular ideal para a engenharia de cartilagem. Curiosamente, condrócitos encapsulados em hidrogéis permanecer viável e proliferam de acordo com as suas capacidades intrínsecas. Os suportes composição de hidrogel, na verdade, o crescimento de jovens e adultos condrócitos saudáveis, como mostrado na Figura 2. A composição e estrutura dos hidrogeles descritos também promove a formação de tecido de cartilagem, como indicado pela deposição de uma matriz extracelular funcional avaliada por glicosaminoglicano (GAG ) quantificação. Uma vantagem adicional é que as construções de condrócitos-hidrogelpode ser avaliada para as propriedades mecânicas do tecido de cartilagem recém-formado. Note-se que o ensaio de compressão simples deve ser executada no hidrogel acelular para comparação. Os hidrogeles, de facto, tem uma rigidez intrínseca devido à rigidez das porções CS. Estirpe compressão simples de 5-20% (a uma velocidade de deformação de 1% / s) podem ser aplicados para o teste mecânico de tecido de cartilagem 11,12 desde o esforço fisiológico experimentado por tecido de cartilagem sob condições de carga tem sido relatada como sendo 10-20 % 13,14. A resposta de ambos célula de carga e acelulares hidrogéis ao teste mecânico foi avaliada no ponto final da cultura. No exemplo descrito acima, observou-se uma rigidez comparável das construções contendo adulto e juvenil condrócitos em contraste com a rigidez mais baixa das construções contendo condrócitos OA. Tais propriedades mecânicas da construção de células-hidrogel permitem a avaliação das propriedades funcionais dotecido formado dando uma análise aprofundada da capacidade maturação celular. Em conclusão, a utilização dos hidrogeles biomiméticos 3D para estudar o potencial de diferente população de condrócitos para gerar tecido de cartilagem pode ser amplamente aplicada. Além dos estudos in vitro descrito aqui, o transplante in vivo das construções de células-carga pode ser concebido para estudar a maturação de células e o potencial regenerador no contexto fisiológico. Outras modificações da plataforma de hidrogel com factores adicionais biomiméticos também pode ser prevista para optimizar a proliferação de condrócitos e maturação.

Com seu potencial limitado de auto-reparo, a cartilagem articular humana sofre danos irreversíveis frequentes. Atualmente, esforços extensivos estão focados no desenvolvimento de abordagens eficientes baseadas em células para o tratamento de lesões da cartilagem articular. O sucesso dessas terapias baseadas em células é altamente dependente da seleção de uma fonte celular ideal e da manutenção de seu potencial regenerativo. Os condrócitos são uma fonte celular comum para o reparo da cartilagem, mas são limitados em oferta e podem se desdiferenciar durante a expansão in vitro em cultura de monocamada 2D, limitando assim sua geração de cartilagem hialina 1. 
O objetivo deste protocolo é estabelecer uma plataforma de hidrogel tridimensional para um estudo comparativo in vitro de condrócitos humanos de diferentes idades e estados de doença. Ao contrário da cultura bidimensional convencional (2D), os hidrogéis tridimensionais (3D) permitem que os condrócitos mantenham sua morfologia e fenótipo e fornecem um ambiente fisiologicamente relevante que permite que os condrócitos produzam tecido cartilaginoso 2,3. Além de fornecer uma estrutura física 3D para a cultura de condrócitos, os hidrogéis imitam a função da matriz extracelular (MEC) da cartilagem nativa. Especificamente, a inclusão de metacrilato de sulfato de condroitina fornece um reservatório potencial para fatores parácrinos secretados 4 e permite a degradação mediada por células e a renovação da matriz 5. Embora muitos sistemas de cultura de hidrogel 3D tenham sido amplamente utilizados em vários estudos, incluindo géis de agarose e alginato, usamos um sistema de cultura 3D biomimético que tem algumas vantagens distintas para a cultura de condrócitos. O sulfato de condroitina (CS) é um componente abundante na cartilagem articular e os hidrogéis PEG-CS demonstraram manter e até aumentar o fenótipo condrogênico e facilitar a degradação e renovação da matriz mediada por células 2,5. Além disso, as propriedades mecânicas do andaime de hidrogel podem ser facilmente moduladas pela mudança da concentração de PEG e, portanto, podem ser utilizadas para aumentar ainda mais o potencial de regeneração dos condrócitos ou de um tipo de célula relacionado 6,7. O PEG/CSMA também é biocompatível e, portanto, tem potencial para uma aplicação clínica direta em defeitos de cartilagem, por exemplo. A limitação para este sistema é sua complexidade e o uso de fotopolimerização que pode potencialmente afetar a viabilidade celular em comparação com sistemas mais simples como a agarose, no entanto, as vantagens para a cultura de condrócitos superam as limitações potenciais.
A cultura de hidrogel 3D é compatível com o ensaio convencional para avaliação do fenótipo celular (expressão gênica, imunocoloração de proteínas) e resultado funcional (quantificação da produção de matriz de cartilagem, testes mecânicos). Este ambiente 3D favorável foi testado para comparar o potencial de regeneração tecidual de condrócitos humanos de três populações de idades diferentes em culturas 3D de longo prazo. 
Os resultados foram avaliados por meio de ensaios fenotípicos e funcionais. Condrócitos juvenis, adultos e OA apresentaram respostas diferenciais na cultura de hidrogel biomimético 3D. Após 3 e 6 semanas, a expressão gênica condrogênica foi regulada positivamente em condrócitos juvenis e adultos, mas foi regulada negativamente em condrócitos OA. A deposição de componentes do tecido cartilaginoso, incluindo agrecan, colágeno tipo II e glicosaminoglicano (GAG), foi alta para condrócitos juvenis e adultos, mas não para condrócitos OA. Os módulos compressivos das construções de cartilagem resultantes também exibiram tendências semelhantes. Em conclusão, tanto os condrócitos juvenis quanto os adultos exibiram disposição condrogênica e da matriz cartilaginosa até 6 semanas de cultura 3D em hidrogéis. Em contraste, os condrócitos osteoartríticos revelaram uma perda do fenótipo da cartilagem e capacidade mínima de gerar cartilagem robusta.

<table><tbody><tr><td>condrócitos juvenis (sistema celular de condrócitos humanos normais clônicos</td>) <td>Condrócitos adultos Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>(sistema celular de condrócitos humanos normais clonéticos)</td><td></td><td></td> Poli <td></td></tr><tr><td>(diacrilato de etilenoglicol)</td> <td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2-morfolinoetanossulfônico</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>fotoiniciador</td><td>Irgacure&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>sal de sulfato de condroitina sódica&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida&nbsp;</td><td></td><td></td> Cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida Sig 130672 <td></td></tr><tr><td></td><td>ma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoetil metacrilato</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>tubo de diálise</td><td>Spectrum Laboratories&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase 2</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>Colagenase 4</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>mídia DMEM/F12</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ensaio vivo/morto</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri reagente</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de Ensaio</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimetiletileno azul&nbsp;</td>Equipamento de luz UV <td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- XX-15LW Lâmpada de Bancada, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de teste Instron 5944</td><td>Corporação Instron</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d hidrogel andaimes para articular de condrócitos cultura e geração de cartilagem

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

A cartilagem articular humana é altamente suscetível a danos e tem potencial limitado de auto-reparo e regeneração. Estratégias baseadas em células para projetar o tecido cartilaginoso oferecem uma solução promissora para reparar a cartilagem articular. Para selecionar a fonte celular ideal para o reparo tecidual, é importante desenvolver uma plataforma de cultura apropriada para examinar sistematicamente as diferenças biológicas e biomecânicas na cartilagem de engenharia de tecidos por diferentes fontes celulares. Aqui, aplicamos uma plataforma de cultura de hidrogel biomimético tridimensional (3D) para examinar sistematicamente o potencial de regeneração da cartilagem de condrócitos juvenis, adultos e osteoartríticos (OA). O hidrogel biomimético 3D consistiu no componente sintético poli(etilenoglicol) e no componente bioativo sulfato de condroitina, que fornece um microambiente fisiologicamente relevante para o cultivo in vitro de condrócitos. Além disso, o andaime pode ser potencialmente usado para entrega de células para reparo de cartilagem in vivo. O tecido cartilaginoso projetado no andaime pode ser avaliado usando expressão gênica quantitativa, coloração por imunofluorescência, ensaios bioquímicos e testes mecânicos. Utilizando esses resultados, fomos capazes de caracterizar o potencial regenerativo diferencial de condrócitos de idades variadas, tanto no nível de expressão gênica quanto nas propriedades bioquímicas e biomecânicas do tecido cartilaginoso projetado. O modelo de cultura 3D pode ser aplicado para investigar as diferenças moleculares e funcionais entre condrócitos e células progenitoras de diferentes estágios de desenvolvimento normal ou aberrante.

Hidrogéis bioactivos contendo PEG e porções CS (Figura 1) representam uma plataforma ideal para a cultura e maturação de condrócitos articulares humanos 2,3,5,7. Os condrócitos a partir de diferentes idades e estados de doença podem ser cultivadas com o método descrito e analisado para o seu fenótipo, a expressão do gene e propriedades bioquímicas e mecânicas do tecido de cartilagem gerado. Três amostras de condrócitos, juvenile- 6 meses, adulto-34 anos e 74 anos osteoarthritic-, foram colhidos após 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Análises de condrócitos normais, tanto adulto e juvenil expressão de genes, apresentaram um aumento na expressão dos genes de condrócitos COL2A1 e COL6A1. Pelo contrário, os condrócitos doentes apresentaram uma diminuição dramática no COL2A1 enquanto se mantinha a expressão de COL6A1 (Figura 2) mostra uma perda de fenótipo condrogénica apesar de ser cultivadas num ambiente biomimética favorável. Os hidrogeles de PEG-CS também servir como um ambiente dinâmico para os condrócitos a proliferar, digerir a matriz pré-existente de PEG e CS e depositar sua matriz pericelular e extracelular, os principais componentes do tecido de cartilagem madura. Tendo em conta estas qualidades, a expansão de condrócitos após 3 semanas de cultura in vitro pode ser estimada pela quantificação de ADN com o corante Picogreen. A análise comparativa dos três grupos de células demonstram que a densidade de populações de células juvenis e adultas foi inalterada enquanto os condrócitos OA exibiram uma diminuição dramática em comparação com o dia 1 de cultura. A perda de teor de ADN foi também observado por OA mas não outros condrócitos sugerindo a possibilidade de a morte das células durante a cultura a longo prazo (Figura 3). A matriz segregada foi quantificada como teor de GAG ​​sulfatado-por ensaio de ligação de corante DMMB na fase de ponto final após 3 semanas de cultura. MORDAÇA conteúdo é normalizada pelo peso úmido do hidrogel como recorDED antes da digestão enzimática e da contribuição acelular é subtraído. Como mostrado na Figura 4, os condrócitos depositada uma quantidade significativa de GAG semelhante durante 3 semanas de cultura em hidrogéis 3D. A presença de uma estrutura de suporte físico permite a avaliação de propriedades biomecânicas das amostras não confinada por meio de ensaios de compressão 2,3. Embora os hidrogéis acelulares submetido a um decréscimo na módulos de compressão, as construções de células-mantida em carga os módulos de compressão ao fim de 3 semanas em cultura (Figura 4). O fenotípica, análises bioquímicas e biomecânicas aqui descritas são, portanto, úteis para avaliar e compreender o potencial de diferentes populações de condrócitos para a cartilagem de engenharia. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Figura 1. PEG-CS hidrogéis biomiméticos para condrócitos cul 3Dtura. Os condrócitos são ressuspensas numa mistura que contém o poli (etileno glicol diacrilato) (PEGDA) e sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) e fundido para dentro do molde de gel cilíndrico feito por encomenda. Após a exposição UV, solidificou géis são recolhidos a partir dos moldes e viabilidade celular é avaliada por coloração morto ao vivo 24 horas pós-encapsulamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Figura 2. Expressão de genes condrogênicos em condrócitos humanos cultivados em hidrogéis biomiméticos 3D. Quantitativa de expressão do gene COL2A1 marcadores da cartilagem e COL6A1 por juvenis, adultos e OA condrócitos após 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Os valores são normalizados para o nível expressão gênica no dia 1. Erro bars representam a média ± SD. * p &lt;0,05, conforme determinado por um teste t de Student bicaudal. Modificado de Smeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Figura 3. teor de ADN em condrócitos humanos cultivados em hidrogéis biomiméticos 3D. Quantificação por ensaio de ADN Picogreen em juvenis, adultos e OA condrócitos após 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Os valores são normalizados para nível DNA no dia 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Figura 4. GAG medição de conteúdo e teste de compressão simples de condrócitos humanos no dia 1 e depois de 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. (A) GAG quantificação por ensaio DMMB em condrócitos no dia 1 e depois de 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Os valores são normalizados para molhar peso (ww) e expressos como ug / g. (B) módulo de compressão (kPa) de acelular e celulares carregados de hidrogéis no dia 1 e depois de 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar um cultivo tridimensional em hidrogel biomimético para expandir condrócitos articulares e gerar cartilagem articular humana. Isso é realizado primeiramente dissecando os côndilos femorais obtidos por artroplastia total do joelho, removendo o tecido cartilaginoso do osso subcondral e isolando os condrócitos da matriz extracelular por dissociação enzimática. O segundo passo é sintetizar o polímero de sulfato de condroitina metacrilatado para a fabricação de um hidrogel biomimético.Em seguida, os condrócitos são encapsulados em hidrogéis biomiméticos tridimensionais, e os constructos são cultivados por três a seis semanas in vitro. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram o crescimento e a maturação de condrócitos articulares por meio de testes bioquímicos e mecânicos. A principal vantagem do uso de uma plataforma tridimensional biometríca de hidrogel para o cultivo de condrócitos é que ela fornece um microambiente fisiologicamente relevante, pois incorpora os componentes nativos da cartilagem.Essa é a vantagem de que os condrócitos podem manter sua fisiologia e fenótipo por um período mais longo. A inclusão de um polímero bioativo, o revestimento de condroitina na hidrogel tridimensional, permite a mediação de métricas e renovação da degradação pelos condrócitos. Além disso, as propriedades mecânicas e bioquímicas da matriz hidrogel podem ser facilmente modificadas.Esta técnica é compatível com ensaios convencionais para avaliar o fenótipo celular e o resultado funcional. Pode ser utilizada para estudar características intrínsecas dos condrocitos associadas a estágios avançados da doença e para avaliar a maturação celular e o potencial regenerativo em um contexto fisiológico. Para iniciar, prepare o meio de dissociação combinando uma parte de colagenase dois a 125 unidades por mililitro com uma parte de colagenase quatro a 160 unidades por mililitro no meio de crescimento para células CHO, utilizando tecido cartilaginoso fresco que normalmente é descartado durante uma artroplastia total do joelho.Utilize um bisturi estéril e remova uma biópsia da superfície lisa de um dos côndilos femurais. Em seguida, corte a biópsia em fatias finas. Adicione as fatias de cartilagem ao meio de dissociação combinado numa proporção de um para três em volume e coloque a placa a 37 graus Celsius durante a noite para liberar os cois do matriz extracelular no dia seguinte.Filtre o tecido digerido contendo as células dissociadas através de uma malha de náilon com poros de 70 micrômetros. Em seguida, lave as células duas vezes com 20 mililitros de D-M-E-M-F 12 pré-aquecido, meio de cultura, e centrifugue as células a 600 G durante cinco minutos. Depois, conte os condrócitos isolados em uma placa de hemocitômetro.1 milhão de células em uma placa de cultura de 60 milímetros e cobrir com meio D-M-E-M-F 12 suplementado. Manter as culturas primárias de choy como uma monocamada de alta densidade seguindo técnicas de cultivo padrão. Sintetizar sulfato de condroitina metacrilato adicionando 1,952 gramas de ácido dois morf et etano sul, e 5,84 gramas de cloreto de sódio em 200 mililitros de água deionizada e agitar a solução até dissolução completa.Em seguida, dissolva cinco gramas de sal sódico de sulfato de condroitina na solução tamponada. Então, adicione 0,532 gramas de N-hidroxissuccinimida e 1,771 gramas de cloreto de etilcarbodiimida N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) à solução e agite por cinco minutos. Após completa dissolução, adicione 0,765 gramas de metacrilato de 2-aminoetila à solução e mantenha a reação à temperatura ambiente por 24 horas, coberta com papel alumínio.Realize a purificação da mistura final por diálise contra água desionizada durante quatro dias, utilizando tubos de diálise com corte de peso molecular de 12 a 14 quilodaltons. Em seguida, filtre a solução purificada através de um filtro de 0,22 mícrons e congele a menos 20 graus Celsius. Coloque os tubos abertos contendo a solução em um dessecador.Proteja-os da luz cobrindo com papel alumínio e aplique vácuo durante a noite. Armazene o polímero dissolvido a menos 20 graus Celsius em tubos Falcon, envolvidos com filme plástico e papel alumínio para proteger da luz e da umidade no dia anterior à encapsulação celular. Remova o meio de cultura dos cítos cultivados e cubra as células com meio de dissociação.Incube as células na solução de colagenase durante a noite a 37 graus Celsius. Autoclave o filme PCR e as hastes cilíndricas e, em seguida, esterilize o molde cilíndrico personalizado para gel submergindo-o em etanol 70% filtrado em filtro de 0,2 mícron, colocado dentro de uma cabine de cultura tecidual sob luz UV durante a noite. No dia seguinte, remova os moldes do etanol e deixe-os secar dentro da cabine de cultura tecidual. Em seguida, coloque o molde em uma placa estéril de 150 milímetros. Após a secagem, feche a base dos moldes utilizando filme PCR autoclavado.Evite bolhas de ar ou espaços para prevenir vazamentos. Em seguida, pegue um tubo de 50 mililitros e adicione 10% do metacrilato de condroitina sulfato preparado, 10% de diacrilato de polietileno glicol e 5% peso por volume. Iniciador fotossensível em DPBS para uma concentração final de 3% a 5% e 0,05%, respectivamente.Proteja o tubo da luz e agite brevemente a mistura em vórtex. Colete as células dissociadas em um tubo cônico de 50 mililitros e conte-as utilizando um hemocitômetro. Pelize as células a 460 × g durante cinco minutos e ressuspenda-as no material de gel misto numa densidade de 15 milhões de células por mililitro.Agite a solução 30 vezes, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas. Em seguida, pipete 72 microlitros da suspensão celular em hidrogel ou do hidrogel isolado para dentro do molde cilíndrico personalizado. Induza a gelificação expondo os géis à luz UV de 365 nanômetros a três miliwatts por metro quadrado durante cinco minutos.Uma vez gelificada, use um bisturi para cortar o filme e removê-lo cuidadosamente. Com a ajuda das hastes cilíndricas, empurre o gel para uma placa de seis poços contendo cinco mililitros de DPBS estéril para remover qualquer gel não polimerizado remanescente e células soltas. Em seguida, transfira os hidrogéis lavados para os poços de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitro de meio de crescimento Chondra site em cada um.Incube bem os hidrogéis a 37 graus Celsius e troque o meio a cada dois dias. Avalie a viabilidade celular por meio de coloração de células vivas e mortas 24 horas após a encapsulação, utilizando técnicas padrão de cultura, os hidrogéis contendo células e os hidrogéis vazios por três a seis semanas antes da colheita e análise. Após o número desejado de dias de cultura in vitro, remova as amostras do incubador para realizar o teste de compressão no suporte de hidrogel celular e nos hidrogéis controle acelulares.Coloque as amostras, uma de cada vez, em temperatura ambiente, sobre o banho de PBS acoplado a um sistema de testes mecânicos equipado com uma célula de carga de 10 Newton, e comprima a uma taxa de 1% de deformação por segundo até uma deformação máxima de 15%. Para analisar os testes mecânicos, crie curvas de tensão versus deformação para cada amostra e realize o ajuste da curva. Utilizando uma equação polinomial de terceira ordem, determine o módulo tangente compressivo a partir da equação do ajuste da curva nos valores de deformação de 15% após três semanas de cultivo. Em hidrogéis biomiméticos tridimensionais, a análise de expressão gênica de condrócitos normais, tanto juvenis quanto adultos, mostrou um aumento na expressão dos genes de condrócitos colágeno dois A um e colágeno seis A um. Em contrapartida, condrócitos doentes exibiram uma diminuição acentuada no colágeno dois A um, mantendo a expressão do colágeno seis A um, demonstrando uma perda do fenótipo condrogênico, mesmo quando cultivados em um ambiente biomimético favorável.A expansão de condrócitos após três semanas de cultivo pode ser estimada pela quantificação do DNA com o corante pico green. A análise comparativa dos três grupos de células mostra que a densidade celular das populações juvenil e adulta permaneceu inalterada, enquanto os condrócitos osteoartríticos exibiram uma diminuição acentuada em comparação com o dia um do cultivo. A matriz de condrócitos secretada foi quantificada como conteúdo de GAG sulfatado após três semanas de cultivo.Como mostrado aqui, os condrócitos depositaram uma quantidade significativa de GAG durante três semanas de cultivo, o que pode ter contribuído para a melhoria das propriedades mecânicas dos hidrogéis carregados com células em comparação com os controles. Além de aplicar este procedimento em estudos individuais, o modelo de cultivo em hidrogel biomimético tridimensional pode ser facilmente adaptado a um modelo de defeito cartilaginoso de espessura total, para caracterizar os resultados funcionais e bioquímicos na regeneração articular de longo prazo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar condrócitos humanos de espécimes articulares do joelho e produzir scaffolds tridimensionais em hidrogel para cultivo de condrócitos e geração de implantes em longo prazo. A utilização dos hidrogéis 3D OME permitirá a nós e a outros pesquisadores comparar o potencial condrogênico de diferentes populações de condrócitos maduros, bem como de novas populações de células-tronco e progenitoras.No futuro, essas técnicas podem ser ampliadas para incorporar fatores miméticos adicionais, com o objetivo de formular um suporte ideal que possa ser utilizado para regeneração e reparo da cartilagem.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Os métodos descritos neste trabalho mostram como converter uma impressora jato de tinta comercial em um bioprinter com polimerização UV simultânea. A impressora é capaz de construir a estrutura do tecido 3D com células e biomateriais. O estudo demonstrou aqui construiu uma neocartilage 3D.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Engenharia e análise de tecidos de suporte de carga com populações de células heterogêneas ainda são um desafio. Aqui, descrevemos um método para criar discos de hidrogel de alginato em duas camadas como uma plataforma para co-cultura de diversas populações de células dentro de uma construção.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Aqui nós descrevemos uma preparação superficial de hidrogel injetável à base de quitosana usando química imina dinâmico. São apresentados métodos para ajustar a força mecânica do hidrogel e sua aplicação em cultura de células 3D.

Preparação do hidrogel injetável à base de quitosana e sua aplicação em cultura de células 3D

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Fornecemos métodos detalhados para gerar quatro tipos de tecidos a partir de células-tronco mesenquimais humanas, que são usadas para recapitular a cartilagem, osso, coxim gorduroso e sinóvia na articulação do joelho humano. Esses quatro tecidos são integrados em um biorreator personalizado e conectados através de microfluídica, gerando assim uma articulação do joelho em um chip.

Criação de uma articulação do joelho em um chip para modelagem de doenças articulares e testes de medicamentos

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Aprenda a cultivar condrócitos articulares em hidrogéis 3D biomiméticos para engenharia de cartilagem humana. Este método permite expandir e maturar células mantendo sua fisiologia e fenótipo nativos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

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