3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma cultura de hidrogel biomimético 3D para expandir os condrócitos articulares e gerar cartilagem articular humana. Isso é feito dissecando primeiro os côndilos femorais obtidos da artroplastia total do joelho, removendo o tecido cartilaginoso do osso subcondral e isolando os condrócitos da matriz extracelular por dissociação enzimática. O segundo passo é sintetizar sulfato de condroitina, polímero de metacrilato para a fabricação de um hidrogel biomimético.

Em seguida, os condrócitos são encapsulados nos hidrogéis biomiméticos 3D e as construções são cultivadas por três a seis semanas in vitro. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o crescimento e a maturação dos condrócitos articulares usando testes bioquímicos e mecânicos. A principal vantagem de utilizar uma plataforma de hidrogênio biométrico 3D para cultura de condrócitos é que ela fornece um microambiente fisiologicamente relevante porque incorpora os componentes nativos da cartilagem.

Esta é a vantagem de que os condrócitos podem manter sua fisiologia e fenótipo por um longo período de tempo. A inclusão de um polímero bioativo, a superfície da condroitina no hidrogel matic tridimensional permite métricas mediadas por condrócitos, renovação de degradação. Além disso, as propriedades mecânicas e bioquímicas da matriz de hidrogel podem ser facilmente modificadas.

Esta técnica é compatível com ensaios convencionais para avaliar o fenótipo celular e o resultado funcional. Pode ser usado para estudar características intrínsecas de condrócitos associadas ao estágio antigo da doença e para avaliar a maturação celular e o potencial regenerativo em um contexto fisiológico. Para começar o meio de dissociação preparado, combinando uma parte de colagenase dois a 125 unidades por mililitro com uma parte de colagenase quatro a 160 unidades por mililitro em meio de crescimento choy, usando tecido de cartilagem fresco que normalmente é descartado durante uma artroplastia total do joelho.

Pegue um bisturi estéril e remova uma biópsia da superfície lisa de um dos condiss femorais. Em seguida, raspe a biópsia em fatias finas. Adicione as fatias de cartilagem ao meio de dissociação combinado em uma proporção de um a três por volume e coloque o prato a 37 graus Celsius durante a noite para liberar os choys da matriz extracelular no dia seguinte.

Filtre o tecido digerido contendo as células dissociadas através de uma malha de nylon de tamanho de poro de 70 mícrons. Em seguida, lave as células duas vezes com 20 mililitros de D-M-E-M-F 12 pré-aquecido, médio e peletize as células a 600 G por cinco minutos. Em seguida, conte os condrócitos isolados em uma placa de citômetro he.

1 milhão de células em uma placa de cultura de 60 milímetros e cubra com meio D-M-E-M-F 12 suplementado. Mantenha as culturas primárias de choy como uma monocamada de alta densidade, seguindo as técnicas de cultura padrão. Sintetize o metacrilato de sulfato de condroitina adicionando 1,952 gramas de dois ácidos morfo eth etano sul e 5,84 gramas de cloreto de sódio em 200 mililitros de água deionizada e agite a solução até dissolver completamente.

Em seguida, dissolva cinco gramas de sal de sódio de sulfato de condroitina na solução tamponada. Em seguida, adicione 0,532 gramas de N hidroxiCIN amida e 1,771 gramas de cloridrato de etil três dimetil amino propil carbo ide à solução e agite por cinco minutos. Uma vez dissolvido, adicione 0,765 gramas de dois amino etil metacrilato à solução e mantenha a reação em temperatura ambiente por 24 horas coberta com papel alumínio.

Purifique a mistura final por diálise contra água deionizada por quatro dias, usando tubos de diálise de corte de peso molecular de 12 a 14 kilodaltons. Em seguida, filtre a solução purificada através de um filtro de 0,22 mícron e congele a menos 20 graus Celsius. Coloque os tubos abertos contendo a solução em um dessecador.

Proteja-os da luz cobrindo com papel alumínio e aplique um aspirador durante a noite. Armazene o polímero dissolvido a menos 20 graus Celsius em tubos Falcon, embrulhados com parfum e papel alumínio para proteger da luz e da umidade no dia anterior ao encapsulamento da célula. Remova o meio dos citos cultivados e cubra as células com meio de dissociação.

Incube as células na solução de colagenase durante a noite a 37 graus Celsius filme de PCR em autoclave e hastes cilíndricas e, em seguida, esterilize o molde de gel cilíndrico feito sob medida, submergindo-o em etanol a 70% filtrado a 0,2 mícron colocado dentro de uma capa de cultura de tecidos sob luz ultravioleta durante a noite no dia seguinte, remova os moldes do etanol e deixe-os secar dentro da capa de cultura de tecidos. Em seguida, coloque o molde em uma placa estéril de 150 milímetros. Depois de seco, sele o fundo dos moldes usando filme de PCR em autoclave.

Evite bolhas de ar ou lacunas para evitar vazamentos. Em seguida, pegue um tubo de 50 mililitros e adicione 10% do metacrilato de sulfato de condroitina preparado, 10% de polietilenoglicol di acrl e 5% de peso por volume. Fotoiniciador em DPBS para uma concentração final de 3%5% e 0,05%, respectivamente.

Proteja o tubo da luz e faça um vórtice breve da mistura. Colete as células dissociadas em um tubo de falcão de 50 mililitros e conte-as usando um hemocitômetro. Esfolar as células a 460 vezes G durante cinco minutos e ressuspendê-las no gel misturado a uma densidade de 15 milhões de células por mililitro.

Misture a solução 30 vezes tomando cuidado para evitar a formação de bolhas. Em seguida, pipete 72 microlitros da suspensão de hidrogel celular ou hidrogel sozinho no gel cilíndrico feito sob medida. O molde induz gelian expondo os géis à luz UV de 365 nanômetros a três miliwatts por metro quadrado por cinco minutos.

Depois de gelatinoso, use um bisturi para cortar o filme e remova-o com cuidado. Com a ajuda das hastes cilíndricas, empurre o gel para uma placa de seis poços com cinco mililitros de DPBS estéril para lavar qualquer gel não polimerizado restante e células soltas. Em seguida, transfira os hidrogéis lavados para poços de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de meio de crescimento do local Chondra em cada um.

Bem, incube os hidrogéis a 37 graus Celsius e troque o meio a cada dois dias. Avalie a viabilidade celular por coloração de mortos-vivos 24 horas após o encapsulamento usando técnicas padrão de cultura, hidrogéis carregados de células e hidrogéis vazios por três a seis semanas antes da colheita e análise. Após o número desejado de dias de cultivo in vitro, retirar as amostras da incubadora para realizar o teste de compressão no andaime de hidrogel celular e nos hidrogéis de controle acelular.

Coloque as amostras uma de cada vez à temperatura ambiente no banho PBS conectado a um sistema de teste mecânico ajustado com uma compressão de célula de carga de 10 Newton a uma taxa de 1% de tensão por segundo a uma tensão máxima de 15% Para analisar os testes mecânicos, crie curvas de tensão versus deformação para cada amostra e ajuste de curva. Usando uma equação polinomial de terceira ordem, determinar o módulo tangente compressivo a partir da equação de ajuste da curva em valores de deformação de 15% após três semanas de cultivo Em hidrogéis biomiméticos 3D a análise da expressão gênica de condrócitos normais, tanto juvenis quanto adultos, mostrou um aumento na expressão dos genes de condrócitos colágeno dois A um e colágeno seis A um. Pelo contrário, os condrócitos doentes mostraram uma diminuição dramática no colágeno dois A um, mantendo a expressão do colágeno seis A um mostrando uma perda de fenótipo congênito, apesar de serem cultivados em um ambiente biomimético favorável.

A expansão do Chocy após três semanas de cultivo pode ser estimada pela quantificação do DNA com o corante verde pico. A análise comparativa dos três grupos de células mostra que a densidade celular das populações juvenis e adultas permaneceu inalterada, enquanto os condrócitos osteoartríticos exibiram uma diminuição dramática em comparação com o primeiro dia de cultura. A matriz de condrócitos secretada foi quantificada como conteúdo de gag sulfatado após três semanas de cultivo.

Como mostrado aqui, os condrócitos depositaram uma quantidade significativa de gag durante três semanas de cultivo, o que pode ter contribuído para as propriedades mecânicas aprimoradas dos hidrogéis carregados de células em comparação com os controles. Além de aplicar este procedimento para estudos individuais, o modelo de cultura de hidrogel biomimético 3D pode ser facilmente traduzido para um modelo de defeito de cartilagem de espessura total e para caracterizar o resultado funcional e bioquímico na regeneração da cartilagem articular a longo prazo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar condrócitos humanos de espécimes articulares de joelho e produzir andaimes de hidrogênio tridimensionais para cultura de cony de longo prazo e geração de costeletas A utilização dos hidrogéis 3D OME permitirá que nós e outros pesquisadores comparemos o potencial congênito de diferentes populações de condrócitos maduros, bem como novas populações de células-tronco e progenitoras.

No futuro, essas técnicas podem ser estendidas para incorporar fatores miméticos adicionais, a fim de formular um andaime ideal que possa ser utilizado para regeneração e reparo da cartilagem.