Name: Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a estudar o transporte de lipídios pelo intestino usando células Caco-2 diferenciadas em membrana permeável. Este método inclui isolamento de lipoproteínas por ultracentrifugação e análise por microscopia eletrônica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Seed Grant Award da California Northstate University College of Pharmacy (para AMN). Os autores gostariam de agradecer à Faculdade de Farmácia da California Northstate University por cobrir o custo de publicação deste artigo e a George Talbott por sua ajuda na edição deste manuscrito.

1. A manutenção das células Caco-2 <ol><li> Usando regulares pratos de cultura de tecidos <ol><li> Descongelar as células Caco-2 a partir de um frasco congelado colocando o frasco num banho de água a 37 C °, e adicioná-los imediatamente para uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento (15% de soro bovino fetal pré-aquecido (FBS ) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM)). <ol><li> Quando as células Caco-2 atingiram 50-70% de confluência, dividi-los 1: 6 por incubação das células com 3 ml de 0,05% de tripsina / 0,53 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C até que eles são destacados (15 min) . Para evitar aglomeração de células, mistura as células várias vezes por pipetagem suave. Adicionar 0,5 ml das células tripsinizadas a uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido. </li></ol></li><li> Agite ligeiramente os pratos várias vezes para a frente e para trás seguido por uma direção para a esquerda e para a direita. Evite rodar os pratosuma vez que pode resultar numa dispersão celular desigual. </li><li> Colocar as cápsulas sobre uma superfície plana em uma incubadora a 37 ° C fornecido com 5% de CO 2. Superfícies inclinadas também podem resultar numa dispersão celular desigual. </li><li> Troque a mídia de crescimento de um dia após o início da incubação. </li><li> Monitorar as células e gravar no dia em que chegar a confluência. Isso levará cerca de uma semana para as células para alcançar confluência do dia eles estão divididos. </li><li> Mudar o meio de crescimento, duas vezes por semana antes de as células atingirem confluência. Uma vez que as células atingiram a confluência, muda os meios de crescimento a cada dois dias. Depois que as células são 7-dias pós-confluentes, alterar a mídia de crescimento diário. Nota: As células estão prontas para experiências quando eles são de 13 dias pós-confluentes (Figura 1). Uma vez que as células acabará por se tornar menos eficaz na produção de lipoproteínas, utilização de células que se encontram entre 13 a 17 dias pós-confluentes 8. Vá para a etapa 3 sobre como conduzir o experimento.</li></ol></li><li> Usando o sistema de membrana permeável <ol><li> Semente as células Caco-2 no inserto membrana permeável tal como descrito no passo 1.1.1.1. acima. Evite o uso de células a partir de um frasco congelado porque o seu crescimento celular é normalmente mais lenta (período de recuperação). Resumidamente, adicionar 0,5 ml das células tripsinizadas para a câmara de apical (compartimento superior) que contém 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido. Além disso, adicionar 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido para a câmara basolateral (compartimento inferior). Nota: Para as melhores práticas, adicione os meios de crescimento para a câmara apical primeiro e depois para a câmara basolateral. Ao remover a velha mídia, remova a mídia basolateral perante a mídia apical. Evitar picar a membrana de policarbonato, uma vez que pode romper a membrana. </li><li> Devido à visibilidade pobre célula através da membrana de policarbonato, semear as células Caco-2 em um prato de cultura de tecidos regular com densidade semelhante, e usar este prato para julgar a confluência celular. </li><li> Siga sPTE 1.1.2-1.1.6 acima. </li></ol></li></ol> 2. Gene Overexpression <ol><li> Usando a abordagem de transfecção regulares <ol><li> Semente as células Caco-2 em um prato de cultura de tecidos como descrito no 1.1.1.1.-1.1.4 supra. Nota: Quando as células são cerca de 40-50% confluentes, eles estão prontos para ser transfectada. </li><li> Adicionar 67 ul de reagente de transfecção de 472 ul de meio de soro reduzido os num tubo de microcentrífuga. Evitar o contacto do reagente de transfecção não diluída com a parede do tubo. </li><li> Adicionar 23 g de pLL3.7 reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) 9 para o reagente de transfecção / meio de soro reduzido mistura. </li><li> Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Substituir o meio de crescimento das células Caco-2 &#39;com 8 ml de 10% de FBS em meio DMEM. </li><li> Adicionar a mistura de ADN / reagente de transfecção / meio de soro reduzido, gota a gota para o prato. </li><li> Agite ligeiramente os pratos várias vezes em uma frente e badirecção ckward seguido por um sentido para a esquerda e para a direita. </li><li> Coloque o prato no 37 ° C incubadora. </li><li> Substitua a mídia no prato com 10 ml de meio de crescimento por dia após o início da incubação. </li><li> Monitorar a expressão do gene. <ol><li> Monitorar a expressão de genes sem 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) coloração. Usando um microscópio de fluorescência, determinar a percentagem de células que são verdes. A percentagem representa a eficiência da transfecção. </li><li> Monitorar a expressão gênica com coloração DAPI. <ol><li> Lavam-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes. </li><li> Fixar as células por adição de 10 ml de formaldeído a 4% em PBS (10 minutos de incubação à TA). </li><li> Lavam-se as células com PBS três vezes. </li><li> Incubar as células no escuro durante 15 min à temperatura ambiente com 8 ml de PBS contendo 1: 500 DAPI, 1% de BSA, 0,01% de digitonina. </li><li> Lavam-se as células com PBS três vezes. </li><li> VCcante um microscópio de fluorescência, determinar o número de células que são verde / azul em relação àqueles que são azuis (Figura 2 painel superior). A percentagem calculada representa a eficiência da transfecção. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Usando o sistema de sobre-expressão de lentivírus 10 <ol><li> Rim embrionário (HEK) Semear as células em um humanos 293T 15 centímetros prato de cultura de tecidos (10% de FBS em DMEM como seu meio de crescimento). Nota: Quando as células são cerca de 60-70% confluentes, eles estão prontos para ser transfectada. </li><li> Adicionar 162 ul de reagente de transfecção de 1133 ul de os meio de soro reduzido em um tubo de microcentrífuga de 11. Evitar o contacto do reagente de transfecção não diluída com a parede do tubo. </li><li> Adicionar 24 g de pLL3.7 eGFP (ou outra construção), 15,6? G de elemento de resposta a Rev (RRE), 6,0 ug de REV, e 8,4? G de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG) para o reagente de transfecção / reduced mistura meio de soro. </li><li> Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Substituir o meio de crescimento com 16 ml de 10% de FBS em DMEM. </li><li> Adicionar a mistura de ADN / reagente de transfecção / meio de soro reduzido, gota a gota para o prato. </li><li> Agite ligeiramente os pratos várias vezes para a frente e para trás seguido por uma direção para a esquerda e para a direita. É normal ver algumas das células HEK293T destacadas neste momento. </li><li> Coloque o prato na incubadora. </li><li> Após 24 horas de incubação, substituir a mídia no prato com 25 ml de meio de crescimento. </li><li> No dia seguinte, recolher o meio de crescimento contendo o lentivírus (primeira coleção). </li><li> Repita o passo 2.2.10 para coletar mais lentivírus (a segunda cobrança). </li><li> Reúnem-se os primeiro e o segundo recolha, e remover os detritos celulares por centrifugação (2500 xg durante 5 min). </li><li> Filtrar a coleção com um filtro descartável garrafa-top (0,45 poro), econcentra-se o vírus por centrifugação a recolha a 31.400 xg durante 2 horas à temperatura ambiente (rotor JA-20). Marcar a parte inferior do tubo de centrifugação em que o pelete é localizado. Decantar o sobrenadante, e deixar o tubo invertido à TA durante cerca de 15 min. </li><li> Ressuspender o sedimento contendo vírus com 100 ul de PBS 1X. Evite bolhas. </li><li> Armazenar o vírus concentrada a -80 ° C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento. </li><li> Determinar a quantidade óptima de vírus necessária para transduzir as células Caco-2 por meio de titulação. Para poupar custos, utilizar uma placa de 24 poços (0,3 ml de meio de crescimento / poço) em vez de um 10 centímetros prato de cultura de tecidos para a titulação. <ol><li> Adicionar quantidades crescentes do vírus concentrado (0, 1, 2, 5, 10, 25, e 50 uL / ​​poço) suplementado com polibreno (concentração final = 5 ug / ml) para a 40-70% confluentes células Caco-2. Agitar a placa de 24 poços como descrito em suavemente 1.1.2. </li><li> Monitore sua expressão gênica (Passo 2.1.10.) (Figura 2 fundo4 painéis). </li></ol></li><li> Desde a expressão de transgene é geralmente sustentado, manter as células transduzidas para experiências futuras e monitorar continuamente a sua expressão gênica (Passo 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Estimular o Lipoproteína Secreção <ol><li> Usando o prato de cultura de tecido normal <ol><li> Prepara-se uma mistura de lípidos de 100X através da mistura de 50 mg de ácido oleico, 40 mg de lecitina, e 48 mg de taurocolato de sódio. Levar o volume a 900 mL com PBS (o suficiente para pratos 8). Vortex vigorosamente a mistura de lípidos. </li><li> Adicionar 900 ul da mistura de lípidos 100X em 89,1 ml de meio de crescimento. Misturar e filtrar a mídia contendo lípidos. As concentrações finais (1x) de ácido oleico, lecitina, e taurocolato de sódio é 2,0 mM, 1,36 mM e 1,0 mM, respectivamente. </li><li> Adicionar 10 ml de meio contendo lípido para as células. </li><li> Incubam-se as células com meio contendo o lípido durante 4 horas num 37° C incubadora. </li><li> Lavam-se as células com PBS três vezes. </li><li> Adicionam-se 10 ml do meio de crescimento para as células para recolher a secreção de lipoproteínas. </li><li> Incubar durante 2 horas num banho a 37 ° C incubadora. </li><li> Recolhe a mídia contendo lipoproteína. </li></ol></li><li> Usando o sistema de membrana permeável <ol><li> Siga os passos 3.1.1-3.1.2 para preparar a mistura de lípidos. </li><li> Adicionar 10 ml de meio contendo lípido para a câmara de apical e 10 ml de meio de crescimento para a câmara basolateral. </li><li> Incuba-se durante 4 horas numa incubadora de 37 ° C. Recolhe a mídia contendo lipoproteína na câmara basolateral. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento de lipoproteína (Figura 3) <ol><li> Remover os restos celulares do meio contendo lipoproteína por centrifugação (2000 xg durante 5 min). </li><li> Decantar a mídia em um tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar 5,95 g de cloreto de sódio para a mídia. </li><li> Se a sample serão analisados ​​pelo MET, adicionar um inibidor da protease de cocktail comprimido para manter a integridade das lipoproteínas. </li><li> Levar o volume a 23 ml com água (1,2 g / ml de solução de NaCl a densidade). </li><li> Dissolve-se os solutos completamente. </li><li> Decantar a totalidade da solução para um tubo de ultracentrífuga policarbonato. </li><li> Suavemente sobrepor a solução densidade 1,2 g / ml com 0,5 ml de água (1,0 g / ml de densidade). </li><li> Equilibrar o tubo por peso e não por volume. </li><li> Carregue suavemente os tubos no rotor T865. </li><li> Rodar as amostras na ultracentrífuga a 429.460 xg durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Isolar imediatamente o topo 0,5 ml de solução por pipetagem suave. Mantenha o tubo o mais imóvel possível. </li></ol> 5. Análise TEM <ol><li> Prepare 5 ml de ácido fosfotúngstico a 2% (w / v) e ajustar o pH a 6,0. </li><li> Filtra-se o ácido fosfotúngstico a 2% com um filtro de seringa (tamanho de poro: 0,2 um). </li><li> Gota de 20 ul da amostra em um prato de lipoproteína estéril. </li><li> Gota de 20 ul de ácido fosfotúngstico a 2% filtrada ao lado da amostra no mesmo prato. </li><li> Suavemente soltar uma grade EM com o lado maçante descansando na amostra. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Bater levemente o lado da grade de EM num papel de filtro para remover a amostra da rede. </li><li> Suavemente soltar a grade EM com o lado maçante descansando no ácido fosfotúngstico 2%. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Bater levemente o lado da grade de EM num papel de filtro para remover o ácido fosfotúngstico a partir da rede. </li><li> Usando uma ETM, capturar as imagens das lipoproteínas (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li>
<li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li>
<li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li>
<li>Lo, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li>
<li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li>
<li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+biosynthetic+interaction+network+component%2C+TMEM24%2C+facilitates+insulin+reserve+pool+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li>
<li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saturated%2C+mono-%2C+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li>
<li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+and+human+fetal+colon%3A+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li>
<li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li>
</ol>

O autor não tem nada a divulgar.

Neste artigo, os dois sistemas que podem ser utilizados para manter células Caco-2 são descritos, a saber, o prato de cultura de tecidos normal e a membrana permeável. Os benefícios de usar o sistema de membrana permeável incluem a separação do apical e basolateral os compartimentos, e a capacidade de incubar a mistura de lípidos e recolher a secreção de lipoproteínas simultaneamente. No entanto, as pastilhas de membranas permeáveis ​​são caros, e a sua membrana de policarbonato não permite uma boa visibilidade celular....

Estudos de absorção intestinal de gordura da dieta, e drogas e vitaminas solúveis em lípidos pode ser realizada in vivo usando um modelo de fistula linfática 1-4. No entanto, as técnicas cirúrgicas envolvidas não são apenas um desafio, mas também caro. Embora abordagens in vivo com base na análise fecal podem ser utilizados, eles são utilizados principalmente para determinar a percentagem de absorção pelo tracto gastrointestinal 2,5. O modelo in vitro descrito neste trabalho é mais rentável, e as técnicas envolvidas são, indiscutivelmente, menos desafiador. Estudos de modificação genética são também mais económico e menos quando eles são conduzidos usando este modelo in vitro demorado. Uma vez que os materiais solúveis em lípidos que são absorvidos por enterócitos são empacotados em lipoproteínas de 6,7, a eficácia deste modelo in vitro para a produção de lipoproteínas é crucial. Os dois intestina principall lipoproteínas são quilomicrons e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Os quilomicrons, lipoproteínas como definidas com 80 nm ou mais de diâmetro, são produzidos de forma rigorosa o intestino delgado, quando lípidos estão abundantemente presentes no lúmen gastrointestinal. Uma vez que eles são os maiores lipoproteínas, chylomicrons são concebivelmente os transportadores lipídicos mais eficientes. Este modelo in vitro, que é capaz de produzir quilomicrons 8, pode ser usado para estudar a absorção de gordura dietética, a vitamina solúvel em lípidos absorção pelo intestino, e biodisponibilidade oral da droga lipofílica. A presença de moléculas solúveis em lípidos, vitaminas ou drogas na fracção de lipoproteínas é um indicador da sua absorção pelo intestino delgado. Como discutido anteriormente, este modelo pode ser usado para melhorar a biodisponibilidade oral da droga lipofílica 6. Este artigo descreve como células Caco-2 devem ser mantidas na membrana permeável ou regular pratos de cultura de tecidos, como os lipídios mixture para estimular a produção de lipoproteína deve ser preparado, como o sistema de expressão de lentivírus pode ser empregue para atingir a sobre-expressão eficaz, e como as lipoproteínas isolados devem ser analisados.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Pré-aqueça o meio de crescimento em uma placa de cultura de tecidos individual antes de adicionar células</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>Não inativamos nosso soro</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>As células podem ser lavadas com PBS antes do tratamento com tripsina&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de membrana permeável</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>placa de 10 cm, tamanho de poro de 3 mm, membrana de policarbonato</td></tr><tr><td>placa de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td>Placa de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Placa de 15 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Placa de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de cultura de tecidos Reagente de transfecção à base de lipídios</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Pode ser substituído por outro reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Meio de soro reduzido</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>Para transfecção</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td></tr><tr><td>Filtro de topo de garrafa</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>poro de 0,45 mm</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Previne o ciclo de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>Lecitina&nbsp;</td><td>Lecitina de ovo</td> <td>Fisher</td><td>IC10214625</td></tr><tr><td>Taurocolato de sódio</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Produto descontinuado; número de catálogo alternativo: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Comprimido de coquetel inibidor de protease (sem EDTA)</td> <td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Usado principalmente para amostras que precisam de análise TEM</td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga de policarbonato</td><td></td><td>Fisher NC9696153</td><td>Reutilizá-lo várias vezes irá colapsar o tubo</td></tr><tr><td>Tampa para tubo de ultracentrífuga</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>É necessária uma ferramenta para remover o tubo/tampa do rotor</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Filtro de</td></tr><tr><td>seringa</td> descartável <td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Tamanho dos poros = 0,2 mm; nylon</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>Para preparar ácido fosfotúngstico a 2%, pH 6,0</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Extra fino e pontas fortes</td></tr><tr><td>Formvar/grade de carbono</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/filme de carbono grade quadrada 400 Cobre</td></tr></tbody></table>

usando caco-2 em células para estudo lipid transportes pelo intestino

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Estudos de absorção de gordura na dieta são geralmente conduzidos usando um modelo animal equipado com uma cânula linfática. Embora esse modelo animal seja amplamente aceito como o modelo in vivo de absorção de gordura na dieta, as técnicas cirúrgicas envolvidas são desafiadoras e caras. A manipulação genética do modelo animal também é cara e demorada. O modelo alternativo in vitro é indiscutivelmente mais acessível, economiza tempo e é menos desafiador. É importante ressaltar que o modelo in vitro permite que os investigadores examinem os enterócitos como um sistema isolado, reduzindo a complexidade inerente ao modelo de todo o organismo. Este artigo descreve como as células de carcinoma de cólon humano (Caco-2) podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e medicamentos e vitaminas lipossolúveis. Explica a manutenção adequada das células Caco-2 e a preparação de sua mistura lipídica; e discute ainda a valiosa opção de usar o sistema de membrana permeável. Como as células Caco-2 diferenciadas são polarizadas, a principal vantagem de usar o sistema de membrana permeável é que ele separa o compartimento apical do basolateral. Consequentemente, a mistura lipídica pode ser adicionada ao compartimento apical, enquanto as lipoproteínas podem ser coletadas do compartimento basolateral. Além disso, a eficácia do sistema de expressão de lentivírus na regulação positiva da expressão gênica em células Caco-2 é discutida. Por fim, este artigo descreve como confirmar o isolamento bem-sucedido de lipoproteínas intestinais por microscopia eletrônica de transmissão (MET).

Figura 1 apresenta normais de 13 dias pós-confluentes células Caco-2. O aparecimento de estruturas em forma de cúpula e gotículas lipídicas intracelulares são características diferenciadas de células Caco-2. Quando as células Caco-2 não são dispersos igualmente durante a sementeira, eles vão aglutinar-se e crescer demais em certas áreas do prato; e haverá algumas áreas no prato sem quaisquer células. Roda e colocando o prato numa superfície inclinada deve ser evitada. Também é importante notar que o pós...

As células Caco-2 podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e drogas/vitaminas lipossolúveis. O sistema de membrana permeável separa o compartimento apical do basolateral, enquanto o sistema de expressão de lentivírus oferece um método eficaz de superexpressão gênica. O isolamento das lipoproteínas é confirmado por TEM.

Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar o transporte de moléculas lipossolúveis pelo intestino. Isso é realizado primeiramente colocando células Caco-2 diferenciadas no inserto de membrana permeável. Em seguida, as células Caco-2 são incubadas com uma mistura lipídica e a secreção de lipoproteínas é estimulada.Em seguida, as lipoproteínas são isoladas utilizando ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de sódio. Por fim, as lipoproteínas isoladas são contrastadas negativamente com ácido fosfotúngstico. Em última instância, a análise de tamanho de partículas é utilizada para mostrar a abundância relativa de quilomícrons em relação às lipoproteínas de muito baixa densidade.Embora este método possa fornecer informações sobre o transporte de lipídios dietéticos pelo intestino, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a determinação da biodisponibilidade de fármacos lipídicos orais. Após a implementação da superexpressão gênica e o monitoramento conforme o protocolo descrito, mantenha as duas células KCO que sustentam a superexpressão gênica. Utilizando células que atingiram de 50 a 70% de confluência, divida as células na proporção de um para seis, adicionando três mililitros de tripsina 0,05% contendo 0,53 milimolar de EDTA e incubando a 37 graus Celsius até que as células se desprendam; pipeteie suavemente as células várias vezes para evitar agregação.Em seguida, após transferir 0,5 mililitros das células para a câmara apical ou superior de uma membrana permeável, insira contendo 10 mililitros de meio de crescimento pré-aquecido. Adicione 10 mililitros de meio de crescimento morno à câmara lateral inferior. Agite suavemente as placas várias vezes em movimentos para frente e para trás.Evite agitar as placas, pois isso pode resultar em uma dispersão desigual das células. Coloque as placas sobre uma superfície plana em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Um dia depois, troque o meio de crescimento e continue a trocar o meio de acordo com o protocolo descrito no texto.Prepare uma mistura de lipídios 100x adicionando 900 microlitros de PBS a 50 miligramas de ácido oleico em vórtex. Transfira vigorosamente toda a mistura de ácido oleico para um tubo contendo 40 miligramas de Han e 48 miligramas de tartrato de sódio. Solubilize a mistura lipídica por vórtex vigoroso.Adicione 900 microlitros da mistura de lipídios a 89,1 mililitros do meio de crescimento e misture a solução filtrada para as concentrações finais no meio mostradas aqui. Utilizando células Caco-2 com 13 dias pós-confluência cultivadas em inserts de membrana permeável, adicione 10 mililitros do meio contendo lipídios à câmara apical e 10 mililitros do meio de crescimento à câmara basal lateral.Incube por quatro horas a 37 graus Celsius antes de coletar o meio contendo lipoproteínas na câmara basolateral. Para isolar as lipoproteínas, remova os detritos celulares do meio contendo lipoproteínas por centrifugação a 2000 ×g por cinco minutos. Decante o meio para um tubo de 50 mililitros, então adicione 5,95 gramas de cloreto de sódio e, se for analisar por microscopia eletrônica de transmissão ou TEM, adicione um comprimido de inibidor de protease.Use água para completar o volume até 23 mililitros e dissolver completamente os solutos. Em seguida, decante a solução para um tubo de ultracentrifugação de policarbonato. Use 0,5 mililitro de água para sobrepor suavemente a solução de densidade de 1,2 grama por mililitro.Em seguida, equilibre o tubo quanto ao peso. Coloque os tubos em um rotor T 8 65 e realize a ultracentrifugação a 429.460 ×g e 4 °C por 24 horas. Em seguida, mantendo o tubo o mais imóvel possível, isole imediatamente os 0,5 mililitros superiores da solução.Para realizar a análise por MEV, prepare cinco mililitros de ácido fosfotúngstico a 2% e ajuste o pH para 6,0. Utilizando um filtro de seringa com tamanho de poro de 0,2 micrômetros, filtre a solução. Adicione 20 microlitros da amostra de lipoproteína em uma placa estéril.Em seguida, coloque 20 microlitros do ácido fosfotóico filtrado ao lado da amostra no mesmo recipiente, com o lado fosco voltado para a amostra. Coloque suavemente uma grade de microscopia eletrônica sobre a gota de lipoproteína e incube em temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, toque suavemente a lateral da grade em um papel filtro para remover o excesso de amostra da grade.Em seguida, deixe cair suavemente a grade com o mesmo lado apoiado sobre a gota de ácido fosfotúngstico e incube por um minuto antes de tocar levemente a grade no papel de filtro para remover a solução em excesso. Por fim, realize a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para capturar imagens das lipoproteínas. São mostradas aqui células kco dois normais com 13 dias pós-confluência, exibindo estruturas em forma de cúpula e gotículas lipídicas intracelulares características das células caco dois diferenciadas.Neste momento, o novo meio deve ser adicionado cuidadosamente, pois as células são mais suscetíveis à dessanexação. Utilizando o método de ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de sódio, as lipoproteínas secretadas pelas células Caco-2 foram isoladas e analisadas por MET. Alguns dos quilomícrons, que são lipoproteínas com diâmetro maior que 80 nanômetros, estão representados aqui.LDLs menores também estão presentes. Uma alta porcentagem de partículas de quilomícrons em relação ao número total de partículas de lipoproteínas indica transporte eficiente de lipídios após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de ciências farmacêuticas explorarem mais extensivamente a biodisponibilidade de fármacos lipofílicos orais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para avaliar a biodisponibilidade de ferro em fontes alimentares complexas. A técnica combina a simulação da digestão humana com a absorção de ferro por células Caco-2 diferenciadas. A formação de ferritina intracelular atua como um marcador para a absorção celular de ferro.

Bioensaio de células Caco-2: um método in vitro para medir a biodisponibilidade de ferro em fontes alimentares complexas

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores epiteliais.

Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

Apresentamos um protocolo para investigar o crosstalk entre Caco-2 X-ray-irradiados e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). O protocolo começa com a instalação e Caco-2 irradiação da cultura co com PBMC; posteriormente, resistência elétrica trans-epitelial é medida regularmente durante 48 h e ocidental do borrão realizados em PBMC e Caco-2.

Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Este protocolo descreve um ensaio para a caracterização da formação do gota do lipido (LD) em organóides intestinais humanos em cima da estimulação com ácidos gordos. Nós discutimos como este ensaio é usado para a quantificação da formação do LD, e como pode ser usado para a seleção elevada da taxa de transferência para as drogas que afetam a formação do LD.

Um ensaio à base de fluorescência para caracterização e quantificação da formação de gotas lipídicas em organóides intestinais humanos

Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

O bioensaponenciamento celular Caco-2 para biodisponibilidade de ferro (Fe) representa uma abordagem econômica e versátil para avaliar a biodisponibilidade da Fe a partir de alimentos, produtos alimentícios, suplementos, refeições e até regimes dietéticos. Validada minuciosamente aos estudos humanos, representa o estado da arte para estudos de biodisponibilidade fe.

O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Aprenda a estudar o transporte de lipídios pelo intestino usando células Caco-2 diferenciadas em membrana permeável. Este método inclui isolamento de lipoproteínas por ultracentrifugação e análise por microscopia eletrônica.

Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

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