Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

O objetivo geral deste procedimento é montar culturas semelhantes a sanduíches para estudar o comportamento celular em um ambiente 3D fisiologicamente mais relevante. Isso é feito primeiro preparando e revestindo os substratos ventrais e dorsais com proteínas como a fibronectina. Em seguida, as células são assentadas de forma semelhante a uma cultura 2D padrão.

Em seguida, o substrato dorsal é sobreposto para que as células sejam estimuladas ventral e dorsalmente. Finalmente, experimentos como um ensaio de cicatrização de feridas podem ser realizados. Em última análise, as culturas em sanduíche são analisadas por procedimentos já desenvolvidos para culturas 2D padrão, como imagens ao vivo, imunofluorescência ou extração celular.

Para análise posterior. A principal vantagem desta técnica cultural sobre os sistemas tridimensionais existentes é que ela permitiu o estudo de diferentes parâmetros nas interações materiais, como topografia, química, rigidez e conteúdo de proteínas nos locais ventral e dorsal, oferecendo um alto grau de versatilidade. Além disso, procedimentos experimentais que podem ser prejudicados para alguns sistemas tridimensionais, como lipina, imunofluorescência e extrações celulares, são facilmente realizados Para produzir um filme plano de ácido polilático ou PLLA por fundição de solvente trabalhando em uma capela de exaustão, adicione dois gramas de PLLA a 100 mililitros de clorofórmio e mexa em temperatura ambiente por aproximadamente três horas ou até dissolver completamente.

Coloque arruelas de aço inoxidável em uma placa de Petri de vidro. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução de PLLA nas arruelas. Use papel alumínio com alguns orifícios para cobrir o prato e deixe o PLLA evaporar lentamente em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, aqueça as amostras a 120 graus Celsius por cinco minutos para evaporar quaisquer vestígios de solvente. Em seguida, depois de permitir que as amostras esfriem em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos, use água de 18,2 mega ohm centímetro para cobrir as amostras no prato e incube em temperatura ambiente por oito minutos. Após a incubação, use uma lâmina de barbear para retirar as arruelas da placa de Petri.

Em seguida, use uma pinça para remover quaisquer imperfeições da borda das arruelas e deixe as amostras secarem ao ar. Como o PLLA é degradável por armazenamento de hidrólise, as amostras em vácuo dessecam até o dia dos experimentos. Além disso, as fibras ELLA podem ser produzidas de acordo com o protocolo de texto e ser usadas como substrato dorsal sob uma capa de cultura estéril.

Adicionar 20 microgramas por mililitro de nin FI em docos PBS ou DPBS com cálcio e magnésio às amostras e incubar à temperatura ambiente durante uma hora após o revestimento proteico. Use DPBS para lavar as amostras duas vezes e armazene em DPBS com P cálcio e magnésio até que esteja pronto para usar as próximas células de sementes nas lamínulas de cobertura de vidro e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir que as células adiram ao substrato ventral. Em seguida, transfira as amostras para novos poços de uma placa de 12 poços.

Usando uma pinça, sobreponha cuidadosamente o substrato dorsal nas células. Em seguida, adicione um mililitro de médio. O peso da arruela impedirá que o substrato dorsal flutue.

Retorne as amostras a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, trocando o meio duas vezes por semana para estudar a migração celular dentro da cultura semelhante a um sanduíche. Depois de revestir os substratos ventral e dorsal com fibronectina, conforme demonstrado anteriormente, as células-semente em lamínulas de cobertura de vidro em alta densidade, incubam as amostras e permitem que as células atinjam a confluência. Em seguida, use uma ponta de pipeta para arranhar a monocamada de células para criar duas populações de células separadas por uma lacuna.

Coloque o substrato sentado ventral em um novo poço adequado para a aquisição de lapso de tempo e grande o suficiente para que os substratos dorsais caibam dentro. Em seguida, com uma pinça, conforme demonstrado anteriormente, sobreponha o substrato dorsal nas células e reabasteça com meio. Coloque a amostra sob um microscópio de lapso de tempo e capture imagens do fechamento da lacuna a cada 20 minutos.

Use um software como o mito BO da Image J para analisar o fechamento da lacuna no sanduíche. Como cultura. O sulfato é altamente dependente do momento em que os receptores dorsais são estimulados e pelas propriedades da interação dorsal.

Semelhante a outros sistemas 3D, como hidrogéis, por exemplo, como visto aqui, as fibras PLLA dorsais eletrofiadas direcionam o alinhamento celular quando revestidas com fibronectina, mas não quando revestidas com uma proteína não adesiva como a BSA. Além disso, culturas em forma de sanduíche com PLLA dorsal simples desencadearam um aumento no nível de miogênese usando células C e C 12. Isso também depende dos estímulos biológicos dorsais.

Como a interação com diferentes proteínas dorsais resulta em taxas de diferenciação distintas, conforme demonstrado neste vídeo, os fibroblastos que migram dentro do sanduíche como cultura em um ensaio de cicatrização de feridas, adotam uma morfologia alongada e migram distâncias mais curtas em comparação com as células. Cultivado em substratos 2D semelhantes aos géis de fibronectina e colágeno 3D. A cultura em forma de sanduíche aumenta a reorganização da ECM mediada por células em comparação com as condições 2D.

Este processo depende dos estímulos mecânicos dorsais e da estabilidade do citoesqueleto. Como o uso de inibidores de contratilidade, como BLEs, a estatina dificultou o processo S Ok, então, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara de como montar culturas semelhantes a sanduíches. Este método pode projetar microambiente 3D para medicina de reação e câncer, incluindo aplicações em modelos de doenças, estudos de desenvolvimento e testes de drogas.