Name: Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprenda a usar a microrreologia de rastreamento de partículas para medir propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos in situ. Esta técnica não destrutiva oferece alta resolução espacial para estudar a mecânica da matriz.

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Esta investigação é apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa e Ministério da Educação Singapura no âmbito do seu Centro de Pesquisa do Programa de Excelência, as ajudas à instalação (M4330002.C70) da Universidade Tecnológica de Nanyang, e ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) do Ministério da Educação, Cingapura. Os autores agradecem Joey Yam Kuok Hoong para participar na manifestação deste protocolo.

1. biofilme Cultivo <ol><li> Preparação de Estirpes Bacterianas <ol><li> 1 dia antes do cultivo biofilme, preparar culturas de bactérias planctónicas inoculando 2 ml de meio de crescimento adequado a partir da cultura bacteriana congelado. Use meio de Luria-Caldo (10 g L -1 de NaCl, 10 g L -1 extrato de levedura e 10 g L -1 triptona) para mucoid P. aeruginosa e as suas pel Δ e Δ psl mutantes defeituosos. Incubar durante a noite a 200 rpm agitação condições 37 ° C e. Dilui-se as culturas durante a noite para uma DO 600 de 0,40 usando um espectrofotómetro. </li><li> Montar configuração da célula de fluxo, o que tem sido descrito anteriormente 14, de preferência em uma estação móvel ou carro que pode ser levado para a sala de microscópio para imagiologia da célula de fluxo, sem desmontagem. </li><li> Prepare meio de crescimento estéril em 2 L ou L 5 frascos para cada célula de fluxo. Use meio mínimo M9 (48 mM de Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH4CI, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO4, e 0,1 mM de CaCl2) suplementado com 0,04% de glucose (p / v) e 0,2% (peso / vol) de casaminoácidos) para P. aeruginosa fluir biofilmes celulares. </li><li> Aliquota microesferas fluorescentes em tubos de microcentrífuga e girar para baixo em H 2 O esterilizada durante 5 min numa centrífuga a 9,391.2 g. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de meio de crescimento para remover azida de sódio (desinfectante) antes da adição ao meio de crescimento em G 2 ou 5 frascos de meio L. NOTA: Os tamanhos diferentes de microesferas vir em diferentes concentrações e deve ser diluída de acordo com as instruções. Por exemplo, dispersar 120 ul de microesferas de 1,0 um de diâmetro, 15 ul de microesferas de 0,5 um de diâmetro e 0,96 ul de microesferas de 0,2 um de diâmetro em 2 L de meio de crescimento para dar 2,18 x 10 6 ml -1 microesferas para cada tamanho de partícula. </li><li> Anexar meio garrafa para upstresma de célula de fluxo e permitir que o meio de crescimento a fluir através de instalação inteira. Pare o fluxo e injectar culturas durante a noite diluídas em câmaras de célula de fluxo. Permitir que as bactérias para anexar o substrato lamela durante 1 h antes de continuar o fluxo de meio de crescimento a uma taxa de fluxo de cerca de 5,5 x 10 -3 m s-1, ou 8 rpm com uma bomba peristáltica. NOTA: Os biofilmes são normalmente cultivadas à temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 dias. </li><li> Alternativamente, para a configuração cultura estática, dilui-se culturas de uma noite de 100 vezes em tubos de microcentrífuga adicionando 10 ul de cultura durante a noite a 1 ml de meio de crescimento com partículas. Aumentar a concentração de partículas no meio de crescimento para cultura estática de cerca de 500 vezes em comparação com a utilizada para biofilmes de fluxo (por exemplo, lavar e ressuspender 600 ul de 1,0 uM esferas de diâmetro em 10 ml de meio de crescimento) como biofilmes de células de fluxo estão constantemente reabastecido com partículas, mas as culturas não são estáticas. <ol><li> Adicionar 2001; l de cultura durante a noite diluiu-se com partículas para as câmaras de 8 lâminas bem. Incubar a 37 ° C em condições estáticas. Os biofilmes são normalmente cultivadas para 1 dia. Substitua meio de crescimento gasto diário com meio de crescimento fresco com partículas se biofilme é cultivado por mais de 1 dia. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopia <ol><li> No dia 3 e 5, desligue o fluxo de bomba peristáltica e trazer configuração de célula de fluxo para a sala de microscopia. Tubulação braçadeira perto da entrada e saída das câmaras de célula de fluxo para evitar a deriva (a causa do erro sistemático por mudanças no ambiente de fluxo). Coloque a célula de fluxo para o estágio de microscópio de um microscópio vertical. NOTA: Use um microscópio invertido para a imagem latente de micropoços. </li><li> Use microscopia fluorescente com 40X objetivo óleo para gravar vídeos de microesfera de movimento embutidos no biofilme em vários locais (microcolônias e camadas indiferenciadas plana) e em diferentes dias (dia 3 e 5) parainvestigações temporais e espaciais. Gravar vídeos curtos com maior taxa de quadros para investigar os eventos que ocorrem dentro de escalas de tempo curto (por exemplo, 1,5-3 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 25-50 frames por segundo para uma dinâmica rápida), e mais vídeos com menor taxa de quadros para investigar eventos durante mais tempo escalas (por exemplo, 15-30 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 2,5-5 frames / seg para uma dinâmica mais lentas). NOTA: Um vídeo normalmente contém partículas de 5-10, e é tipicamente de 1,0-2,5 GB no tamanho do arquivo. Microcolônias maiores podem conter mais partículas. Leve 5-10 vídeos para cada categoria (por exemplo, 10/05 vídeos de diferentes microcolônias e de diferentes locais em camadas planas indiferenciados). O biofilme tem uma arquitectura heterogénea que pode consistir de microcolónias, canais, cavidades e indiferenciadas camadas planas. </li><li> Salvar vídeos em formato apropriado que podem ser lidos por Fiji / ImageJ (por exemplo CZI, tif). </li><li> Confira vídeos de tração, percorrendo vid acabadoEO e observando-se que as partículas não se movem na mesma direcção simultaneamente. A deriva pode ser causado pelo movimento Z-fase, as correntes na célula de fluxo, o desequilíbrio de mesa anti-vibração, pressão de ar ou mudanças de temperatura. Menor correta deriva usando técnicas de pós-processamento normalmente fornecidos com o software de microscópio. Descartar nenhum vídeo em que deriva não podem ser corrigidos. Grave os seguintes parâmetros, que são necessários durante Particle Analysis Tracking: resolução (px / um), número de quadros, Duração. </li><li> Remover célula de fluxo de platina do microscópio e reiniciar a bomba peristáltica continuar a cultivar o biofilme. </li></ol> 3. Análise de Rastreamento de Partículas <ol><li> Obter trajetórias de partículas que usam o plug-in Trackmate em software de fonte aberta (ImageJ). Baixe Fiji em <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Abra o vídeo com Fiji e no menu Plugins, selecione Rastreamento e Trackmate. </li><li> Verifique ou ajustar as definições em the janela sugerindo ajustes de calibração iniciais para combinar os parâmetros de vídeo como registrado no passo 2.4. </li><li> Detectar partículas no Trackmate usando ImageJ. <ol><li> Selecione &#39;detector Log&#39;, diâmetro das partículas de entrada e valor limite (por exemplo, 1000). Percorra o vídeo enquanto clicando no botão &#39;Preview&#39; para verificar se os círculos roxos siga as partículas ao longo do vídeo. Ajuste os valores de diâmetro e de limite, conforme necessário: aumentar o valor limite se círculos roxos aparecer no espaço vazio. Reduzir o valor limite se forem detectadas partículas não o suficiente. Clique no botão ao lado para completar a detecção de partículas. </li><li> Clique no botão ao lado quando apresentado com a opção de adicionar ou remover as partículas detectadas no &#39;limiar Inicial&#39;, &#39;Selecione uma exibição&#39; e &#39;Selecione um filtro&#39; janelas para continuar sem ajuste se a detecção de partículas inicial foi satisfatório. </li><li> Selecione &#39;rastreador simples LAP&#39; na optina barra de &#39;Selecione um método rastreador &quot;janela como partículas raramente mover fora de foco no biofilme e são facilmente controladas. Use os valores max distância ligando sugerido ou baixo e abertura-fechamento, e clique em Avançar. </li><li> Verifique se rastreamento de partículas é satisfatória, percorrendo o vídeo para ver que as partículas de seguir as trilhas traçadas por Trackmate, e que não existem faixas indesejadas ou ausentes. Ir as várias etapas de filtragem. Ir para a última janela &quot;Selecione uma ação &#39;. Selecione &#39;faixas de exportação para arquivo xml&#39; a partir do menu drop-down e clique em &quot;Executar&quot;. Escolha uma pasta para salvar as faixas. NOTA: Existem vários programas disponíveis no domínio público para a análise de trajetórias de partículas e uso de microrheology. msdanalyzer e TrackArt são exemplos de programas de análise de rastreamento de partículas que são executados no ambiente Matlab. </li></ol></li><li> Prepare Matlab para importar as trajetórias de partículas nos arquivos XML, selecionando no menu deArquivo Matlab&gt; Set Path ... e adicione a pasta disponíveis os scripts com o pacote de Fiji. </li><li> Para analisar as trajetórias de partículas com msdanalyzer, baixar o link para o arquivo zip ou o arquivo tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Extraia a pastamsdanalyzer 15 e soltá-lo em uma pasta que pertence ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings &lt;usuário&gt; Meus Documentos Matlab). Comece Matlab e iniciar o analisador de digitação: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) onde hum e sec são as unidades de tempo e espaço físicos no vídeo. <ol><li> Importe as trajetórias de partículas, digitando: [faixas, md] = importTrackMateTracks (&#39;FileName.xml&#39;, &#39;Clipz&#39;;, &#39;Scalet&#39;) ma = ma.addAll (faixas); onde &#39;Clipz&#39; remove a dimensão z para um vídeo 2D, e &#39;Scalet&#39;. </li><li> Traçar as trajetórias Onto gráfico usando: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Calcule os LME das partículas usando: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Traçar as perturbações músculo-esqueléticas de cada partícula: figura ma.plotMSD </li><li> Combinar trajetórias de partículas de outros vídeos do mesmo categery (por exemplo, partículas incorporadas no tipo selvagem microcolônias no dia 3), repetindo 3.5.1.1 a 3.5.1.4). </li><li> Traçar o conjunto médio ou a média sobre todas as curvas: ma.plotMeanMSD Alterar o Y e eixo-x de linear para escala logarítmica. Às vezes longas lag, as curvas MSD tornar-se barulhento devido a estatísticas insuficientes em prazos mais longos. As curvas MSD também pode subir abruptamente devido a erro dinâmico. Estas regiões da curva pode ser removida usando a ferramenta pincelpara selecionar o final da curva e da selecção de &quot;Escovar &#39;&gt;&#39; Remover unbrushed &#39;no menu Ferramentas. </li></ol></li><li> Baixe Ezyfit em <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> e adicionar Ezyfit para uma pasta pertencente ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings &lt;usuário&gt; Meus Documentos Matlab). Instale o menu Ezyfit digitando em Matlab espaço de trabalho efmenu instalar. Reinicie MATLAB com cardápio Ezyfit na janela de figura. Ajustar as curvas MSD para a lei de potência, selecionando no menu Ezyfit &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; eram n é o expoente α diffusive estimado. NOTA: msdanalyzer requer o ajuste de curva Toolbox em Matlab para ajuste de curvas de MSD. Ezyfit é uma alternativa e software livre que pode executar ajuste de curva. </li><li> Limpar trajetórias de partículas atuais e LME para calcular os novos LME partículas em outros locais ou tempo: Claro </li&gt; <li> Após o cálculo de várias curvas médias MSD de partículas no meio (controle), e microcolônias e áreas indiferenciadas de diversas estirpes, copie e cole as curvas em um gráfico para comparação. Rigidez da amostra e reticulação aumento com valores mais baixos MSD. Curvas planas têm α inferiores e amostra é mais elástica do que curvas mais íngremes com maior α. </li><li> Selecione a curva e vá em &quot;Ferramentas&quot; olhar para as estatísticas de dados, como a mediana e intervalo. A MSD da pérola é proporcional à fluência conformidade, J (t) do material em que o grânulo é incorporado de acordo com a relação, <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> onde J = conformidade fluência, d = diâmetro da partícula, B k = constante de Boltzmann, T = temperatura e t = tempo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Microrheology é uma ferramenta útil para medições reológicas locais em sistemas heterogêneos, como biofilmes microbianos. É uma técnica não destrutiva, o que permite o acompanhamento em tempo real das modificações reológicas dentro da mesma amostra biológica sobre vários pontos de tempo. Neste protocolo, de rastreamento de partículas microrheology foi aplicada a Pel e mutantes de exopolissacarídeo Psl a fim de investigar como eles afetam a elasticidade e reticulação eficaz da matriz do biofilme. Psl favorece o desenvolv...

A maioria das células bacterianas são capazes de empregar tanto planctônicas (de vida livre) e (sésseis) modos ligado à superfície de crescimento 1. No modo ligado à superfície de crescimento, as células bacterianas e secretar encerrar-se em grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biofilmes. O EPS é constituído principalmente por proteínas, exopolissacarídeo, ADN extracelular e é essencial para a formação de biofilme 2. Ele serve como um andaime física através da qual as bactérias podem ser utilizadas para diferenciar espacialmente e protege as bactérias de condições ambientais prejudiciais e as respostas do hospedeiro. Diferentes componentes de EPS têm papéis distintos na formação de biofilme 3 e alterações na expressão de componentes EPS pode remodelar drasticamente estruturas biofilme 4. Componentes EPS também pode funcionar como moléculas sinalizadoras 5, e estudos recentes tem mostrado certos componentes EPS interagindo com células microbianas para orientar suas migração e biofilme differentiation 6-8. A investigação sobre o EPS tem muito avançado com base nas análises morfológicas dos biofilmes produzidos por mutantes defeituosos em um componente específico do EPS 9,10. Além disso, o EPS é geralmente caracterizado na macro-escala (caracterização granel) 11. Morfológica analisa no entanto pode faltar detalhe caracterização quantitativa e grandes quantidades, o que devolve valores médios, perde o detalhe de que existe dentro da heterogeneidade do biofilme. Existe agora uma tendência crescente para avançar para caracterização em tempo real das propriedades mecânicas do EPS no micro-escala. Este protocolo demonstra como partícula-tracking microrheology é capaz de determinar os efeitos espaço-temporais de componentes da matriz Pel e exopolissacarídeos Psl sobre a viscoelasticidade e eficaz de reticulação de Pseudomonas aeruginosa 4 biofilmes. Microrheology passivo é um rh simples e baratoeology método que fornece a maior velocidade de amostragem microrheological espacial de um material à data 12,13. Em microrheology passiva, esferas de sondas são colocados na amostra e o seu movimento Browniano, impulsionado por energias térmica (K) B T é seguido por microscopia de vídeo. Diversas partículas podem ser monitoradas simultaneamente, e as coordenadas dependentes do tempo das partículas seguem um passeio aleatório convencional. Portanto, em média, as partículas permanecem na mesma posição. No entanto, o desvio padrão dos deslocamentos ou o deslocamento quadrático médio (MSD) das partículas, não é zero. Uma vez que o fluxo de fluidos viscosos, a partícula MSD num fluido viscoso cresce linearmente à medida que o tempo avança. Em contraste, a ligação cruzada polimérico encontrado em viscoelástico ou substâncias elásticas para ajudar a resistir a fluir, e as partículas tornam-se limitada no seu deslocamento, levando a planaltos na curva MSD (Figura 1A). Esta observação segue a relação MSDαt <saté&gt; α, onde α é o expoente difusivo que está relacionada proporção de contribuições elásticas e viscosas da substância. Para as partículas que se deslocam em fluidos viscosos a = 1, em substâncias viscoelásticas 0 &lt;α &lt;1, e em substâncias elásticas α = 0. A MSD também pode ser utilizado para calcular a conformidade fluência, que é a tendência do material para deformar permanentemente sobre tempo e estima quão facilmente um spread materiais. O tamanho, densidade e química da superfície da partícula são importantes para a aplicação correcta do experimento microrheological e são escolhidos com respeito ao sistema estudado (neste caso, os polímeros da matriz do biofilme, ver Figura 1B). Em primeiro lugar, a partícula mede a reologia da substância com as estruturas que são muito menores do que a própria partícula. Se as estruturas da substância são de dimensão semelhante à das partículas, o movimento do partigo é perturbado pela forma e orientação das estruturas individuais. No entanto, se as estruturas circundantes da partícula são muito menores, este efeito é pequena e média para fora, apresentando um ambiente homogéneo para a partícula (Figura 1B). Em segundo lugar, a densidade das partículas deve ser semelhante ao meio (1,05 g ml -1 de meios à base de água) de tal modo que a sedimentação é evitada e as forças de inércia são insignificantes. A maioria das partículas de poliestireno com treliças cumpram os critérios acima. Idealmente, a partícula não interage com os polímeros da matriz do biofilme como a interpretação reológico de partícula MSD só é válida se o movimento é aleatório, conduzido por energia térmica e de colisão com estruturas de substância. Isto pode ser observado através da verificação se a sonda de partículas tende a ligar-se ou saltar para fora da superfície de um biofilme de pré-adulto. No entanto, apesar da falta de atracção para o biofilme, as partículas devem ser capazes de ser incorporados na matriz.Além disso, a heterogeneidade físico-químicas do biofilme pode resultar em diferentes partículas sendo mais apropriados como sondas em diferentes regiões do biofilme. Assim, as partículas de diferentes tamanhos e química de superfície deve ser aplicado para o biofilme. Como tal, a partícula MSD é capaz de fornecer informações úteis sobre como os diferentes componentes contribuem para a reologia e divulgação do biofilme. Além disso, a utilização de diferentes sondas permite a obtenção de informação sobre a heterogeneidade espacial físico-química do biofilme. Este método pode ser utilizado para testar o efeito do tratamento antimicrobiano sobre as propriedades mecânicas do biofilme, ou aplicado a biofilmes espécies mistas para investigar como as propriedades mecânicas do biofilme são alteradas de introdução de uma outra espécie. Partículas perturbações músculo-esqueléticas pode também ser útil para caracterizar a dispersão do biofilme. Tais estudos seriam úteis em nosso entendimento de biofilmes, melhorando potencialmente tratamentos biofilme umnd engenharia de biofilmes para atividades úteis.

<table><tbody><tr><td>Fluoresferas</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &#956; m microesferas fluorescentes vermelhas (580/605) com modificação de carboxilato</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Microscópio Epifluorescente</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>Bomba peristáltica</td></tr><tr><td>Câmaras de células de fluxo</td><td>Universidade Técnica da Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armadilha de bolhas</td><td>Universidade Técnica da Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Silicone</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3 mm de diâmetro externo, 1&nbsp; mm de diâmetro interno</td></tr><tr><td>Conectores de plástico polipropileno transparente&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 pol. (1.588 milímetros)</td></tr><tr><td>Clips</td><td></td><td></td> de Binder <td>Para Clamp Tubing</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Scientific&trade; Nunc & trade;</td><td>Seringa 50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp; Agulha G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 - L Garrafas de Armazenamento/Mídia</td><td>VWR&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carrinho</td><td></td><td></td><td>Para manter a configuração do biofilme</td></tr></tbody></table>

em situ mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

As células bacterianas são capazes de formar comunidades de biofilme ligadas à superfície conhecidas como biofilmes, envolvendo-se em substâncias poliméricas extracelulares (EPS). O EPS serve como um andaime físico e protetor que abriga as células bacterianas e consiste em uma variedade de materiais que incluem proteínas, exopolissacarídeos e DNA. A composição do EPS pode mudar, o que remodela as propriedades mecânicas do biofilme para desenvolver ou suportar estruturas alternativas de biofilme, como serpentinas, como resposta a pistas ambientais. Apesar disso, existem poucas descrições quantitativas sobre como os componentes do EPS contribuem para as propriedades mecânicas e a função dos biofilmes. A reologia, o estudo do fluxo de matéria, é de particular relevância para os biofilmes, pois muitos biofilmes crescem em condições de fluxo e são constantemente expostos à tensão de cisalhamento. Ele também fornece medição e informações sobre a propagação do biofilme em uma superfície. Aqui, a microrreologia de rastreamento de partículas é usada para examinar a viscoelasticidade e os papéis efetivos de reticulação de diferentes componentes da matriz em várias partes do biofilme durante o desenvolvimento. Essa abordagem permite que os pesquisadores meçam as propriedades mecânicas dos biofilmes em microescala, o que pode fornecer informações úteis para controlar e projetar biofilmes.

As propriedades viscoelásticas locais do biofilme em diferentes regiões do biofilme, que inclui os espaços vazios (médias acima do biofilme), planícies (camada plana de células indiferenciadas) e microcolônias (ver etiquetas na Figura 2A) foram investigados. As alterações temporais em propriedades viscoelásticas do biofilme durante a maturação dos dias 3 a 5 também foram determinadas. A MSD das partículas em espaços vazios foi usada como um controlo e comparável ao MSD de partículas em forma pura. Em co...

A microrreologia de rastreamento de partículas investiga a viscoelasticidade dos materiais. Aqui, a técnica é usada para determinar a viscoelasticidade, a fluência e as funções efetivas de reticulação de diferentes componentes da matriz de um biofilme bacteriano. A matriz consiste em substâncias poliméricas secretadas pela bactéria e seus componentes determinam a estrutura do biofilme e as propriedades mecânicas.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

O objetivo geral desta metodologia é demonstrar como medir as propriedades lógicas reais dentro dos microdomínios de biofilmes em células de fluxo heterogêneas e biofilmes estáticos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biofilmes, como como componentes métricos específicos, diferentes espécies ou compostos afetam a neurologia do biofilme e testar sua resposta a forças físicas, como cisalhamento. Esta é uma técnica não destrutiva com alta resolução espacial, que pode ser realizada com equipamentos padrão em laboratórios biológicos.Após preparar culturas bacterianas de crescimento noturno, suprimentos e meio para a montagem da câmara de fluxo, conforme descrito no protocolo, alíquotar esferas microfluorescentes em água estéril em tubos de microcentrífuga para remover a azida de sódio, centrifugar os tubos por cinco minutos em ambiente estéril, como uma cabine de fluxo laminar, remover o sobrenadante e usar um mililitro de meio de crescimento para ressuspender as esferas microfluorescentes. Em seguida, adicionar as esferas microfluorescentes ao restante do meio de crescimento para a cultura na câmara de fluxo. Montar a cultura em câmara de fluxo conforme descrito no protocolo para um sistema de cultura estática para biofilmes cultivados em câmaras de microplacas, diluindo as culturas noturnas em 100 vezes em tubos de microcentrífuga, adicionando 10 microlitros da cultura noturna a um mililitro de meio de crescimento.Meio contendo microesferas. Em seguida, utilize os cultivos diluídos para preencher as câmaras de micropoços e incube a 37 graus Celsius sob condições estáticas. Nos dias três e cinco, desligue o fluxo da bomba peristáltica e leve o conjunto da célula de fluxo para a sala de microscopia.Em seguida, prenda a tubulação próxima à entrada e saída das câmaras da célula de fluxo para evitar deslocamentos causados pelo fluxo. Coloque a célula de fluxo sobre a platina de um microscópio ereto e, utilizando um objetivo de imersão de 40 x e microscopia de fluorescência, registre o movimento das microesferas incorporadas no biofilme em várias localizações, como microcolônias e camadas planas indiferenciadas, para investigações temporais e espaciais. Para eventos que ocorrem em uma escala de tempo curta, grave vídeos mais curtos com uma taxa de quadros mais rápida para capturar dinâmicas rápidas. Para eventos mais longos, capture vídeos mais longos com uma taxa de quadros mais lenta.Para dinâmicas mais lentas, salve os vídeos em um formato apropriado que possa ser lido pelo Fiji ImageJ, como CZI ou Tiff. Verifique se não está ocorrendo deriva. Ao percorrer um vídeo finalizado e confirmar que as partículas não se movem na mesma direção simultaneamente, mas que o movimento é aleatório.Remova a câmara de fluxo da platina do microscópio e reinicie a bomba peristáltica para continuar o cultivo do biofilme. Para obter as trajetórias de rastreamento de partículas dos vídeos gravados, abra o Fiji e carregue um arquivo. No menu plugins, selecione tracking e TrackMate. Verifique ou ajuste os parâmetros de resolução e taxa de quadros nas configurações iniciais de calibração para que correspondam aos parâmetros do vídeo. Para detectar partículas, selecione o detector LOG e insira o diâmetro da partícula e o valor de limiar.Por exemplo, 1000. Verifique o botão de visualização e percorra o vídeo para garantir que os círculos roxos sigam as partículas ao longo de todo o vídeo. Aumente o valor do limiar.Se o círculo roxo aparecer no espaço vazio, reduza o valor do limiar. Se não forem detectadas partículas suficientes, clique no botão seguinte para concluir a detecção de partículas. Se a detecção inicial de partículas foi satisfatória e não houver necessidade de adicionar ou remover partículas, clique no botão seguinte. Para as próximas três janelas, limiarização inicial, selecione uma visualização e selecione um filtro sem ajuste.Em seguida, na barra de opções da janela selecione um método de rastreamento, escolha o rastreador LAP simples. Como as partículas raramente saem do foco no biofilme e são facilmente rastreadas, utilize os valores sugeridos ou baixos para a distância máxima de ligação e fechamento de lacunas e clique em Avançar. Verifique se o rastreamento de partículas é satisfatório percorrendo o vídeo para confirmar que as partículas seguem as trajetórias traçadas pelo TrackMate e que não há trajetórias indesejadas ou ausentes.Vários filtros são fornecidos para excluir partículas com base nos resultados individuais de rastreamento. Se isso não for necessário, vá até a janela final, selecione a ação no menu suspenso, escolha exportar trajetórias para arquivo XML e clique em executar. Escolha uma pasta e salve as trajetórias no matlab.Prepare-se para importar os arquivos XML de trajetórias de partículas selecionando o caminho do conjunto de arquivos e adicionando a pasta de scripts disponível com o pacote Fiji para realizar a análise de trajetórias de partículas. Comece baixando o analisador de MSD. Extraia a pasta do analisador de MSD e coloque-a em uma pasta pertencente ao caminho do MATLAB.Inicie o MATLAB e inicie o analisador digitando o seguinte, onde micrômetros e segundos são as unidades físicas de espaço e tempo no vídeo. Em seguida, importe as trajetórias das partículas digitando o seguinte, onde o recorte Z remove a dimensão Z. Para um vídeo 2D e escala, T ajusta as unidades na dimensão temporal de quadros para segundos e adiciona as pistas para traçar as trajetórias das partículas.Insira os seguintes dados e calcule o deslocamento médio quadrático ou MSDS das partículas usando os comandos mostrados aqui. Para plotar os MSDS de cada partícula, utilize figure e MA dot plot msd. Em seguida, combine as trajetórias das partículas de outros vídeos da mesma categoria.Ao importar as trajetórias usando o comando importar trajetória, em seguida plotando e calculando os msds conforme acabou de ser demonstrado para plotar a média do conjunto ou as curvas médias gerais. Digite o seguinte. Depois altere os eixos Y e X da escala linear para a escala logarítmica.Para remover regiões da curva com longos tempos de atraso ou que apresentam aumento acentuado devido ao erro dinâmico, utilize a ferramenta de seleção para marcar o final da curva. E no menu de ferramentas, selecione a opção de seleção. Remova o não cruzado após instalar o easy FITT e reiniciar o MATLAB com o menu fácil na janela da figura.De acordo com o protocolo descrito, ajuste as curvas MSD à lei de potência selecionando mostrar ajuste da potência A vezes X elevado a N, em que N é o expoente difusivo estimado alfa. Em seguida, para calcular novos MSDs de partículas em outras localizações ou tempos, digite clear para descartar as trajetórias e MSDs atuais das partículas. Após calcular várias curvas MSD para partículas em diferentes localizações de cepas de biofilmes e em diferentes pontos temporais, copie e cole as curvas em um único gráfico.Para comparação, selecione a curva e vá até ferramentas para visualizar as estatísticas dos dados, como a amplitude mediana. O MSD da partícula é proporcional à complacência de fluência JFT do material no qual a partícula está embutida, de acordo com a relação mostrada nesta fórmula, onde J equivale à complacência de fluência. D equivale ao diâmetro da partícula, KB equivale à constante de Boltzmann.A letra maiúscula T constante representa a temperatura e a letra minúscula t representa o tempo. Nestes experimentos, foram investigadas as propriedades viscoelásticas de diferentes regiões do biofilme de cepas selvagens de P. aeruginosa e mutantes delta PE A, incluindo vazios, planos e microcolônias. O MSD das partículas no vazio foi utilizado como controle e foi comparável ao MSD das partículas em meio puro.Em contraste, as partículas aprisionadas no biofilme vibravam em posições fixas e os valores de MSD variavam desde os típicos de materiais viscoelásticos até géis fortemente elásticos em biofilmes formados pelas cepas tipo selvagem e delta Pele. No terceiro dia, as microcolônias apresentaram um MSD das partículas independente do tempo, para intervalos de 0,1 segundo a 10 segundos, indicando que as microcolônias eram elásticas. As complacências médias ao fluir, calculadas a partir dos MSDs correspondentes das partículas, foram respectivamente 4,3 vezes 10 à potência de menos dois pascals à potência de menos um e 3,6 vezes 10 à potência de menos dois pascals à potência de menos um.No quinto dia, a fluência lenta dos microcolonias na linhagem selvagem aumentou para 2,5 vezes 10 à potência negativa um, pascal à potência negativa, indicando uma redução na reticulação efetiva dentro da matriz. Os biofilmes formados pela linhagem mutante delta P-S-L-B-C-D foram menos diferenciados e apresentaram desenvolvimento retardado, com planos espessos que desenvolveram microcolonias somente após o terceiro dia. A partir dos valores de MSD, observou-se que os biofilmes foram muito menos efetivamente reticulados em comparação com as linhagens selvagem e delta Pele. Estatísticas suficientes foram obtidas a partir do microdomínio quando a análise de vídeos adicionais não acrescentou nenhuma informação nova à curva de MSD.É importante conduzir a microbiologia utilizando uma ampla gama de partículas que diferem em química de superfície e tamanhos. Experimentos adicionais podem ser acrescentados ao procedimento para investigar aspectos relacionados à saúde. Forças físicas, como cisalhamento ou tratamentos químicos, afetam a radiologia do biofilme, e a microbiologia extrai informações estruturais que não são facilmente obtidas por outros métodos na escala de micrômetros.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rastrear partículas, analisar seus MSDs e obter expoentes difusivos de biofilmes. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos bacterianos pode ser perigoso. Todos os resíduos devem ser autoclavados e descartados adequadamente.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudar bioentupimento em meios porosos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para estudar a formação de biofilmes. Uma suspensão bacteriana é introduzida no microcanal, seguida de incubação para permitir o desenvolvimento do biofilme. O fluxo é então retomado, e o monitoramento de pressão junto com imagens é usado para detectar formação de biofilme e obstrução dos poros ao longo do tempo.

Um dispositivo microfluídico para imagem em tempo real e acompanhamento de pressão durante a formação do biofilme

Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces.

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

Os biofilmes têm interações complexas com o ambiente circundante. Para investigar de forma abrangente as interações biofilme-ambiente, apresentamos aqui uma série de métodos para criar um ambiente químico heterogêneo para o desenvolvimento do biofilme, quantificar a velocidade do fluxo local e analisar o transporte de massa dentro e ao redor das colônias de biofilme.

Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Este artigo apresenta um método para o cultivo de um biofilme para em situ íon secundário de tempo-de-voo espectrometria de massa para mapeamento químico em seu estado hidratado, habilitado por um reator microfluídicos, sistema para análise na Interface líquido do vácuo. A Shewanella oneidensis MR-1 com proteína de fluorescência verde foi usado como um modelo.

In Situ Caracterização de Shewanella oneidensis MR1 biofilmes por SALVI e ToF-SIMS

A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Os biofilmes microbianos formam arquiteturas complexas em interfases e se desenvolvem em padrões espaciais altamente dependentes de escala. Aqui, apresentamos um sistema experimental (Hard-e software) para a aquisição automatizada de conjuntos de dados de tomografia de coerência óptica 3D (OCT). Este conjunto de ferramentas permite a caracterização não invasiva e em várias escalas da morfogênese do biofilme no espaço e no tempo.

Tomografia de coerência óptica 3D automatizada para elucidar a morfogênese do biofilme sobre grandes escalas espaciais

O protocolo apresenta um fluxo de trabalho completo para experimentos de nanoindentação de materiais moles, incluindo hidrogéis e células. Primeiro, as etapas experimentais para adquirir dados de espectroscopia de força são detalhadas; em seguida, a análise de tais dados é detalhada através de um software Python de código aberto recém-desenvolvido, que é gratuito para download no GitHub.

Fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole

Este trabalho destaca a eficácia da técnica de elastografia de coerência óptica (OCE) na caracterização rápida e não destrutiva das propriedades elásticas do biofilme. Nós elucidamos procedimentos críticos de implementação de OCE para medições precisas e apresentamos os valores do módulo de Young para dois biofilmes granulares.

Quantificação das Propriedades Elásticas de Biofilmes Ambientais utilizando Elastografia de Coerência Óptica

Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Aprenda a usar a microrreologia de rastreamento de partículas para medir propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos in situ. Esta técnica não destrutiva oferece alta resolução espacial para estudar a mecânica da matriz.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

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