Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

O objetivo geral desta metodologia é mostrar como medir as propriedades lógicas reais dentro dos microdomínios de células de fluxo heterogêneas e biofilmes estáticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a ologia no campo do biofilme, como como componentes de métricas específicas, diferentes espécies ou compostos afetam a neurologia do biofilme e testam sua resposta à força física, como o shere. Esta é uma técnica não destrutiva com alta resolução espacial, podendo ser conduzida com equipamentos padrão para laboratórios biológicos.

Depois de preparar culturas bacterianas e suprimentos durante a noite e meio para configuração da célula de fluxo, de acordo com o protocolo de texto, alíquota de microesferas fluorescentes em água estéril em tubos de microcentrífuga para remover a azida de sódio, gire os tubos por cinco minutos em um ambiente estéril, como uma capa de fluxo, remova o supernat e use um mililitro de meio de crescimento para ressuspender as microesferas. Em seguida, adicione microesferas ao resto do meio de crescimento para cultura de células de fluxo. Configure a cultura de células de fluxo de acordo com o protocolo de texto para uma configuração de cultura estática para biofilmes cultivados em câmaras de micropoços, dilua culturas noturnas 100 vezes em tubos de microcentrífuga, adicionando 10 microlitros de cultura noturna a um mililitro de crescimento.

Meio contendo microesferas. Em seguida, use as culturas diluídas para encher as câmaras de micropoços e incubar a 37 graus Celsius em condições estáticas. Nos dias três e cinco, desligue o fluxo da bomba peristáltica e traga a configuração da célula de fluxo para a sala de microscopia.

Em seguida, prenda a tubulação perto da entrada e saída das câmaras da célula de fluxo para evitar o desvio do fluxo. Coloque a célula de fluxo no palco de um microscópio vertical e com uma objetiva de óleo 40 x e microscopia de fluorescência, registre o movimento da microesfera embutido no biofilme em vários locais, como microcolônias e camadas planas indiferenciadas para investigações temporais e espaciais. Para eventos que ocorrem em uma escala de tempo curta, grave vídeos mais curtos com uma taxa de quadros mais rápida para uma dinâmica rápida Para eventos mais longos, capture vídeos mais longos com uma taxa de quadros mais lenta.

Para uma dinâmica mais lenta, salve os vídeos em um formato apropriado que possa ser lido pela imagem J de Fiji, como CZI ou Tiff. Verifique se o desvio não está ocorrendo. Percorrendo um vídeo finalizado e confirmando que as partículas não se movem na mesma direção simultaneamente, mas que o movimento é aleatório.

Remova a célula de fluxo do estágio do microscópio e reinicie a bomba peristáltica para continuar cultivando o biofilme. Para obter trajetórias de rastreamento de partículas dos vídeos gravados, abra Fiji e carregue um arquivo No menu de plug-ins, selecione rastreamento e companheiro de faixa. Verifique ou ajuste os parâmetros de resolução e taxa de quadros nas configurações iniciais de calibração para que correspondam aos parâmetros de vídeo Para detectar partículas, selecione o detector LOG e insira o diâmetro da partícula e o valor limite.

Por exemplo, 1000. Verifique o botão de visualização e percorra o vídeo para verificar se os círculos roxos Siga as partículas ao longo do vídeo. Aumente o valor limite.

Se o círculo roxo aparecer no espaço vazio, reduza o valor limite. Se não forem detectadas partículas suficientes, clique no botão Avançar para concluir a detecção de partículas. Se a detecção inicial de partículas foi satisfatória e não há necessidade de adicionar ou remover partículas, clique no botão Avançar Para as próximas três janelas, limite inicial, selecione uma vista e selecione um filtro sem ajuste.

Em seguida, na barra de opções da janela selecionar um método de rastreador, selecione o rastreador LAP simples. Como as partículas raramente saem de foco no biofilme e são facilmente rastreadas, use os valores sugeridos ou de baixa vinculação e distância máxima de fechamento de lacuna e clique. Próximo. Verifique se o rastreamento de partículas é satisfatório rolando pelo vídeo para ver se as partículas seguem os rastros desenhados pelo trackmate e se não há rastros indesejados ou ausentes.

Vários filtros são fornecidos para excluir partículas com base em seus resultados de rastreamento individuais. Se isso não for necessário, vá para a janela final, selecione em ação no menu suspenso, selecione exportar faixas para arquivo XML e clique em executar. Escolha uma pasta e salve as faixas no matlab.

Prepare-se para importar os arquivos XML de trajetórias de partículas selecionando o caminho do conjunto de arquivos e adicione a pasta de scripts disponível com o pacote Fiji para realizar a análise da trajetória de partículas. Comece baixando o analisador MSD. Extraia a pasta do analisador at msd e solte-a em uma pasta que pertença ao caminho do MATLAB.

Inicie o MATLAB e inicie o analisador digitando o seguinte, onde micrômetros e segundos são as unidades físicas de espaço e tempo no vídeo. Em seguida, importe as trajetórias das partículas digitando o seguinte, onde o clipe Z remove a dimensão Z. Para um vídeo 2D e escala, T dimensiona as unidades na dimensão de tempo de quadros a segundos e adiciona as trilhas para traçar trajetórias de partículas.

Insira o seguinte, calcule o deslocamento quadrático médio ou MSDS das partículas usando os comandos mostrados aqui. Para plotar a MSDS de cada partícula, use a figura e o gráfico de pontos MA msd. Em seguida, combine trajetórias de partículas de outros vídeos da mesma categoria.

Importando as trajetórias usando o comando import trajectory e, em seguida, plotando e calculando msds como acabamos de demonstrar para traçar a média do ensemble ou as curvas gerais médias. Digite o seguinte. Em seguida, altere os eixos Y e X de escala linear para logarítmica.

Para remover regiões da curva com tempos de atraso longos ou que aumentam acentuadamente devido a erros dinâmicos, use a ferramenta pincel para selecionar o final da curva. E no menu de ferramentas, selecione escovação. Remova o não criado após instalar o FITT fácil e reiniciar o MATLAB com o menu fácil na janela da figura.

De acordo com o protocolo de texto, ajuste as curvas MSD à lei de potência selecionando mostrar potência de ajuste A vezes X elevado a N, onde N é o expoente difusivo alfa estimado. Em seguida, para calcular novas msds de partículas em outros locais ou tempo, digite clear para descartar as trajetórias atuais de partículas e msds. Depois de calcular várias curvas MSD para as partículas em vários locais de diferentes cepas de biofilme e em diferentes pontos de tempo, copie e cole as curvas em um gráfico.

Para comparação, selecione a curva e vá para as ferramentas para examinar as estatísticas de dados, como o intervalo mediano. O MSD do cordão é proporcional à complacência de fluência JFT do material no qual o cordão está embutido de acordo com a relação mostrada nesta fórmula, onde J é igual à complacência de fluência. D é igual ao diâmetro da partícula KB é igual ao do barqueiro.

T maiúsculo constante é igual a temperatura e T minúsculo é igual a tempo. Nesses experimentos, foram investigadas as propriedades viscoelásticas de diferentes regiões de biofilme de cepas mutantes selvagens de P arosa e delta PE A, incluindo vazios, planos e microcolônias. O MSD de partículas no vazio foi usado como controle e foi comparável ao MSD de partículas em meio puro.

Em contraste, as partículas presas no biofilme vibraram em posições fixas e os valores de MSD variaram desde os materiais viscoelásticos típicos A até géis fortemente elásticos em biofilmes formados pelo tipo selvagem e delta Pele cepas o MSD das partículas. No dia, três microcolônias foram independentes do tempo por tempo, pernas de 0,1 segundos a 10 segundos indicando que as microcolônias eram elásticas. As complacências médias de fluência calculadas a partir das msds de partículas correspondentes foram 4,3 vezes 10 elevado a menos dois pascais elevado a negativo e 3,6 vezes 10 elevado a menos dois pascais elevado a negativo, respectivamente.

No quinto dia, a complacência de fluência das microcolônias na cepa do tipo selvagem aumentou para 2,5 vezes 10 para o negativo, pascals para o negativo, indicando uma redução na reticulação efetiva dentro da matriz Os biofilmes formados pela cepa mutante delta P-S-L-B-C-D foram menos diferenciados e atrasados no desenvolvimento com planos espessos que desenvolveram microcolônias após o terceiro dia. A partir dos valores de MSD, os biofilmes foram reticulados de forma muito menos eficaz do que as cepas selvagem e delta Pele. Estatísticas suficientes são retiradas do microdomínio quando a análise de mais vídeos não adiciona nenhuma informação nova à curva MSD.

É importante conduzir a microbiologia usando uma ampla gama de partículas que diferem na química e nos tamanhos da superfície. Experimentos adicionais podem ser adicionados ao procedimento para investigar a saúde. Forças físicas, como tratamento puro ou químico, afetam a radiologia do biofilme A microbiologia extrai informações estruturais que não são facilmente obtidas por outros métodos na escala micrométrica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como rastrear partículas, analisar suas msds e obter expoentes difusivos de biofilmes. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos bacterianos pode ser perigoso. Todos os resíduos devem ser autoclavados e descartados adequadamente.