Name: Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a criar culturas 3D de epitélio mamário humano sensíveis a hormônios usando células T47D. Este método padronizado permite estudar a morfogênese epitelial induzida por estrogênio, progesterona e prolactina para pesquisa em câncer de mama.

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Agradecemos imensamente as contribuições editoriais pela Cheryl Schaeberle. Esta pesquisa foi apoiada pela Avon Grants # 02-2009-093 e 02-2011-095, e NIEHS / NIH ES 08.314 para AMS. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental ou o National Institutes of Health.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Dissolve-se o progestagénio sintético promegestona (R5020) e 17-β-estradiol (E2) em etanol para fazer soluções de reserva 10 -3 m. Dissolver prolactina em água desionizada destilada para produzir uma solução stock de 1 mg / ml. Dissolve-se o antiestrogénio ICI 182,780 em DMSO para fazer uma solução estoque de 10 -2 M. Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C durante até 6 meses. </li><li> dextrano carvão (CD) despojado de soro e médio CDFBS: <ol><li> Calor-inactivar soro fetal de bovino (FBS) em um banho de água a 57 ° C durante 30 min. Nota: Use apenas material de vidro lavado com ácido para o restante deste protocolo. </li><li> Calcula-se a quantidade de carvão necessária. Usando 10% mais volume do que a quantidade de soro para compensar o deslocamento provocado pelo carvão, pesar 5% p / v de carvão activado em pó. </li><li> Lavar duas vezes com carvão vegetal água destilada desionizada fria usando o mesmo volume que a quantidade de soro. Para cada lavagem centrifuge a 50 xg durante 2 min para sedimentar o carvão vegetal. Retire a água entre as lavagens. Adicionar 0,5% p / v de Dextrano T-70 para o último sedimento carvão. Re-suspender com água destilada, água desionizada e centrifugar a 100 xg durante 5 min. Aspirar a água. </li><li> Adicionar o volume apropriado de soro para o sedimento e re-suspender o sedimento carvão dextrano no soro. Incubar, enquanto rola (6 RPM), a 37 ºC durante 60 min. Centrifugar a 2000 xg durante 20 min. Se sobrenadante turvo, repita a centrifugação; no entanto, o soro pode não ser completamente claro neste momento, mas serão apagados durante a filtração. </li><li> Filtrar através de um filtro de 0,80 micron e, em seguida, novamente através de um filtro de 0,45 mícron para remover matéria em partículas maiores. Por último, esterilizar-filtro com um filtro de 0,20 micron. Loja filtrada CDFBS em tubos de vidro ou T-25 frascos de cultura a -20 ºC. </li><li> Charcoal Dextran Stripped fetal bovino contendo media (mídia CDFBS): misturar 375 ml de fenol DMEM isento de vermelho e 125 ml de DMEM/ F-12. Remover 37,5 ml e substituí-lo com o mesmo volume de soro fetal bovino carvão dextrano Stripped. Adiciona-se 10 6 U / ml de penicilina e L-glutamina numa concentração final de 2 mM. Os meios de comunicação resultante é de 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, 7,5% de dextrano a carvão despojado-FBS, 2 mM de L-glutamina, e 10 6 U / ml de penicilina. </li></ol></li><li> Prepare PBS 10X, NaOH 1 N e água desionizada destilada. Prepare um volume suficiente de cada um de acordo com o volume de solução de colágeno necessário. Esterilizar todas as soluções de filtragem. Armazenar a 10x PBS e água desionizada destilada estéril a 4 ° C durante até 1 mês. Não guarde a solução de NaOH 1N. </li><li> Preparar a solução de colagénio a uma concentração final de 1 mg / ml de acordo com o protocolo para &quot;Processo de gelificação alternativo para o colagénio I da cauda de rato&quot; fornecida pelo fabricante. Cada gel é feito de 1,5 ml de solução de colagénio. Por exemplo, preparar a 18,5 ml (0,5 ml para ter em conta perdas durante a pipetagem) de solução de colagénio para preparar12 géis. Utilizar a solução de colagénio imediatamente ou manter em gelo durante até 2-3 horas. </li><li> Carmine Alum corante: <ol><li> Combinar 1 g Carmine e 2,5 g de sulfato de alumínio e potássio em 500 ml de água destilada. Ferver enquanto se agitava durante 20 min. Observe com cuidado para evitar a ferver sobre. Ajustar o volume final de volta para 500 ml com água destilada adicional. </li><li> Adicionar um cristal de timol para a atividade antimicrobiana e cobrir garrafa com folha de alumínio para proteger da luz. Filtrar através de um filtro de papel de grau de laboratório antes de cada utilização. Reutilizar a solução de carmim por até três meses. Armazenar à temperatura ambiente, protegida da luz. </li></ol></li><li> solução de colagenase: dissolver a colagenase em meio DMEM / F12 a uma concentração de 0,125% w / v. Não guarde esta solução. </li></ol> 2. Cultura 3D de T47D As células em Rat cauda colágeno tipo 1 Géis e tratamento hormonal Nota: manter pipetas serológicos estéreis e pontas de pipeta a 4 ° C. <ol><li> Prepare uma suspensão de uma única célula e executar uma contagem de células. culturas de células de divisão T47D antes que eles atinjam 70% de confluência. Centrifuga-se o volume que contém a quantidade de células necessárias. Considere-se que um gel deve conter cerca de 75.000 células T47D. </li><li> Usando uma pipeta a frio, de re-suspender o sedimento de células no volume apropriado de colagénio. Considere-se que cada gel é composta de 1,5 ml de colagénio. Misturar as células e colagénio o cuidado para evitar a introdução de bolhas. </li><li> Para impedir o efeito de electricidade estática na distribuição das células, o escovar fronteiras, superior e inferior da placa de 12 poços com uma escova estática de redução depois de retirar a placa. Para evitar o acúmulo de carga estática durante o contato com a superfície de trabalho da capa, colocar esta placa em cima da outra placa de 12 poços (placa em branco), que também foi escovado com o brush.Gently estática de redução, despeje 1,5 ml da mistura em cada poço da placa de 12 poços. </li><li> Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. Remover the placa da incubadora e coloque-o novamente na capa. </li><li> Usando uma ponta estéril p200, retire cuidadosamente o gel em um suave movimento circular a partir da fronteira do poço. O gel também deve destacar a partir do fundo do poço. </li><li> Diluir hormonas em meio CDFBS a ser adicionado aos poços. Use E2 e R5020 a uma concentração final de 10 -10 M e prolactina num a 10 -7 M concentração final. Como controle, usar a mídia CDFBS sem hormônios adicionados, mas ainda contendo o maior volume de DMSO igual às existências hormonais utilizados. Certifique-se de que cada poço contém 1,5 ml de meio. Coloque as culturas 3D dentro de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2, 100% tecido humidade cultura incubadora. Manter as culturas por 1 ou 2 semanas, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias. </li></ol> 3. Gel de processamento para toda Mounts <ol><li> Remover o meio de cultura e adicionar 1,5 ml de PBS a cada poço. </li><li> Transferir o gel para um slide. Cortar o gel em meio usando uma curvad lâmina cirúrgica. Continuar o processamento com uma metade e guardar a outra metade para análise histológica. </li><li> Transfira a metade gel para toda montar a um slide. Vamos gel seco durante 5 minutos e, em seguida, transferir o slide para um frasco Coplin contendo formol a 10%. Nota: todas as incubações deve ser feito à temperatura ambiente. </li><li> Fix géis em um frasco coplin num agitador O / N. </li><li> Lave as lâminas com PBS duas vezes durante 10 minutos cada em agitador. Transferir as lâminas para 70% de EtOH; incubar durante 1 hora no agitador. lâminas de transferência para Carmine Alum O / N. </li><li> No dia seguinte, desidratar lâminas num agitador em EtOH a 70%, EtOH a 95% e 100% de EtOH, durante 1 h cada. Transferir as lâminas ao xileno duas vezes para 1 hora cada e manter em shaker. Use meio de montagem à base de tolueno para montar os géis e 1,5 mm de espessura Lamelas. </li><li> Examine as peças inteiras sob luz normal (microscópio ou estereoscópio). Para uma análise mais detalhada da forma e lumen usar microscopia confocal e visualizar corante carmim com HeNe 633 a laser nm. </li></ol>4. Processamento de Gel de Processamento de Análise de Histologia <ol><li> Transferir a metade restante do gel para um frasco de vidro de 20 ml contendo 10% de formalina e fixar num agitador de O / N. </li><li> Lavar géis duas vezes com PBS durante 10 min cada, num agitador. géis coloque em cassetes de processamento para inclusão em parafina. </li><li> geles de transferência para 70% de EtOH, incubar durante 1 h e seguir com 95% de EtOH, durante 1 h, para alterar fresco EtOH a 95% durante 1 hora, 100% de EtOH, durante 1 h, e para alterar fresco EtOH a 100% durante 1 hora. Neste ponto, os géis podem ser armazenados em EtOH a 100% O / N à TA ou incubaram-se com xileno, durante 1 h e, em seguida, novamente em xileno fresco durante 1 hr. </li><li> cassetes de transferência de parafina durante 1 hora a 60 ° C na incubadora de vácuo, repetir com parafina fresco mais duas vezes. </li><li> Preencha moldes de plástico com parafina limpo. Abrir a cassete, retirar o gel e colocá-la no molde de plástico contendo parafina. Encha-se com parafina e adicione topo da cassete contendo a etiqueta para cima e deixe bloco legal. </li><li> Remover o Plastic molde e seção do bloco usando um micrótomo. Obter 5 um de espessura para a coloração HE e imunohistoquímica. </li></ol> 5. A extracção de células a partir de células a partir de géis usando colagenase tratamento <ol><li> Remover o gel a partir do poço e transferi-lo para uma placa de Petri contendo PBS. brevemente gel de lavagem. </li><li> Transferir o gel para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de colagenase a 0,125%. Pipetar cima e para baixo 4-5 vezes de modo a quebrar o gel em pedaços pequenos. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 25 minutos (até que se dissolveu em gel e as células estão em suspensão) </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura soro suplementado. Coletar células por centrifugação (1000 x g, 5 min), sobrenadante de descarte, as células re-suspender e contar. </li></ol>

<ol><li>Barnes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+tissues%3A+interactions+between+the+matrix+and+human+breast+cells+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time.</a> PLoS ONE. 9, e93325(2014).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen+responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Nat.Acad.Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture.</a> Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogens+stimulate+cell+proliferation+and+induce+secretory+proteins+in+a+human+breast+cancer+cell+line+%28T47D%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D).</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).</li>
<li>Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+collagen+reorganization+on+mammary+epithelial+morphogenesis+in+a+3D+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model.</a> Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).</li>
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<li>Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+determines+the+breast+cancer+cells%27+phenotype%3A+organization+of+MCF7+cells+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures.</a> BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).</li>
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<li>Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing-like+immune+program+facilitates+postpartum+mammary+gland+involution+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression.</a> Int.J.Cancer. , (2014).</li>
<li>Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation%3A+evidence+for+negative+control+on+estrogen-sensitive+T47D+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).</li>
<li>Speroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+epithelial+organization+in+a+3D+breast+tissue+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model.</a> Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).</li>
<li>Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiestrogenic+effect+of+R5020%2C+a+synthetic+progestin+in+human+breast+cancer+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture.</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D sensível a hormônios para testar a ação dos hormônios no epitélio mamário. A resposta aos hormônios pode ser avaliada nos níveis de morfologia tecidual, proliferação celular e expressão gênica 12. Uma limitação dessa técnica é que a visualização durante o período de cultura é restrita à microscopia de luz, uma vez que as culturas são cultivadas em uma placa de fundo de plástico. O sistema de cultura 3D pode ser adaptado a placas de fundo de vidro para permitir imagens ...

Ao contrário das culturas 2D padrão, modelos de cultura de células de substituição 3D permitem o estudo do comportamento das células epiteliais num contexto fisiologicamente relevante, um tecido semelhante a um. culturas 3D da glândula mamária ajudaram a explicar muitos aspectos do desenvolvimento da glândula mamaria e neoplasia. No entanto, a maioria dos modelos de cultura 3D actualmente disponíveis não são adequados para estudar a acção hormonal, porque as linhas de células epiteliais humanos utilizados para a tarefa não possuem a expressão do receptor da hormona 6,7,9. Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio mamário humano que é adequado para estudar a ação hormonal 12. Este modelo utiliza a linha disponível comercialmente hormona de resposta epitelial humano da mama celular, T47D 3,11,13, que foram originalmente derivados de um derrame pleural obtido a partir de um paciente do sexo feminino de 54 anos com um carcinoma ductal infiltrante da mama. Nós usamos ratos colagénio de cauda de tipo 1 como uma matriz. Este culto 3Dure modelo é apropriado para o estudo da acção dos três principais hormonas mammotropic (estradiol, promegestona (um análogo da progesterona), e prolactina) em células epiteliais da mama humanas. Morfologia epitelial induzida por hormona pode ser avaliado quantitativamente ao longo do tempo através de análises morfométricas 12. Uma densidade de semeadura adequada permite que essas culturas em 3D para ser mantido por 2 semanas. Por esta altura, o desenvolvimento de estruturas é suficiente para uma avaliação quantitativa da acção da hormona robusta na morfologia epitelial. Os géis podem também ser colhidas a pontos de tempo anteriores para a proliferação celular e analisa a expressão do gene. Além disso, este modelo é apropriado para testar os efeitos de um tratamento hormonal sequencial; por exemplo, após o tratamento com estradiol durante a primeira semana e substituição com outra hormona / combinação de hormonas durante a semana seguinte. O efeito dos compostos estrogénicos e anti-estrogénios, tais como a ICI 182,780, também pode ser stumorreu usando este modelo de cultura 3D 12.

<table><tbody><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos de 12 poços (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de poliestireno de 15 ml</td><td>Carvão Ativado Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C-5510</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma</td><td>C1022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo 3</td><td>Worthington</td><td>S0C11784</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Equipado com laser HeNe 633nm</td></tr><tr><td>Dextran T-70</td><td>Abersham/Pharmacia</td><td>17-0280-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, sem vermelho de fenol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11339-021</td><td>Meio sem vermelho de fenol para uso hormonal</td></tr><tr><td>DMEM, baixa glicose, piruvato, sem glutamina, sem vermelho de fenol</td> Life <td>Technologies</td><td>11054-020</td><td>Meio sem vermelho de fenol para uso hormonal</td></tr><tr><td>17-&beta;-Estradiol</td><td>EMD Millipore</td><td>3301</td><td>Dissolvido em etanol</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Para uso com hormônios, deve ser despojado de carvão Dextrano&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtros (115 ml)</td><td>Nalgene</td><td>380-0080, 245-0045, 120-0020</td><td>0.88, 0.45, 0.20 micron, respectivamente&nbsp;</td></tr><tr><td>Formalina, 10%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SF93-20</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td> <td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780 (fulvestrant)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I4409-25MG</td><td>Dissolvido em DMSO</td></tr><tr><td>Microtome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de incorporação de tecidos</td><td>McCormick Scientific</td><td>39502004</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma</td><td>7794-10MU</td><td>Dissolvido em 10 ml de água destilada deionizada</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solução salina pH 7,4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Prolactina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4021-50UG</td><td>Dissolvido em água destilada e deionizada</td></tr><tr><td>Promegestone</td><td>Perkin Elmer</td><td>NLP004005MG</td><td>Dissolvido em Etanol</td></tr><tr><td>Colágeno de Cauda de Rato&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354236</td><td>Lotes podem conter concentrações variadas, note de acordo</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Miltex</td><td>4311</td><td></td></tr><tr><td>Processador de Tecidos de Bancada Semi-fechado</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Prepare 1N NaOH estoque</td></tr><tr><td>StaticMaster Escova antiestática&nbsp;</td><td>Pipetas</td> Sorológicas Amstat <td>C3500</td><td></td></tr><tr><td>Stripette&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>frascos T-25 Corning</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>430168</tr><tr><td>de Tecido</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-403E</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Wheaton, Vidro, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xileno&nbsp;</td><td>VWR</td><td>95057-822</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de cultura 3d hormone-responsive da human glândula mamária epitélio

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

O processo de morfogênese epitelial mamária é influenciado por hormônios. O estudo da ação hormonal no epitélio mamário usando culturas 2D é limitado à proliferação celular e aos desfechos de expressão gênica. No entanto, no organismo, a morfogênese mamária ocorre em um ambiente 3D. Os sistemas de cultura 3D ajudam a preencher a lacuna entre a cultura de células monocamada (2D) e a complexidade do organismo. Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio da mama humana que é adequado para estudar a ação hormonal. Ele usa a linha de células epiteliais de mama humana responsiva a hormônios comercialmente disponível, T47D, e colágeno de cauda de rato tipo 1 como matriz. Este modelo de cultura 3D responde aos principais hormônios mamotrópicos: estradiol, progestinas e prolactina. A influência desses hormônios na morfogênese epitelial pode ser observada após 1 ou 2 semanas de tratamento, de acordo com o endpoint. As culturas 3D podem ser colhidas para análise da morfogênese epitelial, proliferação celular e expressão gênica.

A Figura 1 resume o procedimento para a preparação das culturas em 3D sensível ao hormônio. estruturas epiteliais são observados em peças inteiras de géis cultivadas durante 2 semanas, na presença de E2 sozinho e em combinação com outras hormonas. Apenas as células individuais ou grupos de 2-3 células estão presentes quando não há hormonas são adicionados ao meio de cultura (meio de CDFBS) (Figura 2). Esta condição serve como um controlo negativo. As células...

Descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio da mama humana que é adequado para estudar a ação hormonal.

Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

O objetivo geral deste método de cultura 3D fisiologicamente relevante é testar a ação dos principais hormônios mamogênicos sobre a morfogênese epitelial mamária. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de endocrinologia e biologia da glândula mamária, como, por exemplo, como o estrogênio, a progesterona e a prolactina influenciam a morfogênese epitelial mamária. A principal vantagem deste método padronizado é que células epiteliais mamárias sensíveis a hormônios formam estruturas tridimensionais em resposta aos hormônios, de maneira semelhante ao que é observado in vivo.As implicações dessa técnica estendem-se às terapias contra o câncer de mama, pois trata-se de um sistema de cultura fisiologicamente relevante do complexo epitélio mamário humano. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao observar a falta de modelos padronizados in vitro para estudar como a morfogênese mamária humana é influenciada pelos hormônios. Comece contando o número de células em uma suspensão simples de células T47D.A forma como as células são mantidas é fundamental para a retenção de fenótipos responsivos a hormônios. Recomendamos verificações frequentes da resposta ao hormôn

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Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

O presente protocolo descreve a criação de culturas 3D 'no topo' de uma linha celular epitelial de mama não transformada, MCF10A, que foi modificada para estudar a transformação induzida pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF). A imuno-fluorescência tem sido usada para avaliar a transformação e é discutida em detalhes.

Mediadora fosfolipídida induzida transformação em culturas tridimensionais

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

Aprenda a criar culturas 3D de epitélio mamário humano sensíveis a hormônios usando células T47D. Este método padronizado permite estudar a morfogênese epitelial induzida por estrogênio, progesterona e prolactina para pesquisa em câncer de mama.

Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

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