Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Os objetivos gerais dos experimentos a seguir são determinar os efeitos do NTBC sobre a produção de P mein e a sensibilidade ao estresse oxidativo, bem como as concentrações inibitórias mínimas de antibióticos ou mics. Isso é alcançado adicionando-se NTBC a culturas bacterianas para determinar a concentração que reduz a produção de p melanina como um segundo passo. As culturas bacterianas são tratadas com NTBC e antibióticos, o que permitirá ao usuário determinar se o tratamento com NTBC tem algum efeito sobre as mics de antibióticos M.

Culturas tratadas com NTPC são expostas ao peróxido de hidrogênio para determinar a sensibilidade ao estresse oxidativo. Os resultados com o tratamento por NTPC mostram que o tratamento de bactérias genéticas com NTPC leva à redução na produção de pigmento e ao aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo, sem afetar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de antibióticos, com base em placas de teste de resposta ao estresse oxidativo e ensaios de CIM em microplacas, respectivamente. A principal vantagem da técnica de plaqueamento para estresse oxidativo em comparação com métodos existentes, como contagem de viabilidade e ensaios de difusão em disco, é a possibilidade de utilizar concentrações mais baixas de peróxido de hidrogênio, ao contrário das altas concentrações empregadas em outros ensaios. Geralmente, indivíduos novos no nosso método de determinação das CIMs de antibióticos enfrentam dificuldades, pois a falta de precisão na técnica de pipetagem introduz variabilidade entre as réplicas.

Essa variabilidade pode dificultar a determinação precisa do antibiótico. MIC Um dia antes do ensaio de MIC. Prepare culturas das cepas a serem testadas em LB com e sem.

Dois nitro, quatro trior etil benzoil um três cicloexano diona, ou NTBC. Esta demonstração utiliza o nível representativo de 300 micromolar de NTBC. O método de titulação para determinar a concentração apropriada de NTBC é descrito no texto do protocolo: incubar as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com aeração no dia seguinte.

Prepare soluções mestres de LB com NTBC e LB com DMSO para o ensaio de MIC para testar um antibiótico contra uma cepa, utilizando 600 micromolares de NTBC em dois mililitros de LB e misture. Para preparar a solução mestre de NTBC. O NTBC é adicionado numa concentração de 600 micromolares porque será diluído duas vezes quando o inóculo for adicionado.

Adicione um volume equivalente do veículo DMSO a dois mililitros de LB e misture para obter uma concentração final de 300 micromolar, produzindo assim a solução-mãe de NO NTBC. Essas duas soluções-mãe serão utilizadas para a preparação de soluções estoque de antibióticos, bem como para a montagem da série de diluições em placas de 96 poços. Em seguida, prepare as soluções de antibiótico nas soluções-mãe de LB mais NTBC ou LB mais DMSO.

Prepare a solução estoque de gentamicina mais ou menos NTBC a 64 microgramas por mililitro. Prepare a solução estoque de CANAMICINA mais ou menos NTBC a 256 microgramas por mililitro. Prepare a solução estoque de tobramicina mais ou menos NTB a oito microgramas por mililitro.

Após o preparo das duas soluções de antibiótico, adicione 100 microlitros de cada solução de antibiótico a quatro poços em uma placa de 96 poços na linha A. Por exemplo, a gentamicina deve ser colocada dos poços A1 a A4, a canamicina dos poços A5 a A8 e a tobramicina dos poços A9 a A12. Adicione 50 microlitros da solução mestra de LB mais NTBC ou LB mais DMSO às linhas B a H da placa de 96 poços, garantindo que uma placa contenha LB mais NTBC e outra contenha LB mais DMSO. Utilizando uma micropipeta, realize diluições seriadas em duas vezes dos antibióticos transferindo 50 microlitros da solução da linha A para a linha B. Misture a solução, troque as ponteiras da pipeta e transfira 50 microlitros da solução da linha B para a linha C. Repita esse procedimento para as linhas restantes após diluir a linha G. Remova 50 microlitros da solução dessa linha e descarte.

Utilize a linha H como controle sem antibiótico para o crescimento bacteriano. Recupere as culturas de incubação prolongada após lavar todas as culturas para eliminar a lanina presente no meio, meça a DO 600 das culturas e dilua as culturas de incubação prolongada em LB usando um micropipetador multicanal.

Adicione 50 microlitros da cultura bacteriana diluída nas placas apropriadas. Adicione bactérias em três poços para cada cepa e concentração de antibiótico. Adicione 50 microlitros de LB no quarto poço para servir como controle de contaminação bacteriana.

Cubra as placas de 96 poços com perfil e incube por aproximadamente 24 horas a 37 graus Celsius no dia seguinte. Examine visualmente as placas quanto ao crescimento bacteriano nos poços. A MIC é a menor concentração de antibiótico na qual não é observado crescimento bacteriano nas três réplicas de cada linhagem.

Para iniciar este procedimento, prepare culturas noturnas das cepas a serem testadas em LB com e sem NTBC, conforme mostrado anteriormente no dia seguinte. Prepare placas de LB contendo peróxido de hidrogênio como agente estressor oxidativo. Primeiro, derreta os frascos de ágar LB e resfrie o meio a aproximadamente 50 graus Celsius em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione peróxido de hidrogênio diretamente ao meio resfriado nas concentrações desejadas. Agite o frasco para misturar uma faixa de concentrações de peróxido de hidrogênio de zero a um milimolar, que é um bom ponto de partida.

Despeje imediatamente os meios nos recipientes e flame os superfícies para remover bolhas. O rendimento é de quatro placas para cada 100 mililitros de ágar LB. Marque as placas com a concentração de peróxido de hidrogênio.

Coloque as placas descobertas em uma cabine de fluxo biológico com o ventilador ligado por 30 minutos para remover a umidade em excesso das placas. As placas devem ser usadas no mesmo dia. Elas são preparadas enquanto as placas estão secando, lave e meça.

O OD 600 das culturas de crescimento noturno normaliza o OD 600 de todas as culturas de crescimento noturno para o valor mais baixo do conjunto de cepas em teste. Para isso, determine o volume de cultura necessário para diluir a cultura até o menor OD 600 em um volume total de um mililitro. Por exemplo, se uma cultura tem um OD 600 de três e o menor OD 600 do conjunto de cepas é 2,5, realize o seguinte cálculo, que resultará em 0,833 mililitros como o volume de cultura necessário. Coloque 0,833 mililitros de cultura em um tubo para microcentrífuga.

Em seguida, calcule a quantidade de LB mais NTBC ou LB mais DMSO necessária para ajustar o volume do cultivo a um mililitro. Neste exemplo, a quantidade seria de 0,167 mililitros; misture por vortexamento para manter os cultivos em uma concentração constante de NTBC ou DMSO. Realize diluições seriadas de fator dez dos cultivos noturnos normalizados em PBS mais NTBC ou PBS mais DMSO. Prepare soluções estoque de PBS mais NTBC e PBS mais DMSO, ampliando ou reduzindo conforme necessário, dependendo do número de cepas testadas. Para um conjunto de diluições de uma cepa, adicione 300 micromolar de NTBC ou um volume equivalente de DMSO ao PBS, atingindo um volume total de 720 microlitros. Adicione 90 microlitros de PBS mais NTBC ou PBS mais DMSO aos tubos microcentrífugos apropriados, previamente rotulados para as diluições seriadas de 10 elevado a menos um até 10 elevado a menos sete.

Adicione 10 microlitros de cultura ao tubo de diluição apropriado de 10 elevado a menos um, misture por vortex e transfira 10 microlitros da diluição de 10 elevado a menos um para o tubo de diluição de 10 elevado a menos dois. Altere as ponteiras da pipeta entre cada diluição e repita até que todas as diluições tenham sido realizadas. Plaque cinco microlitros das diluições de 10 elevado a menos três até 10 elevado a menos sete em placas de LV mais peróxido de hidrogênio em duplicata.

Para cada cepa, utilize uma ponta de pipeta diferente. Se os pontos forem plaqueados do mais diluído para o menos diluído, não incline nem vire a placa até que o líquido seque completamente na superfície. Incube as placas a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas, conforme a cepa.

Após o aparecimento de colônias de bom tamanho, fotografe as placas utilizando uma câmera CCD acima de um transluminador. Foram realizadas titulações com NTBC para determinar se o NTBC era capaz de reduzir a produção de melanina p em p aerogen e para identificar a concentração de NTBC que elimina ou reduz a produção de melanina p, para uso em ensaios adicionais, conforme mostrado aqui. O NTBC reduziu a produção de melanina PY de maneira dependente da dose em produtores de melanina p, mas não teve efeito na produção de pigmento em cepas que não produzem melanina p.

Esta tabela mostra os resultados do ensaio de MIC para diferentes cepas de p aerogen tratadas com e sem NTBC e vários antibióticos; os MICs foram registrados como a menor concentração do antibiótico que inibiu o crescimento bacteriano. O tratamento com NDBC não teve efeito sobre os MICs dos antibióticos para as cepas testadas. Um ensaio de plaqueamento em pontos para resposta ao estresse oxidativo foi realizado nas cepas produtoras e não produtoras de melanina de PIO tratadas com e sem NDBC.

A placa com zero milimolar de peróxido de hidrogênio mostrou que todas as cepas foram diluídas corretamente e foi observado um aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo quando as bactérias produtoras de melanina PIO foram tratadas com NTBC; cepas que não produzem melanina PIO foram mais sensíveis ao estresse oxidativo do que cepas que produzem melanina p. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar os efeitos do tratamento com NTBC na produção de melanina PIO por meio da avaliação da sensibilidade ao estresse oxidativo e aos MICs de antibióticos.