Name: Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a inibir a produção de piomelanina bacteriana com NTBC e avaliar o aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo. Este método auxilia pesquisadores em microbiologia a desenvolver estratégias contra infecções.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores agradecem a Dara Frank e Carrie Harwood por sua generosa contribuição de cepas. A Fundação de Pesquisa Milwaukee da Universidade de Wisconsin detém a patente nº 8.354.451; com alegações amplamente direcionadas ao tratamento ou inibição da progressão da infecção de um microrganismo em um paciente pela administração de um composto inibidor da dioxigenase 4-hidroxifenilpiruvato, como 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC). Os inventores são Graham Moran e Pang He. Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (R00-GM083147). A biblioteca mutante de transposons P. aeruginosa da Universidade de Washington é suportada pelo NIH P30 DK089507.

1. Preparação de Meios de Cultura, antibióticos e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclo-hexanodiona (NTBC) <ol><li> Adicione caldo LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl em H 2 O) e alíquota em volumes apropriados. Esterilizar em autoclave. Guarde-o em temperatura ambiente. </li><li> Adicione 100 ml de agar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar em H2O) em 250 ml de frascos. Esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o agar é derretido antes de verter em placas. NOTA: Os frascos contendo 100 ml de LB agar irá originar 4 placas. A quantidade de agar LB pode ser alterada para corresponder ao número de placas necessárias para o ensaio. </li><li> Adicione PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, KH 2 mM 2 PO 4) 16. Esterilizar em autoclave ou filtração e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> Preparar as soluções de antibióticos para a gentamicina, a canamicina, umad tobramicina. <ol><li> Prepare concentrações banco de antibióticos apropriados para P. aeruginosa estirpes contendo 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de canamicina, e 10 mg / ml de tobramicina. Dissolver os antibióticos em água, Esterilizar por filtração (0,2 mm), e armazenar a 4 ° C. Alterar os antibióticos e concentrações, dependendo da bactéria em estudo. </li></ol></li><li> Prepare as soluções estoque NTBC. Dissolve-se 10 mg de NTBC em 400 ul de DMSO. Isto produz uma concentração de 75,9 mM NTBC. Loja soluções estoque NTBC a -20 ° C. Soluções descongelar à temperatura ambiente, conforme necessário. NOTA: Diferentes fontes de NTBC têm diferenças de solubilidade. Determinar o veículo apropriado em que para dissolver o NTBC com base nas recomendações do fabricante e ajustar Passo 1.5 em conformidade. </li></ol> 2. NTBC Titulações de Estirpes Bacterianas <ol><li> Defina-se culturas nocturnas das estirpes a serem testadas. Adicionar 2 ml de caldo LB a 16 x 150 mm tubo de ensaios (um por cepa) e inocular com uma colônia isolada de cada estirpe. Incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento num agitador rotativo de cultura de tecidos em uma incubadora de ar. </li><li> No dia seguinte, preparar titulações de NTBC em caldo LB. Use uma primeira série 0-900 mM NTBC uma vez que diferentes cepas têm diferenças na sensibilidade à NTBC. <ol><li> Adicionar 1 ml de caldo LB a 4 para 5 tubos de ensaio (16 x 150 mm) por estirpe. </li><li> Adicionar a solução estoque NTBC (75,9 mM), para os tubos de ensaio (16 x 150 mm) numa gama de concentrações. Ver Tabela 1 para as concentrações e volumes NTBC imagens correspondentes a adicionar a 1 mL de caldo de LB. </li></ol></li><li> Medir a OD 600 das culturas durante a noite. Lave as culturas antes de tomar OD 600 leituras para eliminar pyomelanin presente na mídia. <ol><li> Lavam-se as culturas por centrifugação de 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante e as células peletizadas com frouxamenteuma micropipeta e ressuspender o pellet celular sólido em 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Inocular tubos de titulação em OD 600 de 0,05. Calcula-se a quantidade necessária da cultura lavou-se para inocular os tubos. NOTA: Use as culturas lavadas para inoculações desde pyomelanin não deve estar presente. </li><li> Incubar os tubos de titulação durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C com arejamento usando um tecido rotador cultura numa incubadora de ar. </li><li> Fotografar os tubos de titulação e comparar a produção de pigmento dentro e entre as cepas para determinar a quantidade de NTBC de usar para MIC e estresse oxidativo ensaios. Use OD 600 leituras para determinar a quantidade de pyomelanin na célula livre sobrenadante da cultura e para determinar a densidade celular. Observação: A razão OD 600 de pyomelanin no sobrenadante da cultura de células pode ser calculada para quantificar as diferenças na produção pyomelanin após o tratamento com NTBC. </li></ol> 3. Antibiótico Inhibi mínimoConcentração (MIC) Ensaio tory em placas de 96 poços <ol><li> Configure culturas durante a noite das estirpes a ser testado em LB com e sem NTBC. NOTA: Este protocolo é descrito usando o nível representante de 300? M NTBC. O nível apropriado de NTBC a ser utilizado é determinado no passo 2.6. <ol><li> Adicionar 300 ^ M a 2 ml NTBC LB. Adicionar um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml de LB para a condição não NTBC. </li><li> Usando palitos estéreis, inocule os tubos com uma colônia de bactérias isoladas. Haverá uma cultura com NTBC e uma cultura sem NTBC para cada estirpe. Incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento usando um tecido rotador cultura numa incubadora de ar. </li></ol></li><li> No dia seguinte, fazer LB + NTBC e soluções mestre LB + DMSO para a criação do ensaio MIC. Adicionar NTBC a uma concentração de 600 uM como este será diluído duas vezes quando inoculo é adicionado, dando origem a uma concentração final de 300 uM. <ol><li> Para testar um antibiótica para uma estirpe, adicionar 600 | iM NTBC a 2 ml de LB e misturar para tornar a solução NTBC mestre. Adicionar um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml de LB e misturar para fazer a solução não NTBC mestre. Usar estas soluções para criar soluções-mãe de antibióticos, bem como para a criação de séries de diluição em placas de 96 poços. NOTA: As formulações de solução mestre trará solução extra para contabilizar erros de pipetagem. As soluções mestre pode ser escalada para cima ou para baixo, conforme necessário, dependendo do número de antibióticos e estirpes testadas. </li></ol></li><li> Preparar as soluções de antibióticos nas soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO. NOTA: A concentração do antibiótico na Estas soluções devem ser o dobro da concentração final desejada. Deve ser feita solução suficiente para transferir 100 ul de quatro poços de uma placa de 96 poços. <ol><li> Prepare gentamicina +/- solução estoque NTBC a 64 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 0,288 ul de estoque de gentamicina (100 mg / mL) a 450jil de LB + NTBC ou mestre solução de LB + DMSO. NOTA: A concentração máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 32 ug / ml. </li><li> Faça a canamicina +/- solução estoque NTBC a 256 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 3,84 l de estoque canamicina (30 mg / ml) a 450 ul soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO. NOTA: A concentração máxima de canamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 128 ug / ml. </li><li> Prepare tobramicina +/- solução estoque NTBC a 8 ug / ml. Para tornar esta solução, adicionar 0,36 l de estoque tobramicina (10 mg / ml) a 450 ul soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO. NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, a concentração máxima de tobramicina é de 4 ug / ml. NOTA: As concentrações de antibióticos e pode ser regulado para as bactérias a serem testadas. </li></ol></li><li> Adiciona-se 100 ul de cada solução de antibiótico 2x para poços quatro numa placa de 96 poços. Coloque essas soluções em linha A. Para example, a gentamicina, deve ser colocado em A1 a A4, canamicina devem ser colocados em A5 a A8 e tobramicina deve ser colocado em meio A9 A12. Ver Figura 1A um diagrama de uma placa de 96 poços configurado. NOTA: antibióticos múltiplos pode ser testado em um prato, mas apenas uma estirpe deve ser testado por placa para eliminar o potencial de contaminação cruzada de outras estirpes. </li><li> Adicionar 50 ul da solução de mestre de LB + NTBC ou LB + DMSO a linha B a H da placa de 96 poços. Certifique-se que uma placa é LB + NTBC e um prato é LB + DMSO. Veja a Figura 1A. <ol><li> Use de LB + NTBC para os antibióticos em LB + NTBC. Use de LB + DMSO para os antibióticos em LB + DMSO. </li></ol></li><li> Usando uma micropipeta realizar diluições em série duas vezes dos antibióticos através da transferência de 50 mL da solução de linha A para a linha B. Misturar a solução, mudar as pontas de pipetas, e transferir 50 ul da solução a partir da linha B para a linha C para Repetir o remainilinhas GN. Depois de se diluir linha L, remover 50 ul da solução a partir dessa linha e descarte. Utilize linha H como um antibiótico sem controle para o crescimento bacteriano. Ver Figura 1B. NOTA: Cada poço nas filas A a G contém agora 50 uL de antibiótico em LB + NTBC ou LB + DMSO a 2X a concentração final desejada. Fila H contém LB + NTBC ou LB + DMSO sem antibióticos. </li><li> Medir a OD 600 das culturas durante a noite. Lave todas as culturas antes de tomar OD 600 leituras para eliminar pyomelanin presente na mídia. <ol><li> Lavam-se as culturas por centrifugação de 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante com uma micropipeta e ressuspender o pellet celular em 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Dilui-se as culturas durante a noite para 2.75x10 5 ufc / mL em LB. NOTA: Assume-se que uma unidade DO600 é o equivalente de 1x10 9 CFU / ml para P. aeruginosa. OD para as conversões de UFC / mL podem ser different em outras bactérias. </li><li> Adicionar 50 ul da cultura bacteriana diluído ao poço adequado. NOTA: As culturas são crescidas em NTBC deve ser adicionada aos poços contendo NTBC e culturas cultivadas em DMSO deve ser adicionado às cavidades contendo DMSO. Ver Figura 1B. <ol><li> Adicionar bactérias a três poços para cada estirpe e concentração do antibiótico. Adicionar 50 ul de LB para o quarto poço para actuar como um controlo para a contaminação bacteriana. Ver Figura 1B. </li><li> Usar uma pipeta de multi-canal para inocular os poços. Assegurar que pipeta pontas estão perto do fundo dos poços, quando a adição de inoculo para evitar a contaminação de poços vizinhos. NOTA: A adição de cultura bacteriana aos poços irá diluir as concentrações de antibiótico e NTBC duas vezes. </li></ol></li><li> Cobrir as placas de 96 poços com parafilme e incubar a cerca de 24 horas a 37 ° C. Incubar as placas de 96 poços estaticamente, numa incubadora de ar. </li><li> Examinaras placas para o crescimento bacteriano nas cavidades. A MIC é a concentração mais baixa de antibiótico em que nenhum crescimento bacteriano é visto para todas as três repetições de cada estirpe. <ol><li> Examine visualmente a placa de crescimento ou ler usando um conjunto leitor de placas de DO600. </li></ol></li></ol> 4. Ponto Ensaio Placa de resposta ao estresse oxidativo <ol><li> Defina-se culturas nocturnas das estirpes a ser testado em meio LB com ou sem NTBC tal como descrito na etapa 3.1. </li><li> No dia seguinte, para preparar as placas de agar LB contendo H 2 O 2 como um estressor oxidativo. Uma gama de H 2 O 2 concentrações de 0 a 1 mM é um bom ponto de partida. <ol><li> Derreter os frascos de LB-agar. Super meios para aproximadamente 50 ° C à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar H 2 O 2 directamente sobre o suporte arrefecidos nas concentrações desejadas. Frascos agite para misturar. Ver Tabela 2 para as concentrações de H 2 O 2e volumes de concentrado H 2 O 2 a acrescentar. Estes valores baseiam-se em 100 ml de LB com agar. </li><li> Verter em placas imediatamente após a adição de H 2 O 2 e a superfície da chama para remover as bolhas. O rendimento é de 4 placas por 100 ml de LB com agar. Marcar as placas com a concentração de H 2 O 2. </li><li> Colocar as placas descoberto numa câmara de fluxo biológico com o ventilador corrida durante 30 min para remover o excesso de humidade das placas. NOTA: Use as placas no mesmo dia em que são preparados. Não fazer isso pode resultar em dados inconsistentes. NOTA: factores de stress oxidativo, tais como o paraquat pode ser substituído por H 2 O 2 neste ensaio. As concentrações utilizadas para outros factores de stress oxidativo pode ser diferente do que os usados ​​para a H 2 O 2. </li></ol></li><li> Lavar e medir a DO 600 das culturas durante a noite, tal como descrito na etapa 3.7. </li><li> Normalizar o OD 600 de todo o cu durante a noiteltures para o menor valor para o conjunto de estirpes que está sendo testado. P. aeruginosa tem geralmente uma DO600 de aproximadamente 2,5, quando crescidas durante a noite em LB ou LB + NTBC + DMSO. <ol><li> Determinar o volume de cultura necessárias para diluir a cultura para o menor OD 600 num volume total de 1 ml. Por exemplo, se uma cultura tem um OD 600 de 3 e menor do OD 600 para o conjunto de estirpes é de 2,5, executar o seguinte cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (X). x = 0.833 ml. 0,833 ml de cultura vai ser colocado num tubo de microcentrífuga. </li><li> Calcular a quantidade de LB + NTBC (300 uM) ou DMSO de LB + necessária para trazer o volume de cultura para 1 ml. Para o exemplo no passo 4.4.1, a quantidade de LB + NTBC ou LB + DMSO adicionado à cultura seria 0.167 ml (1 ml de volume total de 0,833 ml - de cultura). Adicione as soluções concentradas de LB + NTBC e LB + DMSO para utilizar para estes diluições com base no volume necessário para diluir todas as estirpes. </li><li> Misture a cultura e LB + NTBC ou LB + DMSO em vórtice. </li></ol></li><li> Para manter as culturas numa concentração constante de NTBC ou DMSO, realizar diluições em série de dez vezes das culturas durante a noite em PBS + normalizados NTBC ou PBS + DMSO. <ol><li> Faça as soluções concentradas de PBS + NTBC e PBS + DMSO. Para um conjunto de diluições de uma estirpe, misturar 300 NTBC uM ou um volume equivalente de DMSO com PBS para se obter um volume total de 720 ul. Escalar esses stocks cima ou para baixo, dependendo de quantas cepas são testadas. </li><li> Etiqueta para tubos de microcentrífuga através de diluições 10 -1 10 -7 série. Adicionar 90 ul de PBS + NTBC ou PBS + DMSO para os tubos apropriados. Use PBS + NTBC para as estirpes cultivadas em LB + NTBC e usar PBS + DMSO para as estirpes cultivadas em LB + DMSO. </li><li> Adicionar 10 ul de cultura para o tubo 10 -1 de diluição apropriado. Misturar em vortex e transferir 10 ul da diluição 10 -1 para o tubo de diluição 10 -2. Repetir até que todas as diluições foram Performou. Alterar pontas de pipeta entre diluições. </li></ol></li><li> Spot 5 ul de 10 -3 a 10 -7 através diluições em placas de LB + H 2 O 2 placas em duplicado para cada estirpe. Use uma ponta de pipeta se manchas são banhados de mais diluída para menos diluído (10 -7 a 10 -3). Não ponta ou incline a placa até que o líquido tenha secado na placa. </li><li> Incubar as placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de ar), dependendo da estirpe. NOTA: P. aeruginosa PAO1 terá bons colônias porte sobre LB após 24 horas de incubação. Incubar estirpes até que colónias têm aproximadamente o mesmo tamanho que PAO1. </li><li> Fotografar as placas usando uma câmera CCD acima de um transluminador. Opcionalmente, editar as fotos para o contraste e cultura para o mesmo tamanho. Contar o número de colónias em cada local para determinar alterações na sensibilidade ao estresse oxidativo. </li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+hmgA++of+Pseudomonas+aeruginosa++to+pyomelanin+hyperproduction%2C+stress+resistance+and+increased+persistence+in+chronic+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection.</a> Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).</li>
<li>Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia++Produces+a+Pigment+with+Antioxidant+Properties+Using+a+Homogentisate+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate.</a> J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).</li>
<li>Schmaler-Ripcke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pyomelanin%2C+a+Second+Type+of+Melanin%2C+via+the+Tyrosine+Degradation+Pathway+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).</li>
<li>Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+Function+of+Pyomelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers+In+Tech%22%5BJournal%5D)">Properties and Function of Pyomelanin.</a> Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).</li>
<li>Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chemicals+to+melanins+re-examined%3A+adsorption+of+some+drugs+to+the+surface+of+melanin+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles.</a> Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).</li>
<li>Barza, M., Baum, J., Kane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antibiotic+activity+in+vitro+by+synthetic+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Melanin+on+Microbial+Virulence+and+Clinical+Resistance+to+Antimicrobial+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).</li>
<li>Arias-Barrau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Homogentisate+Pathway%3A+a+Central+Catabolic+Pathway+Involved+in+the+Degradation+of+L-Phenylalanine%2C+L-Tyrosine%2C+and+3-Hydroxyphenylacetate+in+Pseudomonas+putida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.</a> J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).</li>
<li>Ernst, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mosaicism+is+conserved+but+not+unique+in+Pseudomonas+aeruginosa++from+the+airways+of+young+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis.</a> Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).</li>
<li>Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+tyrosine+degradation+in+Vibrio+cholerae++The+strain+ATCC+14035+as+a+prokaryotic+melanogenic+model+of+homogentisate-releasing+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).</li>
<li>Hunter, R. C., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Putative+ABC+Transporter%2C+HatABCDE%2C+Is+among+Molecular+Determinants+of+Pyomelanin+Production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).</li>
<li>Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NTBC+treatment+of+the+pyomelanogenic+Pseudomonas+aeruginosa++isolate+PA1111+inhibits+pigment+production+and+increases+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress.</a> Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).</li>
<li>Kavana, M., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+%284-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+with+the+Specific+Inhibitor+2-%5B2-Nitro-4-%28trifluoromethyl%29benzoyl%5D-1%2C3-cyclohexanedione%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.</a> Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanin-overproducing+transposon+mutants+of+Pseudomonas+putida+F6%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6.</a> FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Roy-Burman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+is+associated+with+death+in+lower+respiratory+and+systemic+Pseudomonas+aeruginosa+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections.</a> J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).</li>
<li>Jacobs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).</li>
<li>Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanogenesis+in+dermatophyte+species+in+vitro++during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection.</a> Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).</li>
<li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin%27s+Chemical+Structure+and+Paramagnetism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092(2011).</li>
<li>Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from:
	 
 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método de titulação NTBC descrito neste protocolo permitirá ao usuário determinar se o NTBC pode reduzir ou eliminar a produção de piomelanina em bactérias e determinar a concentração de NTBC necessária. A etapa mais crítica no ensaio de titulação NTBC é determinar a faixa de concentrações de NTBC a serem usadas no ensaio. Diferentes cepas de P. aeruginosa têm diferentes sensibilidades ao NTBC, e as cepas de laboratório podem ser mais sensíveis ao NTBC do que os isolados clínicos12 (Figura 2...

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram negativa que produz uma variedade de pigmentos, incluindo piomelanina, um pigmento marrom-avermelhado que ajuda a fornecer proteção contra o estresse oxidativo1-4 e se liga a uma variedade de compostos, incluindo antibióticos aminoglicosídeos5-7. A produção de piomelanina é causada por um defeito na via do catabolismo da tirosina4,8, seja por deleções ou mutações do gene que codifica a homogentisato 1,2-dioxigenase (HmgA)1,9 ou por desequilíbrios nas várias enzimas da via10. O homogentisato se acumula devido à inativação de HmgA e é secretado e oxidado para formar piomelanina11. A produção de piomelanina pode ser abolida ou reduzida de maneira dose-dependente por meio do tratamento com o herbicida 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)12, que inibe a 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (Hpd) na via do catabolismo da tirosina13. Hpd é necessário para a formação de homogentisato e, portanto, piomelanina11. 
Descrevemos em detalhes três técnicas que foram importantes em nossos estudos de tratamento NTBC de cepas produtoras de piomelanina de P. aeruginosa. Essas técnicas incluem titulação de NTBC para determinar as concentrações que abolirão ou reduzirão a produção de piomelanina em cepas produtoras de piomelanina laboratoriais e clínicas, determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de antibióticos quando as bactérias são tratadas com NTBC e a sensibilidade resultante ao estresse oxidativo com tratamento NTBC.
O ensaio de titulação que desenvolvemos serve a dois propósitos. Primeiro, o ensaio permitirá ao usuário determinar se o NTBC pode abolir ou reduzir a produção de piomelanina na bactéria que está sendo estudada e em quais concentrações. Isso permitirá que o usuário determine a sensibilidade ao NTBC, uma vez que diferentes cepas de bactérias podem ter diferentes sensibilidades a esse composto, como observado em P. aeruginosa12. Em segundo lugar, o ensaio de titulação NTBC permitirá que o usuário determine a concentração apropriada de NTBC para usar em ensaios subsequentes, como CIM antibiótica e ensaios de resposta ao estresse oxidativo, se o objetivo for abolir ou reduzir a produção de piomelanina e determinar os efeitos da redução do pigmento. 
O ensaio de titulação funciona porque uma diferença visível na produção de piomelanina pode ser observada em cepas tratadas com NTBC e as diferenças na produção de piomelanina dependem da dose12. Além disso, essa técnica pode ser aplicada ao estudo de outros compostos que podem eliminar ou aumentar a produção de pigmentos em bactérias.
As CIMs de antibióticos são usadas para determinar a sensibilidade das bactérias aos antibióticos. Existem vários métodos para determinar as CIMs, incluindo placas de diluição em ágar e diluições em caldo14. As diluições do caldo podem ser realizadas em pequenos tubos de ensaio ou em uma placa de microtitulação de 96 poços. O método de determinação da CIM em placa de microtitulação aqui descrito permitirá ao usuário testar uma ampla gama de antibióticos usando um mínimo de recursos. O ensaio fornece reprodutibilidade, bem como flexibilidade no número de antibióticos e cepas testadas por este método. Além disso, com a incorporação de NTBC no ensaio, o usuário pode determinar se a eliminação ou redução da produção de piomelanina altera a sensibilidade aos antibióticos em bactérias que produzem piomelanina.
A resposta bacteriana ao estresse oxidativo pode ser testada de várias maneiras. Os métodos mais comuns descritos são contagens viáveis de bactérias submetidas ao estresse oxidativo por um período de tempo1 ou ensaios de difusão em disco de estresse oxidativo15. Esses métodos tendem a usar altas concentrações de estressores oxidativos para examinar os efeitos do estresse oxidativo em bactérias e os resultados podem ser bastante variáveis entre as réplicas biológicas. O ensaio de contagem viável também tende a usar mais placas de ágar do que os outros métodos. O ensaio de placa pontual que descrevemos usa baixas concentrações de H2O2 e permite que o usuário teste a resposta ao estresse oxidativo de várias cepas usando um mínimo de placas. O ensaio também é consistentemente reprodutível entre réplicas técnicas e biológicas. Como a piomelanina está envolvida na resistência ao estresse oxidativo, a incorporação de NTBC no ensaio permite ao usuário determinar os efeitos da eliminação da produção de piomelanina na resistência ao estresse oxidativo.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Também chamado de nitisinona.&nbsp; Solúvel em DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30% em peso em H2O.&nbsp; Estabilizado.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>Solúvel em H2O.&nbsp; Esterilize por filtro.</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Solúvel em H2O.&nbsp; Esterilize por filtro.</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Solúvel em H2O.&nbsp; Esterilize por filtro.</td></tr></tbody></table>

métodos para inibir bacteriana pyomelanin produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

A piomelanina é um pigmento extracelular marrom-avermelhado produzido por várias espécies bacterianas e fúngicas. Este pigmento é derivado da via do catabolismo da tirosina e contribui para o aumento da resistência ao estresse oxidativo. A produção de piomelanina em Pseudomonas aeruginosa é reduzida de maneira dependente da dose através do tratamento com 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC). Descrevemos um método de titulação usando múltiplas concentrações de NTBC para determinar a concentração do medicamento que reduzirá ou abolirá a produção de piomelanina em bactérias. O método de titulação tem um resultado facilmente quantificável, uma redução visível na produção de pigmento com o aumento das concentrações de drogas. Também descrevemos um método de placa de microtitulação para testar a concentração inibitória mínima (CIM) de antibióticos em bactérias. Este método usa um mínimo de recursos e pode ser facilmente ampliado para testar vários antibióticos em uma placa de microtitulação para uma cepa de bactéria. O ensaio MIC pode ser adaptado para testar os efeitos de compostos não antibióticos no crescimento bacteriano em concentrações específicas. Finalmente, descrevemos um método para testar a sensibilidade bacteriana ao estresse oxidativo, incorporando H2O2 em placas de ágar e identificando múltiplas diluições de bactérias nas placas. A sensibilidade ao estresse oxidativo é indicada por reduções no número e tamanho da colônia para as diferentes diluições em placas contendo H2O2 em comparação com um controle sem H2O2. O ensaio de placa pontual de estresse oxidativo usa um mínimo de recursos e baixas concentrações de H2O2. É importante ressaltar que também tem boa reprodutibilidade. Este ensaio de placa pontual pode ser adaptado para testar a sensibilidade bacteriana a vários compostos, incorporando os compostos em placas de ágar e caracterizando o crescimento bacteriano resultante.

Titulações NTBC As titulações NTBC foram utilizados para determinar se NTBC foi capaz de reduzir a produção em P. pyomelanin aeruginosa, e também identificar a concentração de NTBC que elimina ou reduz a produção pyomelanin para utilização em ensaios adicionais. Pode haver variações nos níveis de pyomelanin produzida em diferentes repetições, mas as tendências gerais permanecer constante. O ensaio de titulação NTBC também poderia ser modificado para testar outros compostos ...

A produção bacteriana de piomelanina resulta em aumento da resistência ao estresse oxidativo e virulência. Relatamos técnicas que podem ser usadas para determinar a inibição da produção de piomelanina e testar o aumento resultante na sensibilidade ao estresse oxidativo em bactérias, bem como determinar a concentração inibitória mínima de antibióticos (CIM).

Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Os objetivos gerais dos experimentos a seguir são determinar os efeitos do NTBC sobre a produção de P mein e a sensibilidade ao estresse oxidativo, bem como as concentrações inibitórias mínimas de antibióticos ou mics. Isso é alcançado adicionando-se NTBC a culturas bacterianas para determinar a concentração que reduz a produção de p melanina como um segundo passo. As culturas bacterianas são tratadas com NTBC e antibióticos, o que permitirá ao usuário determinar se o tratamento com NTBC tem algum efeito sobre as mics de antibióticos M.Culturas tratadas com NTPC são expostas ao peróxido de hidrogênio para determinar a sensibilidade ao estresse oxidativo. Os resultados com o tratamento por NTPC mostram que o tratamento de bactérias genéticas com NTPC leva à redução na produção de pigmento e ao aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo, sem afetar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de antibióticos, com base em placas de teste de resposta ao estresse oxidativo e ensaios de CIM em microplacas, respectivamente. A principal vantagem da técnica de plaqueamento para estresse oxidativo em comparação com métodos existentes, como contagem de viabilidade e ensaios de difusão em d

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio de placa pontual adaptado para avaliar as respostas ao estresse oxidativo de cepas bacterianas. Algumas cepas produzem piomelanina, um pigmento antioxidante. Por outro lado, as cepas tratadas com um agente de teste, levando à redução da produção de piomelanina, exibem maior suscetibilidade ao estresse oxidativo, resultando em diminuição da viabilidade celular em comparação com as cepas produtoras de piomelanina.

Um ensaio de placa pontual para avaliar as respostas ao estresse oxidativo em cepas bacterianas

Este vídeo demonstra um método baseado em placas de microtitulação para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de antibióticos de teste contra bactérias. Ao adicionar uma suspensão do patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa a uma placa de microtitulação contendo diluições seriadas de um antibiótico de teste e um inibidor da produção de piomelanina pela bactéria, a densidade óptica dos poços é medida para calcular a concentração inibitória mínima do antibiótico e o impacto do...

Um método de placa de microtitulação para avaliar a concentração inibitória mínima de um antibiótico

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H2O2, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.

Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

Aqui, apresentamos um protocolo para inativar bactérias patogênicas com espécies reativas de oxigênio produzidas durante a fotólise do mononucleotídeo de flavina (FMN) sob irradiação de luz azul e violeta de baixa intensidade. A fotólise FMN demonstra ser um método simples e seguro para processos sanitários.

Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura em HNM usando tBHP, protocolos padronizados para análise de marcadores-chave de senescência, incluindo paragem do crescimento, atividade SA-β-galactosidase e fatores SASP.

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura induzida por estresse em melanócitos humanos primários usando hidroperóxido de tert-butila

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Aprenda a inibir a produção de piomelanina bacteriana com NTBC e avaliar o aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo. Este método auxilia pesquisadores em microbiologia a desenvolver estratégias contra infecções.

Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Explorar mais vídeos