Name: Avaliação da sensibilização comportamental induzida por cocaína e preferência por lugar condicionado em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a avaliar sensibilização comportamental e preferência condicionada por lugar em ratos usando ensaios de CPP e atividade locomotora. Este método permite estudar mecanismos de recompensa e plasticidade induzida por drogas.

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Os autores agradecem a Karen Dietz e Shari Birnbaum para a entrada anterior sobre considerações de design comportamentais e Lauren Peca para ajudar com testes de comportamento. Os autores também agradecer o apoio generoso da Simons Foundation (Simons Fundação Iniciativa Autism Research subvenção para CWC), NIDA (DA008277, DA027664 e DA030590 a CWC, F32DA027265 para LNS e F32DA036319 a RDP), a Fundação FRAXA Pesquisa e Eleanor e Miles Programa Shore Fellowship (suporte bolsa para LNS) e do Programa de Bolsas Kaneb John (suporte bolsa para MT).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o McLean Hospital. NOTA: O protocolo a seguir descreve uma única abordagem para a CPP e sensibilização locomotora, muitos detalhes dos quais diferem de outros protocolos de sucesso (testes de fase escura por exemplo, luz- vs., consecutiva vs. dosagem intermitente, etc.). Noviços podem querer começar com estes protocolos, ou simplesmente usá-los como guias, adaptando alterações a partir da literatura com base na pergunta experimental (s) em questão. métodos automáticos de medição são descritos; No entanto, é possível utilizar meios não automatizados para cada ensaio (isto é, a gravação vídeo, mão-de pontuação). 1. preferência por lugar condicionado <ol><li> Equipamentos e Room Set-Up: <ol><li> Pega ratinhos experimental para 1-3 min cada dia, durante pelo menos 3-5 dias antes do teste. Nota: Nunca-tratada camundongos pode achar remoção da câmara de stressful, o que pode interferir ou alterar condicionado. </li><li> Obter quatro ou mais aparelhos CPP três câmaras, de preferência, equipados com photobeams para coleta automatizada de dados 18. Certifique-se que cada câmara tem duas câmaras maiores, visually- e tactilely-distintas na conexão com uma câmara menor, neutro através de portas que podem ser levantado / descido para controlar o acesso. Tampas em cada câmara deve abrir para a inserção / remoção de ratos e ser montado com luzes pequenas, individualmente controláveis ​​(reguláveis) (um por câmara). Nota: Os projetos de câmara CPP variam e podem ser adquiridos comercialmente ou construídos pelos pesquisadores. Para o projeto &quot;equilibrado&quot;, um esquema recomendada é de uma maior câmara com paredes brancas e piso de grade de arame e outro com paredes pretas e piso bar. A câmara do meio deve ter paredes cinza e cinza piso Plexiglass sólida. Para fins de esclarecimento, estas câmaras vai ser referido como &quot;branco&quot;, &quot;preto&quot; e &quot;meio&quot;.As tampas devem ser claras Plexiglass. configurações do compartimento alternados (uma ou duas câmaras) também são possíveis e discutido em outro lugar (ver discussão). </li><li> Configuração da sala como será durante o teste: desligar ou definir luzes do teto para a configuração mais obtuso e feche a porta. Use um medidor de luz dentro de cada câmara e definir as luzes da tampa de modo que as câmaras de coração são ligeiramente mais brilhante (15-20 lux) do que as câmaras a preto e branco (6-10 lux) a fim de desencorajar os ratos de passar o tempo lá. NOTA: Se o tempo médio gasto no meio é tanto ou mais do que nas câmaras pretas ou brancas, aumentar ainda mais o contraste de iluminação descrito no Passo 1.1.3. Como alternativa, use piso menos atraente para o meio. (Por exemplo, ~ 220 furos de 0,5 cm de diâmetro, uniformemente espaçados em 6 x 3,5 x ¼ &quot;Plexiglas), mas evitar fazer essa câmara aversivo. Pilot quaisquer alterações para garantir que diminui com o tempo médio não são devido a reduções na exploração totais (cruzamentos) . </li><li> Programa coleta automática de dados ( &quot;procedimento&quot; Figura 1A) ou coletar dados manualmente de acordo com os seguintes parâmetros. Definir ensaios para começar após o primeiro intervalo feixe em qualquer câmara de condicionamento. Definir as sessões de &quot;teste&quot; para ser 20 min de comprimento e para controlar o tempo gasto e feixe breaks em cada câmara. Definir as sessões de &quot;condicionamento&quot; para ser 30 min longa e (opcionalmente) para medir intervalos de viga em cada câmara. Defina todas as luzes da câmara para iluminar durante o julgamento. </li><li> Prepare volume completo de solução de cocaína necessária para o experimento em questão. Dissolver o cloridrato de cocaína em 0,9% de NaCl (salina), baseando-se a concentração final num volume de injecção de 0,1 ml / 10 g de peso corporal (por exemplo, para uma dose de 5 mg / kg, a concentração da solução é de 0,5 mg / ml). mistura Vortex por 30-45 seg, filtro estéril (0,2 mm filtros de seringa) e armazenar a RT. </li></ol></li><li> Teste: NOTA: O cronograma geral para a CPP é pré-teste, condicionamento eem seguida, pós-teste. O pré-teste pode ser separado a partir condicionado por 1-3 dias; no entanto, condicionado e no dia pós-teste deverá ocorrer em dias consecutivos (Figura 2A). Este tempo deve ser mantida a mesma para todos os grupos na mesma experiência. <ol><li> Teste durante a fase de luz dos animais utilizando o mesmo aparelho para cada animal ao longo dos dias. </li><li> Cada dia de teste (ou seja, testes e dias de condicionamento), mova ratos à antecâmara comportamental e permitir-lhes para se sentar sem ser perturbado em suas gaiolas para 1-1,5 horas antes do julgamento. Escolha um local onde os ratos podem ser movidos rapidamente de sua gaiola para o aparelho, com o mínimo de interrupção, quando o julgamento começa. Ligue todos os equipamentos de modo que quaisquer ruídos associados com o teste (por exemplo, ventiladores equipamentos) estão presentes. </li><li> Limpe cuidadosamente cada aparelho (paredes internas, pisos e bandejas) com leve, álcool, glicol-ETHER- ou à base de amônia desinfecção limpa antes e depois de cada rato (use o same tipo de produto de limpeza durante todo o experimento). Não negligencie inferiores pavimentação. </li><li> Verifique se as luzes da sala são definidas de forma adequada (desligado ou desactivado) no início de cada dia. </li><li> Prosseguir com o seguinte de acordo com se é um &quot;teste&quot; ou o dia de &quot;condicionamento&quot;: <ol><li> Em julgamento Dias 1 e 6 (ou seja, o pré e pós-testes), coloque as portas inter-câmara na posição aberta (Figura 2B). </li><li> Carregar o programa de computador &quot;teste&quot; e digite IDs de origem animal (Figura 1A), em seguida, emitir comando de arranque (Figura 1B), se aplicável. </li><li> Suavemente inferior cada rato na câmara meio do seu aparato atribuído, de frente para a parede de trás, e suavemente feche a tampa. Uma vez que todas as câmaras são carregados, deixar a sala de testes e minimizar o ruído. </li><li> Deixar ratos dentro de cada aparelho até que ensaios para todos os ratos têm fechado / terminado (Figura 1C). dados de ensaios de exportação. </li></ol></li> &lt;li&gt; Pouco antes ou após o pré-teste, pesar os animais. Use estes pesos para cálculos de dose durante o condicionamento. </li><li> A fim de se preparar para ensaios condicionado, calcule pré-teste &quot;preferência&quot; de cada rato para as câmaras de preto e branco, subtraindo o tempo gasto em cada uma delas a partir do outro (isto é, &quot;black menos branco&quot; e &quot;menos branco preto&quot;; veja A Figura 3, colunas 9 e 10). </li><li> Desde camundongos com fortes preferências iniciais tornar equilíbrio difícil, estabelecer um limite aceitável para os escores de preferência (por exemplo, &lt;33% do tempo de ensaio total) e não incluem ratos que ultrapassá-lo a partir de cálculos. Use um limite liberal (&lt;66% do tempo de ensaio total) para maximizar a inclusão, quando a redução é provável após a conclusão do teste (por exemplo, devido a fora do alvo manipulações cirúrgicas). NOTA: Os ratos que excedam o limite ainda pode ser testado, com uma tentativa de manter as suas preferências pré-teste equilibrada. Mais tarde, tratinhos stas podem ser excluídos da análise, se necessário, para equilibrar a pontuação do pré-teste. Se extremas preconceitos pré-teste (isto é,&gt; 800 seg) afetam desproporcionalmente um grupo, considerar alterar os ambientes de condicionamento e / ou utilizar outros ensaios. </li><li> Escolha a câmara de preto ou branco como a câmara de fármaco-emparelhamento para cada rato, enquanto isso soma dos correspondentes pontuações de preferência pré-teste dentro de cada grupo com as seguintes prioridades em mente: NOTA: Tenha cuidado para equilibrar contas entre grupos dentro de cada coorte, bem como através de qualquer coortes anteriores. <ol><li> Faça as somas de todos os grupos como equivalentes possível. </li><li> Adicione as somas mais próximo de zero quanto possível (isto é, escolher o lado preferido para alguns ratinhos e o lado não-preferida para os outros). Se um quase zero soma é impossível para qualquer grupo, re-ajustar todos os outros para igualar a melhor pontuação obtida para o grupo limitante, favorecendo grupo ligeiramente negativo resume maispositivo. </li><li> Tanto quanto possível, manter as atribuições de negro contra branco e preferenciais em relação câmaras não preferidos para emparelhamentos de drogas, mesmo dentro de cada grupo. </li><li> Como nem sempre é possível cumprir os objetivos acima, corrigir eventuais desvios, fazendo opostas considerações de equilíbrio em coortes posteriores; no entanto, tentar evitar a produção de coortes com descontroladamente diferentes preferências médias pré-teste. </li></ol></li><li> No condicionamento Dias 2-5, coloque portas inter-câmara na posição fechada (Figura 2C). </li><li> Preparar seringas individuais com cocaína (Dias 2 e 4) ou solução salina (dias 3 e 5) de solução, conforme descrito no passo 1.1.5 e com base nos pesos corporais medidos no pré-teste. NOTA: A dose deve ser escolhido com relação às expectativas experimentais, as considerações mencionadas na introdução, e os efeitos potenciais piso e teto. Muitas vezes, é melhor para conduzir experimentos independentes, utilizando pelo menos duas doses diferentes. </li><li> Load &quot;conditioning programa &quot;computador e entrar IDs de origem animal (Figura 1A), em seguida, emitir comando de arranque (Figura 1B), se aplicável. </li><li> Nuca e injectar cada ratinho (IP), reduzindo-os imediatamente para a câmara de preto ou branco apropriada de atribuído o seu aparelho de frente para a parede traseira, então suavemente fechar a tampa. Uma vez que todas as câmaras são carregados, deixar a sala de testes e minimizar o ruído. </li><li> Remover os ratinhos a partir da sua câmara para o mais próximo exactamente 30 min quanto possível (isto é, o primeiro ratos são removidos das suas câmaras, enquanto outros ainda são ratinhos condicionado). Retirar os animais o mais silenciosamente possível, sem introduzir ruído. </li></ol></li><li> Análise estatística: <ol><li> Escolha um método de análise. De qualquer tempo subtrair gasto no lado emparelhado com soro fisiológico durante o pós-teste do tempo gasto no lado emparelhado ao uso de cocaína durante o pós-teste (cocaína - salina, sec) ou usar o tempo gasto na câmara emparelhado com a droga pós-testemenos o tempo de pré-teste gasto na câmara emparelhado com a droga. NOTA: se estiver usando o primeiro método, também os gráficos de linhas lote de tempo médio gasto no meio, câmaras saline- e emparelhado com a droga durante o pré e pós-testes para cada grupo. Em comparação com o pré-teste, pós-teste deve mostrar o aumento do tempo no lado emparelhado com a droga e diminuição do tempo gasto no lado emparelhado com solução salina (ver Figura 6, inferior e de discussão para explicação). </li><li> Dependendo da natureza e o número de grupos a ser comparados, usar um t-teste, com uma ou ANOVA de duas vias, como apropriado, possivelmente com a análise post-hoc, para analisar qualquer das pontuações subtração acima apresentada. NOTA: pontuação de preferência de cocaína tendem a ser variável, e, além disso, pode ser negativo (ou seja, indicar aversão ao lado do emparelhado com a droga). Os ratos que mostram aversão não deve ser removido (a menos que estejam de outliers estatísticos), uma vez que este resultado é normal e provavelmente importante para determinar diferenças entre groups. Esperar a necessidade tamanhos de amostra de 12 a 30 animais por grupo, dependendo do tamanho do efeito do tratamento. </li></ol></li></ol> 2. Locomotor Sensibilização <ol><li> Equipamentos e Room Set-Up <ol><li> Obter um photobeam matriz 4 x 8 (X x Y) (dimensões externas 11.5 &quot;x 20&quot;). Construir uma câmara de topo aberto feito de plexiglas preto (dimensões internas 22 1/6 &quot;X 13 ¾&quot; x 9 3/8 &quot;) para alojar a matriz (Figura 4A). </li><li> Preparar a sala de teste a fim de que uma luz vermelha (ceiling- ou montado na parede) pode ser usado durante o teste. </li><li> Prepare sessões de programa separado para ensaios de habituação e injeção diárias. <ol><li> Jogo ensaios de habituação ser entre 30-60 min e ensaios de injecção para ser entre 60-120 minutos (Figura 5B). O comprimento recomendado para cada um é de 60 min. Mantenha comprimento julgamento consistente em vários grupos dentro da mesma experiência. </li><li> Definir ensaios para começar recording após a primeira pausa feixe que ocorre após o sinal de partida foi iniciado (Figura 5B). Para o ensaio da injeção, defina o sinal de partida para que as caixas podem ser iniciado individualmente (não em uníssono), se possível. </li><li> Definir quebras de feixe a ser registrado nas definidos pelo usuário &quot;caixas&quot;, de preferência, 5 min cada (Figura 5B). </li></ol></li><li> Prepare volume completo de solução de cocaína necessária para o experimento em questão. Dissolver o cloridrato de cocaína em 0,9% de NaCl (salina), baseando-se a concentração final num volume de injecção de 0,1 ml / 10 g de peso corporal (por exemplo, para uma dose de 5 mg / kg, a concentração da solução é de 0,5 mg / ml). mistura Vortex por 30-45 seg, filtro estéril (0,2 mm filtros de seringa) e armazenar a RT. </li></ol></li><li> ensaio NOTA: A fase inicial de testes é executado por 10-11 dias consecutivos. Ratos receber dois ensaios por dia: habituação (sem injecção) e injeção. Administrar solução salina durante os primeiros três a fnossos dias (ver discussão para importância de habituação solução salina), e cocaína para o próximo sete utilizando a mesma dose (por ex., 15 mg / kg / dia). <ol><li> Cada dia, aclimatar os ratos nas suas gaiolas para a antecâmara comportamental durante 30 min a 1 h. </li><li> Prepare limpas gaiolas de habitação de tamanho padrão do rato acrílico transparente com uma camada extremamente fina de roupas de cama (por exemplo, chips de pinheiros), de modo a não photobeams obscuras, se for o caso (Figura 4C &amp; D). </li><li> Coloque gaiolas contra o eixo Y da matriz photobeam perto de uma extremidade, de modo que cinco feixes são espaçados uniformemente ao longo do seu comprimento. Feixes de eixo-X não são usados ​​neste ensaio (Figura 4C e D). </li><li> Tome ratos de sua gaiola, no aleatório ordem, nuca e pesar. Remova cada rato do barco pesar pela base de sua cauda (com suporte) e coloque diretamente em sua gaiola locomotor atribuído. Cubra cada gaiola com uma tampa de filtro-top padrão. </li><li> Prepare seringas individuais wom solução salina ou solução de cocaína, tal como descrito no passo 2.1.7, com base nos pesos corporais do dia atual. Começar com uma dose de 15 ou 20 mg / kg, e considerar uma segunda experiência utilizando uma dose mais elevada ou mais baixa (ver a discussão para factores relevantes). </li><li> Uma vez que os ensaios de habituação ter terminado para todas as gaiolas, carregar o programa de injeção. </li><li> Um de cada vez, remover os ratos de sua gaiola teste, nuca e dar sua injeção (ip). Antes de devolver o mouse para sua gaiola teste, rapidamente iniciar o sinal de partida para essa gaiola (Figura 5C, em baixo). </li><li> Depois de todos os ensaios de injecção ter terminado, retorne ratos para suas gaiolas e sua sala de habitação. </li><li> Se desejado, permitir que os ratos a sofrer uma série de intervalos de segurança e os desafios de drogas, tais como as seguintes: a mesma dose, a metade da dose original, dose dupla, em seguida, solução salina, permitindo que sete dias antes do desafio mesma dose e 3-7 dias antes de cada desafio adicional. Seja qual for a escolha de desafios, manutenn períodos de abstinência semelhantes em coortes dentro de um experimento. NOTA: Se a dose inicial é elevada (por exemplo, 30 mg / kg ou acima), o dobro da dose deve ser ignorado ou substituído com uma dose mais baixa. O desafio salina revela qualquer activação locomotora condicionada pelo ambiente emparelhado-cocaína sozinho, e no processo, a quantidade de locomoção sensibilizada que é dependente de cocaína (ver discussão). </li></ol></li><li> Análise estatística <ol><li> Escolha da porção (s) de cada ensaio que vai ser utilizado para a análise. A maioria locomoção induzida por cocaína em roedores ocorre dentro da primeira injeção de drogas ~ 15-30 min depois. Dependendo de variáveis ​​envolvidas, considere a análise locomoção cumulativa para múltiplas janelas de tempo (por exemplo, os primeiros 15, 30, 60 e / ou 120 min) ou se concentrar em segmentos independentes do julgamento. </li><li> Usando o tempo de estrutura escolhida, resumir as quebras de feixe para cada animal por dia, durante os ensaios de habituação e de injecção separadamente e depois umverage os montantes para cada grupo. Plot médias e erros padrão da média (SEM) em um gráfico de linha sobre todos os dias. Como tratamentos podem alterar a forma como os ratinhos responderam à droga no início e / ou no final de cada estudo diário, também traçar médios quebras feixe grupo de 5-min escaninho ao longo de cada ensaio diária. NOTA: Traçando médias de atividade diária para ensaios de habituação e de injecção (por exemplo, em primeiro lugar 15 min) faz com que seja artificialmente parecer que a locomoção é atenuada pela injeção de solução salina, mas lembre-se que a atividade tem (mais provável) recusou-se a este nível até o final de habituação a cada dia . </li><li> Analisar salinas e tratamento da toxicodependência dias consecutivos separadamente usando medidas repetidas (RM) ANOVAs tendo o fator intra-sujeitos do dia / hora e incluindo todos os fatores entre-indivíduos no projeto, conforme o caso. Use um teste t ou One-Way ANOVA para investigar diferenças entre os grupos no dia 1 de cocaína (exposição aguda), e uma análise de variância multivariada para os desafios. Quando for o caso, siga significance com testes post-hoc ou univariada ANOVAs. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo demonstra métodos para a preferência local condicionado e sensibilização locomotora, cada um dos quais pode ser utilizado pelo laboratório de média para avaliar aspectos da plasticidade comportamental induzida por drogas. Tal como acontece com a maioria dos testes comportamentais, existem considerações dignos adicionais para além do protocolo básico. Em primeiro lugar, cada uma destas técnicas pode ser concebido como tendo duas fases, a indução e a expressão. &quot;Indução&quot; abrange o desenvolvimento ...

A pesquisa destinada a entender o vício em drogas usando modelos animais deve adotar uma variedade de abordagens para abordar cada um dos diversos componentes que obstruem o sucesso do tratamento, incluindo recompensa/reforço/motivação e abstinência e recaída, bem como a persistência geral que complica ainda mais essas questões no vício. Uma vez que se acredita que experiências gratificantes associadas ao uso de uma droga de abuso motivam o uso subsequente, estudos com foco em associações de contexto de drogas podem ser particularmente úteis para entender os mecanismos cerebrais que contribuem para o uso e a busca de drogas. Um desses ensaios, a preferência de lugar condicionada (CPP) é um método de alto rendimento para comparar as diferenças de grupo na sensibilidade à recompensa. A interpretação tradicional da tarefa envolve o condicionamento clássico, ou pavloviano, onde um estímulo condicionado (CS) é emparelhado com um estímulo incondicionado (UCS) e, após vários pareamentos, o CS provoca o mesmo comportamento que o UCS (no entanto, ver39,40). Teoricamente, os animais aprendem a associar um estado interoceptivo (recompensa ou aversão) a pistas contextuais. A intensidade relativa aversiva ou apetitiva do estado interoceptivo é então avaliada, determinando a preferência do animal pelas pistas contextuais. O uso do condicionamento de lugar para medir as associações droga-recompensa remonta a pelo menos 1957, a um estudo usando morfina em ratos em um labirinto em Y3,4. Nas últimas décadas, variações desse método têm sido amplamente utilizadas para estudar a preferência de lugar e a aversão em roedores a vários estímulos, e continua sendo particularmente útil no estudo de associações induzidas por drogas de abuso. Na pesquisa da dependência de drogas, o ensaio tem sido usado para avaliar as propriedades recompensadoras de várias drogas e a contribuição de diferentes sistemas cerebrais e proteínas para a recompensa da droga (para revisões, ver5-7,44). Embora existam métodos superiores de avaliação de fatores que contribuem para a dependência de drogas, ou seja, a autoadministração de drogas, o CPP é uma abordagem simples e muito mais acessível para medir a função de recompensa. 
A maioria dos protocolos atuais para preferência e aversão condicionada ao lugar (CPA) usa um aparelho que permite que os roedores tenham acesso a duas câmaras distintas, seja por meio de uma porta ou câmara de conexão menor. As distinções entre as duas câmaras são frequentemente baseadas, no mínimo, em pistas visuais e táteis, incluindo a cor da parede e a textura do piso, mas às vezes incluem outros elementos, como pistas olfativas. Projetos "tendenciosos" normalmente tentam reverter uma preferência inata pré-existente por uma câmara em detrimento da outra, como a que os roedores geralmente mostram para uma câmara preta em vez de branca. Projetos "imparciais" visam criar uma preferência por uma das duas câmaras que inicialmente eram igualmente atraentes, contrabalançando aleatoriamente a atribuição a qualquer uma das câmaras dentro de um grupo. Um design "equilibrado" é usado quando os animais mostram pequenas preferências, mas não favorecem, como grupo, a mesma câmara. Os objetivos deste último projeto são produzir 1) escores de preferência pré-teste para a (eventual) câmara pareada com cocaína que não sejam significativamente diferentes entre os grupos experimentais e 2) preferência insignificante pela câmara pareada com cocaína no pré-teste, positiva ou negativa8. O design balanceado é ideal para uso com as câmaras descritas, que utilizam vieses contraditórios para a cor da parede (preto sobre branco) e piso (arame sobre barra), resultando em uma distribuição aproximadamente igual de pequenas preferências para os lados preto e branco em diferentes animais. Os cálculos de balanceamento são descritos em mais detalhes abaixo.
Durante o condicionamento, os animais são expostos a uma droga e rapidamente colocados em um desses dois ambientes por um período de tempo limitado. A exposição é tipicamente por meio de injeção intraperitoneal (i.p.) ou às vezes subcutânea (s.c.), embora paradigmas para autoadministração intravenosa (i.v.)9 e infusões intracranianas38 em um aparelho de preferência de local também tenham sido desenvolvidos. Esses emparelhamentos são complementados por emparelhamentos não medicamentosos (veículo) da mesma duração realizados na câmara oposta, que podem ocorrer no mesmo dia que os pares de medicamentos ou em dias separados. Em geral, quando autorizados a explorar o aparelho após o condicionamento, os animais passarão mais tempo onde receberam uma droga gratificante (ou seja, uma que humanos e animais se auto-administrarão voluntariamente), enquanto evitarão um lugar onde receberam uma droga que induziu doença (por exemplo, cloreto de lítio). Vários estudos têm se dedicado a otimizar as condições de preferência por diferentes drogas de abuso (para revisão, ver7). As doses de cocaína (i.p.) para camundongos geralmente variam de 1 a 20 mg / kg, com doses inferiores a 5 mg / kg frequentemente usadas para analisar alta sensibilidade em um grupo. Dois ou mais pares de medicamentos são normalmente necessários para camundongos adultos10, e a duração desses pares é uma consideração importante. Doses muito baixas de cocaína requerem um condicionamento imediato e breve, provavelmente porque esse método captura o período mais gratificante da exposição. Períodos de condicionamento tardios ou muito longos podem resultar em nenhuma preferência, ou podem até induzir aversão11,12. Aqui é apresentado um método básico para obter preferência condicionada à cocaína em camundongos adultos.
Embora o ensaio CPP seja um método ideal para avaliar o aprendizado relacionado à recompensa e a memória de associações de contexto de drogas, a sensibilização comportamental é indiscutivelmente mais fácil de realizar e permite a avaliação das alterações que se desenvolvem ao longo do tratamento repetido. Também conhecido como tolerância reversa, os comportamentos submetidos à sensibilização são incrementalmente aprimorados ao longo de exposições repetidas a uma determinada droga de abuso, especialmente psicoestimulantes, e sabe-se que a sensibilização cruzada ocorre entre algumas, mas não todas, dessas drogas. Uma das primeiras avaliações da sensibilização locomotora induzida pela cocaína, em particular, em roedores foi publicada em 197613. Vários laboratórios mostraram que a locomoção sensibilizada é detectável muito tempo após a interrupção da droga, dependendo da duração original, localização e dose de exposição14-17, e o protocolo atual tem sido usado para detectar sensibilização por até 10 meses após sete dias (30 mg / kg) de tratamento com cocaína em camundongos18. O teste pode ser realizado usando tecnologias de feixe de fotos ou rastreamento de vídeo, em aparelhos de diferentes tamanhos e formas, facilitando a execução de muitos laboratórios. A natureza robusta, simplicidade e persistência da sensibilização locomotora tornam sua avaliação uma parte ideal do exame dos mecanismos básicos de mudanças duradouras no comportamento induzido por drogas. 
Como é expandido na discussão, uma consideração importante ao realizar o ensaio de sensibilização locomotora é se o medicamento é administrado em casa ou em gaiola de teste. Para aproveitar a sensibilização robusta que ocorre quando a administração do medicamento ocorre fora da gaiola doméstica, este protocolo emprega esse método. No entanto, observou-se que quando os animais não estão adequadamente habituados a um novo ambiente antes da exposição à droga, ocorre um efeito teto induzido pela novidade no Dia 1, o que pode mascarar parcial ou totalmente a natureza progressiva da sensibilização. É provável que isso represente efeitos sinérgicos de ativação locomotora da droga junto com a novidade e, embora os mecanismos subjacentes a esses efeitos possam ser interessantes, o método descrito é projetado para reduzir o papel da novidade e permitir que os efeitos da droga sejam medidos de forma mais independente. Embora se espere que este método seja útil na avaliação de outras drogas sensibilizadoras locomotoras, ele avaliou principalmente sua eficácia com cocaína em camundongos C57BL/6.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de Cocaína USP</td><td>Mallinckrodt Pharmaceuticals</td><td>0406-1520</td><td>A compra e o uso (substância controlada do Anexo II) para fins de pesquisa requerem conformidade e licenciamento de acordo com a lei estadual e federal.&nbsp;</td></tr><tr><td>Preferência de lugar condicionado,&nbsp; Aparelho de três compartimentos com portas manuais e luzes para Mouse</td><td>Med-Associates Inc.</td><td>MED-CPP-MS & MED-CPP-3013</td><td>Nosso laboratório usou essas caixas; no entanto, muitas caixas alternativas estão disponíveis e aceitáveis.</td></tr><tr><td>PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays</td><td>San Diego Instruments</td><td>2325-0223 e 7500-0221</td><td>Nosso laboratório abriga essas matrizes dentro de câmaras personalizadas, conforme descrito no texto. Existem alternativas disponíveis.</td></tr><tr><td>Toalhetes descartáveis Sani-Cloth PDI</td><td></td><td>13872</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da sensibilização comportamental induzida por cocaína e preferência por lugar condicionado em ratos

Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

Acredita-se que experiências gratificantes com drogas criam fortes associações contextuais e incentivam a ingestão repetida. Por sua vez, exposições repetidas a drogas de abuso causam alterações duradouras na função cerebral de indivíduos vulneráveis, e essas alterações persistentes provavelmente servem para manter os comportamentos desadaptativos de busca e aceitação de drogas característicos do vício/dependência2. Em roedores, a experiência de recompensa e as associações contextuais são frequentemente medidas usando o ensaio de preferência de lugar condicionado, ou CPP, em que a preferência por um contexto previamente pareado com drogas é medida. A sensibilização comportamental, por outro lado, é um aumento em um comportamento induzido por drogas que se desenvolve progressivamente ao longo de exposições repetidas. Como os comportamentos sensibilizados geralmente podem ser medidos após vários meses de abstinência da droga, dependendo da dose e da duração da exposição inicial, eles são considerados correlatos observáveis da plasticidade duradoura induzida pela droga. Os pesquisadores descobriram que esses ensaios são úteis para determinar os substratos neurobiológicos que mediam aspectos do vício, bem como avaliar o potencial de diferentes intervenções para interromper esses comportamentos. Este manuscrito descreve protocolos básicos e eficazes para CPP de camundongos e sensibilização comportamental locomotora à cocaína.

Os resultados representativos do ensaio de CPP são mostrados na Figura 6 do tipo selvagem utilizando ratinhos C57BL / 6N a cerca de nove semanas de idade. O desenho do estudo foi um factorial mista 2 x 3, com uma variável dentro-sujeitos de teste (pré e pós) e um entre-sujeitos variável de tratamento (solução salina e cocaína 5 e 10 mg / kg). A RM ANOVA mostrou uma interação significativa entre o teste eo tratamento (F 2,20 = 3,68, p &lt;0,05), o que foi interpretado no l...

Este protocolo destina-se a permitir que os pesquisadores conduzam experimentos projetados para testar esses aspectos do vício usando a preferência de lugar condicionada e ensaios de sensibilização comportamental locomotora.

Avaliação da sensibilização comportamental induzida por cocaína e preferência por lugar condicionado em Ratos

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

O objetivo geral dessas tarefas comportamentais é permitir aos pesquisadores avaliar comportamentos relacionados ao uso de drogas, como recompensa e sensibilização. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de dependência química, como quais moléculas ou vias contribuem para a plasticidade induzida por drogas. A principal vantagem dessas técnicas é que são de alto rendimento e podem ser realizadas com equipamentos caseiros ou comerciais. Quando realizamos ensaios de preferência condicionada ao local usando diferentes doses da droga, essa abordagem pode revelar diferenças decorrentes de alterações na sensibilidade à droga e fornecer maior confiabilidade aos seus resultados. Este experimento utiliza caixas de CPP com três compartimentos equipadas com feixes de luz fotoelétrica para coleta automatizada de dados. Tenha quatro ou mais disponíveis. Este aparato possui dois compartimentos grandes, A e B, nos quais os camundongos podem ser introduzidos por meio de uma tampa. Dentro de cada compartimento há uma fonte de luz com intensidade regulável. Os compartimentos A e B são visualmente distintos, por exemplo, branco versus preto, e também diferem tátilmente, como por texturas diferentes no piso. Entre os dois compartimentos grandes encontra-se um compartimento neutro menor e interligado, ou C, acessível por portas deslizantes. Para mais detalhes sobre as caixas de CPP, incluindo informações importantes sobre como montar um delineamento balanceado, consulte o protocolo textual. Para esses experimentos, utilize camundongos previamente submetidos a manuseio regular, a fim de minimizar o impacto da variabilidade no manejo dos animais sobre os resultados. Prepare o ambiente de teste e limpe cuidadosamente as caixas de CPP. Ligue o equipamento e reduza a intensidade da luz do ambiente. Em seguida, leve os camundongos para a área de teste de 60 a 90 minutos antes do ensaio. No primeiro dia de teste, realize um pré-teste. Prepare os compartimentos abrindo as portas entre eles. Em seguida, abra o programa no computador. Carregue o programa de teste. Nele, insira os códigos dos animais e emita o comando de início. Quando estiver pronto, coloque suavemente cada camundongo no compartimento central do aparelho designado. Após os pré-testes, devolva os camundongos às suas gaiolas de origem e exporte os dados. A partir dos resultados do pré-teste, determine a preferência de cada animal pelos compartimentos A e B. Subtraia o tempo gasto em cada compartimento do outro e use a diferença como um índice. Dê atenção especial aos animais com forte preferência no pré-teste, indicados aqui em vermelho, conforme descrito no protocolo textual. Selecione o compartimento pareado com a droga para cada camundongo com base nesse resultado. A soma dos escores de índice para cada grupo experimental deve ser equivalente e próxima de zero. Em outras palavras, escolha o lado preferido para cerca de metade dos camundongos. Além disso, distribua os animais de forma equilibrada entre os compartimentos A e B dentro de cada grupo. Se for desejável condicionar múltiplos grupos simultaneamente, tente atribuir animais que utilizam o mesmo aparelho a compartimentos opostos. Para mais detalhes, consulte o protocolo textual. Um passo crítico no ensaio de preferência condicionada ao local, ao usar um delineamento balanceado, é a atribuição dos compartimentos pareados com a droga, de modo que os escores do pré-teste sejam quase iguais para todos os grupos experimentais e o mais próximo possível de zero ou de ausência de preferência. Para iniciar, pese sempre cada camundongo antes da fase de condicionamento. No primeiro dia de condicionamento, prepare seringas com cocaína ou a droga escolhida de acordo com o peso corporal de cada animal. Em dias alternados, prepare seringas com solução salina ou outro veículo apropriado. Prepare as caixas fechando as portas entre os compartimentos. Carregue o programa de condicionamento no computador, insira os códigos dos animais e inicie o programa. Em seguida, injete os animais com a droga ou veículo em bólus e coloque-os na caixa designada. É essencial garantir que o condicionamento ocorra nos compartimentos A ou B corretos para cada camundongo, todos os dias, conforme designado, pois erros nesta etapa podem exigir a exclusão de animais do estudo. Após no máximo 30 minutos de condicionamento, devolva os camundongos às suas gaiolas de origem. Quando todos os ensaios estiverem concluídos, exporte os dados e devolva os camundongos ao biotério. Este ensaio utiliza matrizes de feixes fotoelétricos de quatro por oito, com dimensões de 20 polegadas por 11,5 polegadas. Tenha entre quatro e 16 disponíveis. Acomode cada matriz em uma câmara de Plexiglas preta com topo aberto. No ambiente de teste, tenha uma luz vermelha preparada para iluminar as câmaras. No software, prepare as sessões do programa para os testes diários de habituação e injeção. Primeiro, defina a duração do teste de habituação entre 30 e 60 minutos. Uma hora é um bom ponto de partida. Registre as interrupções dos feixes em intervalos de cinco minutos ou menores. Segundo, defina o início do tempo do ensaio em cada câmara quando o primeiro feixe fotoelétrico for interrompido, o que ocorre após o início do ensaio com um sinal de partida. Terceiro, defina a duração do ensaio de injeção entre 60 e 120 minutos. Sempre que possível, para os ensaios de injeção, opte por iniciar os sinais de partida individualmente nas matrizes de feixes fotoelétricos, e não em conjunto. A sensibilização locomotora exige uma sequência inicial de testes de 10 ou 11 dias consecutivos. Em cada dia, leve os camundongos para o antessala comportamental de 30 a 60 minutos antes do teste. Agora, coloque uma gaiola translúcida nova em cada câmara. Certifique-se de que os feixes fotoelétricos estejam centralizados no eixo longitudinal de cada gaiola. Quando estiver pronto, retire os camundongos em ordem aleatória de suas gaiolas de origem. Primeiro, segure-os pelo pescoço e pese-os. Em seguida, coloque cada um na gaiola designada para o teste de locomoção para o ensaio de habituação e cubra com uma tampa. Cada dia envolve um ensaio de habituação sem injeção, seguido por um ensaio com injeção. Durante o ensaio de habituação, prepare as seringas com base no peso corporal atual de cada camundongo. Após o término de todos os ensaios de habituação, carregue o programa do ensaio de injeção e entre silenciosamente na sala de teste. Após injetar um camundongo, emita rapidamente o sinal de início da gaiola no software e, em seguida, devolva o animal à sua gaiola de teste. Nos primeiros três a quatro dias de teste, administre solução salina ou outro veículo apropriado. Nos sete dias seguintes, administre cocaína ou a droga escolhida. Após o término de todos os ensaios com injeção, devolva os camundongos à sala de alojamento. No ensaio de CPP, camundongos selvagens da linhagem C57 black 6n foram condicionados apenas com solução salina ou com duas concentrações diferentes de cocaína. O grupo que recebeu apenas solução salina não apresentou alteração na preferência após o condicionamento, como esperado, enquanto preferências aumentadas foram observadas nos grupos tratados com cocaína. O tempo gasto em diferentes compartimentos antes e após o teste demonstrou que os camundongos tratados com cocaína passaram mais tempo no compartimento pareado com a cocaína do que em qualquer outro compartimento. Os camundongos que receberam apenas solução salina não mostraram diferenças marcantes na preferência pelos compartimentos, como esperado. Em seguida, o ensaio de locomoção foi realizado em camundongos C57 black 6n. Injeções de solução salina foram aplicadas por três a quatro dias, seguidas por injeções de cocaína em quatro doses diferentes durante sete dias. Como esperado, alterações mais acentuadas no comportamento foram observadas com o aumento das doses de cocaína. Como desafio, após uma a duas semanas de abstinência, cada grupo recebeu a dose original de cocaína. Desafios adicionais foram então realizados com períodos variáveis de abstinência e doses. Embora este vídeo tenha demonstrado essas técnicas utilizando equipamentos comerciais, muitos laboratórios as realizam com sucesso usando dispositivos construídos internamente. Ao tentar esses procedimentos, é importante garantir que todos os animais recebam tratamento igual para reduzir estresse, erros e variabilidade entre experimentos. Variáveis a considerar incluem o tempo de manuseio e o tempo gasto na sala e no compartimento de teste. Extensões desses ensaios, incluindo extinção e reinstauração para o CPP e desafios de sensibilização a longo prazo ou cruzada para a sensibilização locomotora, podem ser desejáveis. Além disso, é importante utilizar animais não expostos previamente a drogas

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Operante de drogas auto-administração e preferência local condicionado (CPP) procedimentos são utilizados em pesquisas expansiva para modelo de vários componentes de reforço de drogas, consumo e dependência em humanos. Neste relatório, nós combinamos os métodos tradicionais de CPP e auto-administração como uma nova abordagem para estudar o reforço de drogas e vício em ratos.

Aparelho novo e Método para Reforço de Drogas

Neste protocolo, descrevemos um método de aprendizagem operante utilizando estímulos sensoriais como reforço no mouse. Não requer treinamento prévio ou restrição alimentar, e permite o estudo do comportamento motivado, sem o uso de um reforçador farmacológicos ou naturais, tais como alimentos.

Sensation operante que procura no mouse

A auto-administração intravenosa paradigma (IVSA) é considerado como sendo o padrão de ouro para examinar as propriedades de reforço de drogas de abuso em roedores. Este manuscrito descreve os procedimentos experimentais e técnicas cirúrgicas necessárias para a obtenção de dados confiáveis ​​IVSA. Em particular, a implantação do cateter meticulosa e manutenção são realçados.

Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

Este artigo descreve como microinject vetores virais em cérebro de camundongos e teste em um paradigma de preferência local condicionado, que inclui uma fase de aquisição, extinção e reintegração.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Este manuscrito descreve um protocolo que aplica perfis abrangentes para análise de programas transcricionais induzidos em núcleos cerebrais específicos de roedores seguindo paradigmas comportamentais. Aqui, essa abordagem é ilustrada no contexto do perfil de genes induzidos no núcleo accumbens (NAc) de camundongos após exposição aguda à cocaína, utilizando matrizes de qPCR microfluídicas.

Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

Reatividade de sinalização é conceituada como sensibilidade para pistas ligadas com experiências de drogas que contribuem a ânsia e recaída em humanos abstinentes. Reatividade de sinalização é modelada em ratos por medição orientação atenção para pistas de drogas associadas que resulta em comportamento de abordagem repetido em um teste de reactividade deixa seguir auto-administração e forçado a abstinência.

Um protocolo para medição de reatividade de Cue em um modelo do rato do transtorno de uso de cocaína

Este protocolo descreve a preferência de lugar condicionado (CPP) como um modelo de recaída. Este procedimento permite a medição de recaída em animais de laboratório, considerando o impacto das drogas associadas Dicas ambientais como desejo e recaída em viciados em ausência é, atualmente, o foco dos programas de tratamento do abuso de drogas.

Reintegração de busca de drogas em ratos utilizando o paradigma de preferência lugar condicionado

Aqui, um protocolo de preferência (CPP) do lugar de morfina condicionado é descrito para medir a incubação do desejo em ratos.

Um protocolo de preferência condicionada lugar para medir a incubação do desejo em ratos

Demonstramos a utilidade do comportamento de construção de ninhos em ratos de laboratório como um indicador de bem-estar. A pontuação do ninho é uma técnica sensível que é alterada pela temperatura, doença e agressão. O tempo para integrar no teste de ninho (TINT) é uma avaliação simples do lado da gaiola que pode detectar a dor pós-operatória.

Construção de ninhos como indicador de saúde e bem-estar em ratos de laboratório

Controlo do motor e desempenho da balança são conhecidos por se deteriorar com a idade. Este artigo apresenta uma série de testes comportamentais não invasivos padrão com a adição de um estímulo rotativo simples de desafiar o sistema e mostrar vestibulares mudanças no desempenho do equilíbrio em um modelo murino de envelhecimento.

Avaliação Comportamental do Envelhecimento Rato Sistema Vestibular

Aprenda a avaliar sensibilização comportamental e preferência condicionada por lugar em ratos usando ensaios de CPP e atividade locomotora. Este método permite estudar mecanismos de recompensa e plasticidade induzida por drogas.

Avaliação da sensibilização comportamental induzida por cocaína e preferência por lugar condicionado em Ratos

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