Name: Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprenda a técnica de crioseccionamento para microdissecação da mucosa colônica murina. Este método rápido e de alto rendimento permite isolar células epiteliais da base das criptas e da superfície para análise de expressão gênica e proteica por PCR em tempo real e Western blot.

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Apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (DK55679 e DK59888 para A.N.). Núcleo de Microscopia de Imagem Celular Integrada da Emory University do Winship Cancer Institute abrangente bolsa do centro de câncer, P30CA138292, e o prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Crohn's and Colitis Foundation of America para CTC e Prêmio Fellowship para AEF

Experiências utilizados ratinhos C57BL / 6 entre 10 e 12 semanas de idade. Todos os procedimentos que utilizam animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Emory University Animal Care Institucional e Use e foram realizadas de acordo com Institutos Nacionais de Saúde critérios. 1. Setup Experimental <ol><li> Configurar o Criostato <ol><li> Equilibrar criostato a -20 ° C, incluindo a lâmina micrótomo e mandris (ter muito cuidado em torno da lâmina!). </li><li> Encha uma cryomold vazio com outubro (Optimal composto de corte de temperatura) e equilibrar a -20 ° C (~ 30 min). Remova a outubro congelado do molde e corrigi-lo no mandril com líquido outubro Coloque o bloco / mandril no braço micrótomo e permitir que o OCT para definir durante 10 min. </li><li> Defina o criostato a 10 um por seção e raspar o bloco de outubro até que seja plana. Apoiar o braço microtome longe da lâmina por vários centímetros. Neste ponto não se ajustar a lâmina ou mandril para o restante da experiment. </li></ol></li><li> Preparar as lâminas de barbear: Prepare duas lâminas de barbear por amostra. Usando um arquivo de metal, maçante a borda sharped de lâminas. Em seguida, retire a flange de alumínio com uma pinça. </li><li> Pré-descontrair um pirex ou outra superfície plana em gelo seco. </li><li> Prepare um prato de dissecação com 15/10 pinos de dissecação. De 10 cm cultura de tecidos de 50% cheio com silicone será suficiente. Adicionar 5 ml de tampão de Hanks à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Dissecção da Distal Colonic Tissue <ol><li> Camundongos lugar em uma câmara selada e euthanize ratos por inalação de isoflurano e deslocamento cervical, em seguida, pulverizar etanol a 70% para o abdômen e tórax 12. </li><li> Faça uma pequena incisão na pele do abdómen com uma tesoura e, em seguida, fazer uma incisão para expor a cavidade peritoneal. Procedimentos semelhantes podem ser encontradas aqui descrita 12. </li><li> Cortar o intestino grosso à beira anal e provocar uma separação do mesentério até que o cólon é gratuito. </li><li> Extirpar um cólon distalsegmento entre 0 e 6 cm do ânus. Aqui, a profundidade das criptas é ~ 150 uM (ver Figura 1B). Corte aberto do cólon longitudinalmente com uma tesoura e remova o conteúdo fecal. </li><li> Pin o tecido para o prato de dissecação com a superfície da mucosa voltada para cima. Esticar o tecido utilizando pinos de dissecação sobre um prato de silício em tampão de Hanks e deixar em repouso durante 10 min à temperatura ambiente (Figura 1C). Isto remove dobras do tecido e permite que as camadas de músculos para relaxar. </li></ol> 3. Monte Tissue na Criostato para Seccionamento <ol><li> Deslize uma lâmina de barbear sob a seção desejada do tecido e, em seguida, despeje o tampão Hanks. Adicionar outra lâmina de barbear para o topo, tornando uma sanduíche. Corte o segmento de tecidos e remover os pinos. Transferir o sanduíche de lâminas de barbear / tecido para gelo seco. Permitir que o tecido para congelar (5-10 min, A Figura 1D). </li><li> Pegar a navalha / sanduíche de tecido e deixe-o aquecer ligeiramente, colocando um dedo no topo blade (lado da mucosa para cima. Este orienta o tecido de modo que as camadas basais musculares são seccionados em primeiro lugar.). Separa-se a sanduíche de corte e em volta das extremidades do segmento de tecido. Cortar um segmento de tecido de aproximadamente, 0,5 centímetros x 1 cm. Áreas de ponta têm uma tendência a enrolar, fazendo com que os cortes seriados para conter muitas camadas de tecido. Note-se que o excesso de corte é melhor do que under-corte, assim errar do lado da cautela. </li><li> Permitir que o tecido se aquecer até que o gelo no topo do tecido começa a derreter. Neste ponto, de forma rápida e cuidadosamente pressionar o tecido para dentro do bloco de outubro no criostato. </li><li> Remova a lâmina, colocando um dedo sobre a amostra. A transferência de calor vai permitir que você remover a lâmina, sem perturbar o tecido. </li><li> Brasão do tecido com outubro e equilibrar durante 5 min. Cortar em secções de 10 um (Figura 1E, F). Inspecione visualmente as seções até que as criptas são vistos. Seções lugar em um tubos de 1,5 ml ou em slides. </li><li> Para a análise de mRNA ou proteína, lugar tele amostras em tubos com 5 cripta-base, 5 de transição, e 5 secções de superfície por tubo. Para recolha de RNA adicionar 1 ml de reagente de isolamento comercial e incubar à TA durante 10 min. Realizar a purificação de ARN de acordo com as instruções do fabricante. Use 5-10 ug de ARN total para a produção de ADNc. </li><li> Para a purificação de proteínas, adicionar 0,5 ml de tampão de lise RIPA frio (mais inibidores de protease) por cinco secções. Sonicar três vezes a um ciclo de 70%, em gelo. <ol><li> Adicionar tampão de amostras de SDS PAGE de carregamento (tampão de Laemmli) e incuba-se a 100 ° C durante 10 min. Amostras sujeitas a SDS PAGE e transferência, em seguida, bloquear em 5% de leite / PBS durante 2 horas. Realizar a análise Western blot, seguido por incubação com anticorpos Klf4 (1: 500) O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Os mecanismos moleculares envolvidos na proliferação de células epiteliais do cólon e diferenciação são mal compreendidos. Isto inclui lacunas na nossa compreensão do ambiente de sinalização celular do compartimento de células estaminais na base das criptas epiteliais do cólon. Há também um crescente interesse nos processos que subjazem diferenciação enterócitos. Por exemplo, o aumento da compreensão dos in vivo diferenciação é necessária como um ponto de referência para estudos voltados para a produção in vitro de sistemas intestinais primárias 16. O procedimento acima contém várias etapas que requerem atenção extra. Em primeiro lugar, a remoção das bordas ao redor do segmento de tecidos congelados (como discutido na seção 3.2) é necessária como as bordas do tecido onda durante a dissecção e congelamento. A falha para mover estes bordos resultados é uma população mista de células de superfície e de base cripta. Montando o tecido em um bloco de pré-refrigerados, nivelado outubro também é essencial. To protocolo pode ser adaptado para outras áreas do cólon distai através da alteração do número de secções, em cada pool. Por exemplo, como mostrado na Figura 1B, comprimento das criptas mucosa varia entre 150-300 um. Portanto, quando se estuda a região entre 4 cm-a 6 cm do ânus, o número de secções deve ser aumentado de 15 para 30. Importante, este procedimento não é recomendado para o cólon proximal (7 cm @ 9 cm), devido a dobras ( plicas obliquae) que se estendem para dentro do lúmen fazendo com que seja impossível para as células cripta e de superfície de base separados por cortes seriados. Técnicas de seccionamento em série têm sido usados ​​para estudar cripta-base e superfície de populações de células epiteliais em humanos. No entanto, o nosso protocolo adiciona passos adicionais que são necessários devido ao tamanho pequeno de tecido murino. Propomos que o protocolo acima permitirá a investigação de cripta-base e população de células epiteliais da superfície em sistemas geneticamente tratáveis ​​do mouse. Na verdade, seções reunidas yield proteína de alta qualidade e análise do RNA a jusante adequados. As aplicações futuras podem incluir o estudo de vias de sinalização celular ou cromatina imunoprecipitação. No entanto, deve notar-se que, tal como muitos dos métodos alternativos descritos acima, as secções resultantes contêm uma mistura de células epiteliais e da lâmina própria intersticiais. Em conclusão, o protocolo aqui descrito proporciona um método rápido de rendimento, elevada para a análise de processos moleculares em regiões espacialmente distintas da mucosa do cólon de murino.

O revestimento epitelial do cólon é um tecido altamente regenerativa, com as células estaminais residentes reabastecer o tecido a cada poucos dias 1. Este processo de regeneração requer a manutenção de um compartimento de células estaminais proliferativa. Ao longo do tempo, as células filhas recentemente produzidos perdem o seu potencial proliferativo e migram para a superfície luminal do intestino. Coincidente com a migração, as células progenitoras diferenciam-se em enterócitos de formação de barreira maduras ou células caliciformes produtoras de muco. A falha deste programa de diferenciação é pensado para contribuir para barreira epitelial comprometida tal como é observada na doença inflamatória do intestino e o cancro do cólon 2,3. Estudo detalhado dos processos acima exigirá metodologias para isolar populações cripta-base e celulares de superfície. Existem vários métodos, cada um com suas vantagens e desvantagens. Os métodos actuais para o isolamento de células epiteliais intestinais incluem chagentes elating e dissociação mecânica, resultando no isolamento de criptas epiteliais, folhas inteiras, ou de células individuais, dependentes das condições experimentais 4,5. Estes são os métodos de alto rendimento, ainda mudanças na sinalização intercelular foram relatados nestas condições que podem não representar o ambiente nativo 6,7. Captura Laser microdissection permite a coleta de material distinto espacial, mas alcança 8,9 baixo rendimento molecular. No tecido do cólon humano, métodos cryosectioning horizontais em série foram desenvolvidos 10. No entanto, os tecidos da mucosa murino são proibitivamente pequeno para apropriação direta desta técnica. Nos seres humanos, os comprimentos das criptas intestinais (a distantes entre a base de cripta e células superficiais) no cólon varia entre 100-1.000 uM ~ 11. Em ratinhos, os comprimentos das criptas são entre 50-300 ~ ^ M (ver Figura 1A). O tamanho pequeno das criptas murino apresenta um desafio para o isolação destas duas populações celulares utilizando protocolos existentes. Vamos agora descrever um baixo custo, o método de alto rendimento para o isolamento de cripta-base e superfície população de células epiteliais no tecido do cólon de murino. Tecido colhida desta maneira pode, então, ser analisado por um certo número de aplicações a jusante padrão, incluindo coloração por imunofluorescência, por RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) ou transferência de western.

<table><tbody><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Alemanha</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ detector de PCR em tempo real</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>Microscópio confocal</td> <td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>criomolde</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Lâmina de micrótomo de alto perfil</td><td>Leica Biosystems, Nussloch alemanha</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas industriais GEM Lâminas</td> de <td>barbear de segurança americanas</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Base de elastômero de silício Sylgard</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 27 1/2 g</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>pinos para dissecção</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo KLF4</td><td>Sinalização Celular</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário Alexa conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-coelho</td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário HRP conjugado</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>coelho/camundongo&nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs tampão de sal balanceado</td><td>Life Technologies 14025092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tampão</td><td></td><td></td> de lise RIPA <td>50mM Tris-HCl pH 7,4 150mM NaCl 1% NP40 0,25% Na-desoxicolato</td></tr><tr><td>primer TBP 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>primer TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>primer KLF4 3'</td><td></td><td></td> primeira demão KLF4 5 de <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>TGTGACTATGCAGGCTGTGTGCCÇCTGT</td></tr> de TGTGACTATGCAGGCTGT</tbody></table>

método cryosectioning para microdissection de murino colonic mucosa

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

O tecido da mucosa colônica fornece uma barreira vital aos antígenos luminais. Essa barreira é composta por uma monocamada de células epiteliais colunares simples. O epitélio colônico é dinamicamente virado e as células epiteliais são geradas na célula-tronco contendo criptas de Lieberkühn. As células progenitoras produzidas nas bases das criptas migram em direção à superfície luminal, passando por um processo de diferenciação celular antes de serem liberadas no lúmen intestinal. Para estudar esses processos em nível molecular, desenvolvemos um método simples para a microdissecção de duas regiões espacialmente distintas da mucosa colônica; a zona de cripta proliferativa e as células epiteliais superficiais diferenciadas. Nosso objetivo é isolar populações específicas de células epiteliais de cripta e superfície da mucosa colônica de camundongos para o isolamento de RNA e proteína.

Seções de tecido do cólon foram processados ​​para avaliação histológica e H &amp; E coloração 13. Uma vista em secção transversal tradicional da mucosa é visto na Figura 2A. Áreas basais conter o muscular externa, composta principalmente dos muscularis circulares. Prosseguindo para o lúmen, a mucosa muscularis é evidente adjacente para as células epiteliais de cripta-base, as células são transitórias no meio do tecido, e finalmente, as populações de células de superfície da face do lúmen do intestino. O método descrito aqui cortes seriados mantém uma orientação tal que os muscularis longitudinais e circulares são encontrados primeira (Figura 2B), seguido pela mucosa muscular (Figura 2C). Observe a aparência das células intersticiais não-musculares no canto superior esquerdo da imagem. Para a análise a jusante descrito abaixo, as secções de músculo são descartados. As seções posteriores contêm células epiteliais e tecido intersticial (lâmina própria), Começando com as células de cripta-base (Figura 2D). Note-se a ausência de um lúmen central, na maioria das criptas, que aparecem mais escuras devido aos núcleos estreitamente empacotadas. Estas camadas contêm o compartimento proliferativa. As células de transição aparecem como bem embalado glândulas com lumens centrais proeminentes (Figura 2E). Por último, as populações de células da superfície tem uma estrutura irregular, com áreas de monocamada epitelial viram en face (Figura 2F). Cortes seriados como descritos acima podem também ser tratados para a rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal (como descrito aqui 14). Figura 2G mostra criptas isoladas fixas e permeabilizadas em 100% de metanol e, posteriormente coradas para núcleos (azul) e da proteína de junção célula-célula zonula occludens 1 (ZO-1, verde). Na orientação de corte tradicional, células da cripta e da superfície pode ser visto simultaneamente (Figura 2G </strong&gt;). Note-se que as linhas de junção mancha ZO-1 do lúmen da cripta do cólon. Esse revestimento Z0-1 do lúmen também pode ser visto em amostras seccionadas em série de populações de células de transição, no centro das glândulas circulares (Figura 2G). Aprimorado ZO-1 mancha é visto em populações de células de superfície (Figura 2I e J). Vários factores de diferenciação são conhecidos a ser expresso de uma forma espaço-temporal ao longo do eixo cripta-a-superfície. Isto inclui o factor de transcrição-Kruppel como factor de 4 (KLF4), que é conhecido por ser enriquecido em populações de células de superfície. Usando métodos tradicionais de seccionamento, KLF4 é encontrada nos núcleos de lúmen populações de células de superfície (Figura 2K) enfrentando. Nós portanto especulado que KLF4 ARNm poderia ser predominantemente expresso em populações de células de superfície. Para testar isso, cortes seriados foram coletadas e agrupadas em amostras de superfície, de transição, de criptas e-base. Subsequently, o ARN foi colhido utilizando Trizol extracção padrão, com uma purificação adicional por coluna RNeasy e tratamento com DNAse. RNA foi coletado de cinco secções consecutivas em pool, que renderam entre 5-10 mg de RNA total por amostra. Estas amostras foram então submetidas a tempo de semi-quantitativo PCR real tanto para KLF4 e um gene de referência, a ligação da proteína caixa TATÁ 1 (TBP-1) (Figura 2L) 14. Como mostrado na Figura 2L, após normalização para a TBP-1, células de superfície foram encontrados para expressar até 8 vezes o ARNm KLF4 que é expresso em células da cripta. Do mesmo modo, os níveis de proteína KLF4 foram encontrados para expor regulação espacial ao longo do eixo cripta-superfície. As secções em série foram recolhidas como descrito acima e, em seguida, incubadas em tampão de lise durante 20 min a 4 ° C. Isto produziu entre 200-250 mg de proteína por amostra. As amostras foram então sujeitas a análise por SDS-PAGE (Figura 2M) 15. Como mostrado na Figura 2 M, p KLF4níveis rotein são dramaticamente mais elevada em populações de células de superfície. Os resultados acima demonstram a capacidade deste protocolo para isolar grandes quantidades de células epiteliais superficiais e das criptas da mucosa do cólon murino. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mostrando esquemática da mucosa do cólon de murino e as camadas musculares externos. Nosso método tem como objectivo recolher populações de células discretas de células superficiais e cripta-base por cryosectioning serial (10 m cada). As camadas musculares externos são descartados. Altura (B) Crypt varia ao longo do comprimento do cólon (a distância entre as camadas de base e de cripta-superficiais). Os pontos de dados individuais indicam as medições das criptas e símbolos indicam réplicas biológicas (n = 4). (C) segmentos de cólon recolhido, dividido, e preso em um silício dissecar prato. (D) Um tecido segment aproximadamente 3 cm do ânus é prensada entre a lâminas de barbear e os congelados em gelo seco. (E) O tecido é, em seguida, montado sobre um pré-nivelado bloco PTU. (F) Cortes congelados são removidos e inspeccionados visualmente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figura 2:. Os dados representativos (A) de tecido do cólon corado com Hematoxilina-Eosina, em corte transversal, que mostra a muscular circular (em cm), a mucosa muscularis (mm), as células de cripta-base, células de transição, e de células de superfície. (B - C) camadas musculares do cólon. (D) As células da cripta de base. Note-se a ausência de um lúmen central. (E) células transitórias. (F), as células de superfície. (G) Imunofluorescência coloração das criptas colônicas isoladas. ZO-1 (verde) e núcleos (azul) são observadas em corte transversal. (HI) ZO-1 e coloração nuclear em células de transição e de superfície. (J) visão ampliada de ZO-1 coloração. (K) KLF4 (verde) está enriquecido nas populações de células de superfície. (G) em tempo real os níveis de avaliação de PCR de ARNm KLF4 entre os três compartimentos. (M) análise de Western blot de KLF4 níveis de proteína nestas populações de células.

Aqui descrevemos um método simples para o isolamento de células epiteliais epiteliais do cólon murino espacialmente distintas das células subjacentes à base da cripta.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

O objetivo geral deste procedimento é microdissecar duas regiões espacialmente distintas do cólon: a zona criptal proliferativa K e as células epiteliais superficiais diferenciadas. Isso é realizado primeiramente removendo o cólon do camundongo. O segundo passo consiste em congelar o tecido entre duas placas metálicas.Em seguida, o tecido é montado em um bloco de OCT previamente nivelado. O passo final é seccionar o tecido em um criostato com intervalos de 10 mícrons. Por fim, a PCR em tempo real ou o Western blot são utilizados para demonstrar alterações na expressão gênica e proteica.A vantagem da nossa técnica é que ela é rápida, econômica e demonstra alto rendimento. Nosso procedimento é Christian Garner Schmidt, um técnico do nosso grupo. Todos os procedimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Emory e foram realizados de acordo com os critérios dos Institutos Nacionais de Saúde.Após preparar o criostato, como de costume, equilibre as lâminas e os mandris do criostato a menos 20 graus Celsius. Em seguida, preencha um molde criogênico vazio com composto de temperatura de corte ideal e equilibre a menos 20 graus Celsius. Isso levará aproximadamente 30 minutos.Retire a OCT congelada do molde e fixe-a ao porta-objeto com OCT líquida. Coloque o porta-objeto no braço do micrótomo e deixe a OCT endurecer por 10 minutos. Ajuste o criostato para 10 mícrons por corte e desbaste o bloco de OCT até que fique plano, afastando o braço do micrótomo da lâmina em vários centímetros.Em seguida, prepare duas lâminas de barbear por amostra usando um lima de metal, deixando a borda afiada das lâminas romba. Em seguida, remova a flange de alumínio com pinça. Prepare uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros, preenchida pela metade com silicone e com 10 a 15 pinos de dissecação.Adicione cinco mililitros de solução tampão de Hank’s à temperatura ambiente à placa após eutanasiar o camundongo de acordo com métodos aprovados e excisar um segmento distal do cólon entre zero e seis centímetros do ânus. Use tesoura para cortar. Abra o cólon longitudinalmente e remova o conteúdo fecal.Fixe o tecido à placa de dissecação de silicone contendo tampão de Hank com a superfície mucosa voltada para cima. Estique o tecido utilizando os alfinetes de dissecação. Em seguida, deixe repousar por 10 minutos à temperatura ambiente para remover as dobras do tecido e permitir o relaxamento das camadas musculares.Após o tecido ter repousado, remova todos os pinos exceto os das extremidades. Deslize uma lâmina de barbear sob a seção desejada do tecido e, em seguida, descarte o tampão de Hanks. Adicione outra lâmina na parte superior, formando um sanduíche.Corte o segmento de tecido e remova os pinos das extremidades. Transfira o sanduíche de lâmina de barbear e tecido para gelo seco. Deixe o tecido congelar por cinco a dez minutos.Pegue o sanduíche de tecido com a lâmina e deixe esquentar levemente colocando um dedo sobre a lâmina superior. Separe o sanduíche e corte ao redor das bordas do segmento de tecido. Corte um segmento de tecido com aproximadamente 0,5 centímetros por um centímetro.Deixe o tecido aquecer até que o gelo sobre o tecido comece a derreter. Nesse momento, pressione rapidamente e com cuidado o tecido no bloco de OCT. No criostato, coloque um dedo sobre a amostra.A transferência de calor permitirá que você remova a lâmina sem danificar o tecido. Revesta o tecido com OCT e deixe equilibrar por cinco minutos. Em seguida, corte seções de 10 micrômetros.Coloque as seções em uma lâmina e inspecione visualmente até que as criptas sejam vistas. Posicione as seções em tubos de 1,5 mililitro ou sobre lâminas. Esta imagem mostra tecido colônico corado com hematoxilina e eosina em corte transversal tradicional, com a camada muscular circular rotulada como cm.A muscularis mucosa, identificada como MM, marca as células da base das criptas, células transicionais e células da superfície, que são claramente visíveis. Esta imagem mostra a muscularis circular após corte seriado. À medida que avançamos em direção às células da superfície, observa-se a muscularis mucosa.Esta imagem mostra células da base da cripta coradas com h e D em maior aumento. Observe a ausência de uma luz central. Aqui, são visíveis células de transição e esta imagem mostra as células da superfície.As imagens a seguir mostram a coloração por imunofluorescência de criptas colônicas isoladas, evidenciando a proteína de junção entre célula e célula. A ocludina ou a ZO-1 aparece em verde, e os núcleos, que aparecem em azul, são observados em corte transversal. As células transicionais e de superfície são mostradas aqui após seccionamento seriado.Vários fatores de diferenciação são expressos de maneira espaciotemporal ao longo do eixo da superfície criptal. Isso inclui o fator de transcrição cripple like factor four mostrado em verde, que é enriquecido nas populações de células da superfície quando visualizado em corte transversal. O seccionamento serial permite a avaliação por PCR em tempo real dos níveis de mRNA de KLF4 entre os três compartimentos. Finalmente, este ensaio de western blot demonstra os níveis da proteína KLF4 nessas populações celulares.Não se esqueça de que trabalhar com lâminas de microtômero pode ser extremamente perigoso, portanto tenha cuidado redobrado sempre que realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para isolar criptas inteiras do intestino delgado de um camundongo. As criptas inteiras isoladas podem ser usadas para propagar organoides 3D de longa duração e auto-renovação in vitro.

Isolamento de criptas intestinais: um método para isolar criptas inteiras do intestino delgado do modelo murino

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

O uso de um dispositivo simples para cortar e 'rolar' intestinos de camundongos para preparar rapidamente preparações de montaria inteiras é descrito.

Um dispositivo simples de preparar rapidamente inteiras Mounts do mouse Intestino

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Células enterocromafins (CE) compõem um pequeno subconjunto de células epiteliais gastrointestinais. Células de CE são eletricamente excitáveis e liberam serotonina, ainda dificuldades no cultivo e identificação de células CE limitados estudos fisiológicos. O método apresentado aqui estabelece um modelo de cultura primária favorável ao exame de células únicas CE por eletrofisiologia.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Falta de padronização para processamento do tecido murino reduz a qualidade da análise histopatológica murino em comparação com espécimes humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o exame histopatológico dos tecidos do cólon inflamados e uninflamed murino para mostrar a viabilidade de sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas.

Usando sistemas robóticos para processar e incorporar Colônica murino amostras para análise histológica

O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.

Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Aprenda a técnica de crioseccionamento para microdissecação da mucosa colônica murina. Este método rápido e de alto rendimento permite isolar células epiteliais da base das criptas e da superfície para análise de expressão gênica e proteica por PCR em tempo real e Western blot.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

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