Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

O objetivo geral deste procedimento é microdissecar duas regiões espacialmente distintas do cólon, a zona proliferativa da cripta K e as células epiteliais superficiais diferenciadas. Isso é feito removendo primeiro os dois pontos do mouse. O segundo passo é congelar o tecido entre duas placas de metal.

Em seguida, o tecido é montado em um bloco OCT pré-nivelado. A etapa final é seccionar o tecido em um criostato em intervalos de 10 mícrons. Em última análise, PCR em tempo real ou Western blot é usado para mostrar mudanças na expressão gênica e proteica.

A vantagem de nossa técnica é que ela é rápida, barata e de alto rendimento. Nosso procedimento é Christian Garner Schmidt, um técnico do nosso grupo. Todos os procedimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory e foram realizados de acordo com os critérios do National Institutes of Health.

Depois de configurar o criostato, como de costume, equilibre as lâminas e mandris do criostato a menos 20 graus Celsius. Em seguida, preencha um molde criogênico vazio com composto de temperatura de corte ideal e equilibre a menos 20 graus Celsius. Isso levará aproximadamente 30 minutos.

Remova o OCT congelado do molde e fixe-o no mandril com OCT líquido. Coloque o mandril no braço do micrótomo e deixe o OCT endurecer por 10 minutos. Defina o criostato para 10 mícrons por seção e raspe o bloco OCT até que ele fique com o braço do micrótomo afastado da lâmina por vários centímetros.

Em seguida, prepare duas lâminas de barbear por amostra usando uma lima de metal, embote a borda afiada das lâminas. Em seguida, remova o flange de alumínio com uma pinça. Prepare uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros, 50% preenchida com silicone e com 10 a 15 pinos de dissecação.

Adicione cinco mililitros de temperatura ambiente, tampão de meada ao prato depois de sacrificar o camundongo de acordo com os métodos aprovados e extirpar um segmento distal do cólon entre zero e seis centímetros do ânus. Use uma tesoura para cortar. Abra o cólon longitudinalmente e remova o conteúdo fecal.

Prenda o tecido na placa de dissecção de silicone contendo o tampão de Hank com a superfície da mucosa voltada para cima. Estique o tecido usando os pinos de dissecação. Em seguida, deixe descansar por 10 minutos em temperatura ambiente para remover as dobras do tecido e permitir que as camadas musculares relaxem.

Atua após o descanso do tecido, remova todos, exceto os pinos finais. Deslize uma lâmina de barbear sob a seção desejada do tecido e, em seguida, despeje o tampão de meada. Adicione outra lâmina de barbear por cima fazendo um sanduíche.

Corte o segmento de tecido e remova os pinos da extremidade. Transfira o sanduíche de tecido de lâmina de barbear para gelo seco. Deixe o tecido congelar por cinco a 10 minutos.

Pegue o sanduíche de tecido de barbear e deixe-o aquecer um pouco, colocando um dedo na lâmina superior. Separe o sanduíche e corte ao redor das bordas do segmento de tecido. Corte de um segmento de tecido de aproximadamente 0,5 centímetros por um centímetro.

Deixe o tecido aquecer até que o gelo em cima do tecido comece a derreter. Neste ponto, pressione rápida e cuidadosamente o tecido no bloco OCT. No criostato, coloque um dedo sobre a amostra.

A transferência de calor permitirá que você remova a lâmina sem romper o tecido. Cubra o tecido com OCT e deixe-o equilibrar por cinco minutos. Em seguida, corte as seções a 10 mícrons.

Coloque as seções em um slide e inspecione visualmente as seções até que as criptas sejam vistas. Coloque as seções em tubos de 1,5 mililitro ou em lâminas. Esta imagem mostra o tecido colônico corado com hematina eoin em corte transversal tradicional com a muscular circular marcada cm.

A mucosa muscular marcada como MM, as células da base da cripta, as células transicionais e as células da superfície são claramente vistas. Esta imagem mostra a muscular circular após o corte seriado. À medida que avançamos em direção às células superficiais, a mucosa muscular é vista.

Esta imagem mostra as células da base da cripta coradas com h e D em maior ampliação. Observe a ausência de um lúmen central. Aqui, as células de transição são vistas e esta imagem mostra as células da superfície.

As imagens a seguir mostram coloração imunofluorescente de criptas colônicas isoladas para a proteína de junção célula a célula. Soula occludin one ou ZO one aparece verde e núcleos, que aparecem em azul são observados em seção transversal. As células de transição e de superfície são mostradas aqui após o corte serial.

Vários fatores de diferenciação são expressos de forma espaço-temporal ao longo do eixo da superfície do cryp. Isso inclui o fator de transcrição aleijado como o fator quatro mostrado em verde, que é enriquecido em populações de células de superfície quando visto em seção transversal O seccionamento serial permite a avaliação de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de KLF quatro entre os três compartimentos. Finalmente, este western blot demonstra os níveis de proteína KLA quatro nessas populações de células.

Não se esqueça de que trabalhar com lâminas de microtom pode ser extremamente perigoso, portanto, tenha muito cuidado sempre que estiver realizando este procedimento.