Name: Análises de Yersinia enterocolitica Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a medir a translocação de efetores em células HeLa usando fusões beta-lactamase e microscopia confocal. Este método oferece uma ferramenta sensível para estudar mecanismos de virulência em Yersinia.

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Agradecemos ao Dr. Antonio Virgilio Failla por fornecer o algoritmo de quantificação de aquisição FRET e a Erwin Bohn por fornecer as construções pMK-bla e pMK-ovas.

1. pico de emissão e Cross-talk Determinação (ver figura 2) <ol><li> A fim de determinar os picos de emissão e quantidade de diafonia entre o doador (derivado cumarina V450) e do aceitador (fluoresceína) corantes, efectuar análises espectrais de ambas as células marcadas com fluoróforos individuais a 405 nm de excitação. </li><li> Determinar uma largura de banda de 10 nm no pico de cada corante que vai ser utilizado para os dadores e aceitadores (aqui canais a 455-465 nm e 525-535 nm). Traçar a intensidade normalizada ao longo do comprimento de onda e calcular a percentagem média de cross-talk do corante doador no canal receptor e vice-versa (Figura 2). </li></ol> 2. Preparação de Y. enterocolitica Cepas para celular Cultura Infecção <ol><li> Use as seguintes estirpes: WA-314 PMK-óvulos (WA-314 transformada com os plasmídeos PMK-bla 17 e PMK-óvulos 17, respectivamente) e WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE transformada com o plasmídeo PMK-bla 17) </li><li> Pelo menos dois dias antes da raia infecção Y. enterocolitica cepas WA-314 PMK-óvulos, WA-314 PMK-bla e WA-314ΔE PMK-blá de crio stocks em placas de LB-agar contendo os antibióticos necessários (canamicina para WA-314 PMK-bla e WA-314 PMK-óvulos ; canamicina e tetraciclina para WA-314ΔE PMK-bla) e crescer O / N a 27 ° C. Depois manter as placas durante até uma semana a 4 ° C. </li><li> Um dia antes da infecção inocular 3 mL de meio LB contendo os antibióticos necessários com uma colónia das respectivas estirpes e incubar O / N a 27 ° C num agitador a 180 rpm. </li><li> No dia da infecção inocular 2 ml da cultura D / N em 40 ml de meio fresco LB sem antibióticos e incubar durante 90 min a 37 ° C num agitador a 180 rpm, para induzir a expressão do sistema de secreção de tipo III. </li><li> Transferir as culturas para um tubo apropriado e manter as culturas em gelo ou a 4 ° Cdaqui em diante. Centrifugar as culturas durante 10 min a 5000 xg e 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento bacteriano em 2-3 ml de PBS gelado. Dilui-se a suspensão bacteriana a uma concentração de 8 x 10 8 ufc / mL, utilizando um espectrofotómetro. Determinar a densidade óptica correspondente individualmente. Mantenha esta suspensão em gelo até infectar as células HeLa. </li></ol> 3. As células HeLa Galvanização <ol><li> Um dia antes da semente de infecção de 1,5 x 10 4 células HeLa em DMEM de 200 ul contendo 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) em poços de uma placa de 96 poços em cultivar e um 5% de CO2 a 37 ° C. Semente três poços para cada cepa (três tempos de incubação diferentes). </li></ol> 4. A infecção de células HeLa e carregando com CCF4 <ol><li> Infectar as células HeLa pela adição de 3,5 ul da suspensão bacteriana para a forma e misturar por pipetagem suave do meio duas vezes. Permitir que as bactérias para sedimentar emàs células a um MOI (porção de infecção) de cerca de 100 bactérias por célula. Para iniciar um curso de tempo de infecções a -90 min, -60 min e -30 min e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 até 0 min para atingir um ponto final comum. </li><li> Quando a incubação estiver completa, cuidadosamente aspirar o meio, sem a remoção de células HeLa e adicionar 50 ul de PBS contendo 20 ug / ml de cloranfenicol para parar a expressão de efectores e probenecid 2,5 mM para reduzir a exportação de CCF4. </li><li> Neste ponto transferir a placa de 96 poços na platina do microscópio e definem pontos adequados para análise posterior em cada poço. Terminar esta etapa dentro de 10 minutos (para obter detalhes sobre a aquisição ver secção 5.1). </li><li> Por cavidade, adicionar 70 ul de solução CCF4 / AM de carga (solução 0,24 ul A, 1,2 ul de solução B, de 18,56 ul da solução C (solução A, B e C, desde que dentro do kit / AM carregamento CCF4) e 50 ul de PBS (contendo 20 ug / ml de cloranfenicol e probenecida 2,5 mM), utilizando um multi pipette e incubar durante 5 min à TA. A partir de agora trabalhar sem interrupções. </li><li> Aspirar a solução de carregamento e adicionar 100 ul de PBS contendo 20 ug / ml de cloranfenicol e probenecida 2,5 mM usando um multi pipeta. Em seguida, transferir rapidamente a placa de 96 bem no palco microscópio e começar a aquisição no prazo de 10 min da aspiração da solução de carregamento. </li></ol> 5. Laser Scanning Microscopy e Análise de Dados <ol><li> A aquisição de imagens <ol><li> Defina as condições de imagem de forma a maximizar a contagem total de fótons e minimizar fototoxicidade, fotodegradação e cross-excitação. <ol><li> Em um moderno microscópio confocal de varrimento laser, use uma alta objetiva de imersão abertura numérica 20X, abra o pinhole detector de 2,5 unidades Airy (ou seja, ampla seccionamento óptico), escolha de alta sensibilidade GaAsP-detectores com doador e receptor canais ativos simultaneamente, profundidade de 8 bits , ~ 750 nm tamanho do pixel, 3 vezes quadro de média e excite com 10% de um laser de diodo 405 nm. </li><li> Para garantir a correta quantificação definir o ganho do detector de ambos os canais com o mesmo valor e para evitar quaisquer pixels saturadas. Nota: Aqui, os ganhos foram ajustados para 150%. </li></ol></li><li> Assegurar a sua imersão contínua por meio de imersão para espalhar o fundo dos poços, por exemplo com uma seringa de 1 ml, e evitar o aprisionamento de bolhas de ar. </li><li> Ative a luz transmitida e encontrar um campo representante de vista em todos os poços. Use uma fase automática corretamente calibrados e marcar a posição no software. </li><li> Após a remoção da placa por coloração (ver secção 4.3), reinserir a placa e adicionar um peso no topo para evitar deriva focal. Reveja as posições salvas com o modo de varredura a laser e ajustar o foco ea posição lateral corretamente. </li><li> Defina o lapso de tempo de 2 minutos, a duração de 2 horas e começar a aquisição. </li></ol></li><li> Quantificação imagem (exemplos será dado para Bitplane Softwsão como Imaris) <ol><li> Importe o conjunto de dados em software que permite cálculos aritméticos de matrizes de pixel. Faça isso arrastando e soltando o arquivo de origem que contém tanto o doador eo receptor de canal no ícone do software. </li><li> Subtrair o fundo em ambos os canais usando o mesmo deslocamento. Para fazer isso, clique em Menu e, em seguida, clique em Imagem&gt; Processamento&gt; Linha de Base subtração. Selecione cada canal e insira o valor da linha de base. </li><li> Corrija o sangramento-through do canal doador (CH1) para o canal receptor (CH2) com o pré-determinada correção do fator f (ver 1.1), a criação de um novo canal: Ch2 &#39;= Ch2 - Ch1 * f NOTA: Uma sangria através do aceitador para o canal de dador não era detectável em relação ao nível de ruído. <ol><li> Clique em Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Canal Arithmetics e entrar abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Depois excluir Canal 2, clicando em Menu&gt; Editar&gt; Excluir Channels. Certifique-se de que osangrar-through canal receptor corrigido permanece como o novo Canal 2. Opcional: Mude a cor do canal de cinza para a cor original, vá ao menu Editar&gt; Propriedades&gt; Imagem. Selecione Channel 4&gt; mapeada Cor&gt; Cor Base e alterá-lo para, por exemplo, verde. </li></ol></li><li> Criar um novo canal com a seguinte operação para determinar o coeficiente de FRET relação: = CH2 CH3 &#39;/ (CH1 + Ch2&#39;) <ol><li> Vá ao Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Canal Arithmetics e entrar ch2 ./ (CH1 + CH2) </li></ol></li><li> Para visualização adequada do canal FRET em uma imagem de 8 bits, criar um quarto canal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Vá ao Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Canal Arithmetics e digite 255 * ch3. Mude a cor do canal, vá ao menu Editar&gt; Propriedades&gt; Imagem. Selecione Channel 4&gt; mapeada tabela de arquivos Color&gt; Color&gt; Jet. </li></ol></li><li> Aplicar um filtro mediano 3x3 para canais Ch3 Ch4 e that vai reduzir o ruído nas imagens. Para fazer isso, clique em Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Suavização&gt; filtro mediano. Selecione ambos os canais e aplicar um filtro de tamanho &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Para a quantificação de sinais celulares, detectar as células em Ch4 por corretamente configurar o deslocamento e filtrar as estruturas por tamanho para excluir demasiado pequenas estruturas. <ol><li> Selecione o Ultrapasse Exibir e clique no ícone &quot;Adicionar novas superfícies&quot;. Defina os parâmetros do algoritmo de detecção na janela de Superfície. Para um processamento mais rápido, ativar a duas caixas de verificação &quot;Segmento de apenas uma região de interesse&quot; e &quot;todo o processo de Imagem finalmente&quot;. Definir a região de interesse, editando suas dimensões. </li><li> Selecione Channel 4 como o canal de origem e definir o limite por Thresholding&gt; A subtração (Contraste Local) e definir diâmetro de 10 mm. Defina o limite de intensidade mínima manualmente para 0 eo limite máximo para a intensificação máximaty. Filtrar as estruturas por área e definir o valor mínimo para, por exemplo, 187 μm². Termine a detecção de superfície. </li></ol></li><li> Extraia os valores médios de intensidade de fluorescência do doador (CH1) e coeficiente de FRET relativa (CH3) e seus desvios-padrão na entidade celular. Para fazer isso, vá para as propriedades de superfície. Alterar a aparência das estruturas selecionando Surfaces Estilo / Qualidade&gt; Surface. Selecione todas as estruturas, clicando na guia filtros. Unificar as estruturas detectadas indo ao processo de seleção&gt; Unify. Exportar as estatísticas de superfície para o MS Excel, clicando na aba estatísticas&gt; Exportar todas as Estatísticas para arquivo. </li><li> Traçar esses valores ao longo do tempo. Identificar o intervalo de 10 min de inclinação máxima de aumento de fluorescência de canal doador para cada condição como um parâmetro razoável para representar a quantidade de effector translocado. Calcular o declive como m = Δ intensidade de fluorescência de dador / Δ tempo (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós, aqui aplicada com êxito um ensaio baseado TEM-1 repórter de beta-lactamase para a análise quantitativa de efector translocation por Y. enterocolitica. Muitas variações diferentes da técnica sensível, específico e relativamente simples têm sido descritos na literatura. Neste estudo de microscopia de varrimento a laser foi realizada para detecção mais sensível e precisa dos sinais de fluorescência. Especificamente, a correcção em função da conversa cruzada entre os corantes dadores e aceitadores e a...

III sistemas de secreção do tipo são máquinas de proteínas para a exportação especializada utilizados por diferentes gêneros de bactérias gram-negativas para entregar diretamente proteínas efetoras bacterially codificados em células alvo eucarióticas. Embora a própria maquinaria de secreção é altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras têm evoluído entre as diferentes espécies de bactérias para manipular vias de sinalização celular e facilitar estratégias bacterianos de virulência específicos 1. Em caso de Yersinia, até sete proteínas efectoras, os chamados (proteínas exteriores Yersinia) Yops, são translocados aquando do contacto da célula hospedeira e agir em conjunto para subverter as respostas das células imunes, tais como fagocitose e produção de citocina, ou seja, para permitir a sobrevivência extracelular das bactérias 2-4. O processo de translocação é rigidamente controlado em diferentes fases 5. Está provado que a ativação primária do T3SS é desencadeada por seu contato com a ce-alvoll 6. No entanto, o mecanismo preciso desta iniciação está ainda a ser elucidados. Em Yersinia um segundo nível de chamada afinação de translocação é conseguido por cima ou para baixo-regulação da actividade das proteínas Rac1 ou RhoA-GTP Rho de ligação celular. Ativação de Rac1 por exemplo, invasina ou citotóxico fator necrosante Y (CNF-Y) leva ao aumento da translocação 7-9, enquanto o GAP (GTPase proteína ativadora) função de translocado YopE down-regula a actividade Rac1 e, consequentemente, diminui a translocação por um tipo de feedback negativo mecanismo de 10,11. Os métodos válidos e precisos são o pré-requisito para investigar como a translocação é regulada durante a interação célula hospedeira Yersinia. Muitos sistemas diferentes têm sido utilizados para esse fim, cada um deles com vantagens e desvantagens específicas. Algumas abordagens assentam sobre a lise de células infectadas mas não as bactérias por diferentes detergentes, seguido por análise Western blot. ºe inconveniente comum destes métodos é que a lise bacteriana pequena mas inevitável potencialmente contamina o lisado celular com proteínas efectoras bactérias associadas. No entanto, foram propostas tratamento de células com proteinase K para degradar proteínas efectoras extracelulares e uso subsequente de digitonina para a lise selectiva das células eucarióticas para minimizar este problema 12. Mais importante, estes ensaios depender crucialmente anticorpos anti-efectoras de alta qualidade, que não são na sua maioria disponíveis comercialmente. As tentativas de utilizar fusões traducionais das proteínas efectoras e proteínas fluorescentes como GFP para monitorar a translocação não foram bem sucedidas provavelmente devido à estrutura terciária das proteínas globulares fluorescentes e a incapacidade do aparelho de secreção para desdobrá-las antes de secreção de 13. No entanto, várias marcas diferentes, como o repórter cya (dependente de calmodulina adenilato ciclase) domínio da toxina pertussis Bordetella cyclolysin 14 ou o Flashtag foram usadas com sucesso para analisar a translocação. No primeiro ensaio, a actividade enzimática de CyA é utilizado para amplificar o sinal da proteína de fusão intracelular, enquanto que a etiqueta do Flash, uma marcação motivo muito curto tetracisteï¿½a (4Cys), permite a marcação com o Flash corante biarsenical sem perturbar o processo de secreção 15. A abordagem aqui aplicado foi relatado pela primeira vez por Charpentier et al., E baseia-se na conversão intracelular da transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) por corante CCF4 translocados efectora TEM-1 beta-lactamase fusões 16 (Figura 1A). CCF4 / AM é um composto de células-permeante em que um derivado da cumarina (doador) e uma porção de fluoresceina (aceitador) estão ligadas por um núcleo de cefalosporina. Após a entrada na célula passiva eucariótica, o não-fluorescente esterificado CCF4 / AM composto é processado por esterases celulares para o CCF4 carregada e fluorescente e assim presono interior da célula. Excitação da porção cumarina a 405 nm resulta em FRET para a porção f luoresceina, que emite um sinal de fluorescência verde a 530 nm. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina pelo FRET da beta-lactamase é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul at460 nm. Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, a técnica foi utilizada em um modelo de rato de infecção para identificar as populações de leucócitos identificados para a translocação in vivo 17-19. A leitura dos sinais pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. De nota, o método também fornece a possibilidade de monitorar a translocação em tempo real por meio de microscopia de células ao vivo durante o processo de infecção 20,21. Aqui microscopia de fluorescência de varredura a laser foi aplicado para readout de sinais de fluorescência, pois proporciona maior sensibilidade e precisão. Em particular, a capacidade para ajustar a janela de emissão, com uma precisão nanométrica em combinação com detectores de alta sensibilidade facilita a detecção de fluorescência optimizado e minimizada a diafonia. Além disso, esta configuração microscopia pode ser adaptada para a monitorização em tempo real de translocação e, potencialmente, permite a análise simultânea de interacção hospedeiro-patogénio a nível celular. Neste estudo as taxas de translocação de um Y. enterocolitica estirpe do tipo selvagem e um mutante de deleção YopE exibindo um fenótipo hypertranslocator 10,11, foram exemplarmente analisados.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Médio</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' s Fosfato Tamponado Salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços (preto, fundo transparente)</td> <td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco / Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B / G Kit de Carregamento com CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lectina de Triticum vulgaris (trigo) Conjugado FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Usado para emissão de pico e determinação de diafonia</td></tr><tr><td>V450 Rato anti-rato CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Usado para emissão de pico e determinação de diafonia</td></tr><tr><td>Óleo de imersão Immersol W</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Índice de refração = 1,3339 @ 23 &deg; </td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser C TCS SP5 II</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x detectores GaAsP-Hybrid, espectrômetro de 4 canais, divisor de feixe óptico acusto, platina XY motorizada, orifício ajustável, objetiva 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&#160; laser de diodo nm 50&#160; Software mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Plugins incluídos ImarisXT e MeasurementPro</td></tr><tr><td>MatLab tempo de execução do compilador</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Software</td><td></td><td></td> GraphPad</tr></tbody></table>

análises de<em&gt; yersinia enterocolitica</em&gt; effector translocação em células hospedeiras usando beta-lactamase effector fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Muitas bactérias gram-negativo patogénico incluindo Yersinia spp. Empregam sistemas de secreção de tipo III para translocar proteínas efectoras para células alvo eucarióticas. Dentro da célula hospedeira as proteínas efectoras manipular funções celulares para o benefício de as bactérias. Para entender melhor o controle da secreção de tipo III durante a interação célula hospedeira, sensível e ensaios precisos para medir a translocação são obrigatórios. Nós aqui descrever a aplicação de um ensaio com base na fusão de um fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína exterior Yersinia; YopE). Com TEM-1 beta-lactamase para a análise quantitativa de translocação O ensaio baseia-se na clivagem de uma célula permeante FRET corante (CCF4 / AM) por translocado fusão beta-lactamase. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina de CCF4 pela beta-lactamase, a partir de cumarina FRET para f luoresceina é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul.Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, num modelo de ratinho. A detecção dos sinais de fluorescência pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. Na configuração descrita aqui, a translocação de fusões efectoras in vitro em células HeLa por diferentes mutantes Yersinia é monitorizada por microscopia de varrimento de laser. Gravação de conversão intracelular do repórter de FRET pela fusão efectora da beta-lactamase em tempo real fornece resultados quantitativos fiáveis. Nós aqui mostram dados exemplificativos, demonstrando o aumento da translocação de um Y. enterocolitica YopE mutante em comparação com a linhagem selvagem.

Para demonstrar a capacidade do método descrito para analisar quantitativamente efectora translocação para células alvo, duas estirpes de Yersinia com diferentes cinéticas de translocação foram estudados: Y. enterocolitica estirpe selvagem WA-314 (sorogrupo O8, o plasmídeo de virulência pYVO8 22) e seu derivado WA-314ΔYopE (WA-314 abrigar pYVO8ΔYopE 23). Trabalhos anteriores mostraram que Y. mutantes enterocolitica falta funcional exposição YopE significativament...

A translocação efetora para as células hospedeiras por meio de um sistema de secreção tipo III é uma estratégia de virulência comum entre bactérias gram-negativas. Um ensaio baseado em fusão efetora beta-lactamase para análise quantitativa da translocação foi aplicado. Em células infectadas por Yersinia, a conversão de um repórter FRET pela beta-lactamase é monitorada usando microscopia de varredura a laser.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a translocação de proteínas efetoras para dentro das células hospedeiras por meio do sistema de secreção tipo três vernia. Isso é conseguido incubando-se células HeLa com mutantes de Yersinia que expressam fusões da efetora TEM-1 com beta-lactamase, permitindo a translocação das fusões efetoras para dentro das células HeLa. Como segundo passo, as células HeLa infectadas são carregadas com um composto repórter FRET permeável à membrana celular, que é processado pelas esterases celulares em CCF4 carregado e fluorescente, sendo assim retido no interior da célula.A próxima clivagem do CCF quatro pela beta-lactamase localizada em trans resulta na interrupção do fre, o que é registrado por microscopia de varredura a laser para analisar as intensidades de fluorescência do doador e do aceptor. Os resultados mostram quantidades diferentes do efetor localizado em trans, fusão TEM um com beta-lactamase, com base em diferentes cinéticas de aumento da fluorescência do doador. Uma das principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes é que o processamento intercelular do composto CCF quatro fornece uma ferramenta altamente específica e sensível para medir a translocação.O método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da patogênese bacteriana, como a forma como a translocação é ajustada com precisão durante a interação entre bactérias e células hospedeiras. Um dia antes da infecção, inocular três frascos separados contendo três mililitros de meio LB e os antibióticos necessários com uma colônia de cada uma das cepas transformadas de Y enterocolitica preparadas conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Também preparar placas contendo células heela um dia antes da infecção, semear 15.000 células em 200 microlitros de meio de cultura em nove poços de uma placa de 96 poços e incubá-las em um incubador com 5% de CO2 a 37 graus Celsius no dia da infecção.Inocule dois mililitros da cultura de crescimento noturno em 40 mililitros de meio LB fresco sem antibióticos. Incube as bactérias por 90 minutos a 37 graus Celsius em agitador a 180 rpm. Isso induzirá a expressão do sistema de secreção tipo três após 90 minutos; transfira as culturas para um tubo novo e mantenha as culturas em gelo.A partir deste ponto, centrifugue as culturas por 10 minutos a 5.000 G e quatro graus Celsius para obter o pellet bacteriano. Em seguida, re-suspenda o pellet em dois a três mililitros de PBS gelado, dilua a suspensão bacteriana para uma concentração de 800 milhões de unidades formadoras de colônia por mililitro e, então, coloque as culturas no gelo.Em seguida, determine a densidade óptica correspondente de cada cultura. Adicione 3,5 microlitros da suspensão bacteriana de cada cepa a poços diferentes da placa 96 preparada, e homogeneíze pipetando suavemente o meio duas vezes. Deixe as bactérias sedimentarem sobre as células em uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 100 bactérias por célula.Realize um curso temporal iniciando infecções em intervalos de 30 minutos e mantendo as células em uma câmara com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius. Após cada infecção, 90 minutos após a primeira infecção, aspire cuidadosamente o meio sem remover nenhuma das células HeLa. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS contendo 20 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 2,5 milimolar de pronic.Isso interromperá a expressão de efetores e reduzirá a exportação de CCF quatro. Para preparar a microscopia, garanta uma imersão contínua espalhando o meio de imersão até o fundo dos poços, utilizando uma seringa de um mililitro. Evite aprisionar bolhas de ar no meio de imersão.Em seguida, transfira a placa de 96 poços para a platina do microscópio e localize pontos adequados para análises posteriores em cada poço. Finalize este passo dentro de 10 minutos. Em seguida, adicione 70 microlitros da solução de carregamento CF 4:00 AM em cada poço.Incube bem a placa por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução de carregamento e adicione 100 microlitros de PBS contendo 20 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 2,5 milimolares de pronic. Então, inicie rapidamente a microscopia.Posicione um objetivo de imersão com alta abertura numérica e ampliação de 20 vezes e abra o diafragma do detector para 2,5 unidades de Airy; em seguida, transfira a placa de 96 poços para o estágio do microscópio confocal a varredura a laser. Em seguida, selecione detectores de fosfato de gálio arsênio de alta sensibilidade com canais doador e aceptor ativos simultaneamente. Utilize média tripla de quadros com profundidade de 8 bits e excite com 10% de um laser de diodo de 405 nanômetros.Para garantir uma quantificação correta, ajuste o ganho do detector em ambos os canais para o mesmo valor e evite quaisquer pixels saturados. Em seguida, ative a luz transmitida e verifique novamente os campos de visão representativos em cada poço, ajuste e salve novamente as posições conforme necessário, utilizando uma platina automática calibrada. Por fim, configure o intervalo de tempo para dois minutos, a duração para duas horas e inicie a aquisição de imagens.Após a aquisição da imagem, importe o conjunto de dados para um software que permita cálculos aritméticos de matrizes de pixels. Subtraia o fundo em ambos os canais utilizando o mesmo deslocamento, primeiro clicando no menu, depois indo ao processamento de imagem e selecionando a subtração da linha de base. Em seguida, selecione cada canal e insira o valor da linha de base.Corrija a passagem do canal do doador, canal um, para o canal do aceptor, canal dois, utilizando o fator de correção predeterminado, criando um novo canal, canal dois linha, para esse fim. Clique no menu e, em seguida, selecione processamento de imagem, seguido por aritmética de canais, e insira o valor absoluto do canal dois subtraído por 0,33 vezes o canal um. Posteriormente, exclua o canal dois e certifique-se de que o canal do aceptor corrigido quanto à passagem permaneça como o novo canal dois.Em seguida, crie um novo canal com a operação mostrada aqui para determinar o coeficiente de fret relativo. Depois, volte ao menu de aritmética de canais e insira o canal dois dividido pelo canal um mais o canal dois para uma correta visualização do canal de fret. Em uma imagem de oito bits, crie um quarto canal, o canal quatro, que é igual a 255 vezes o canal três.Altere a cor do canal acessando o menu de propriedades da imagem, selecione o canal quatro, depois cor mapeada, seguido por arquivo de tabela de cores e selecione jet. Em seguida, aplique um filtro mediano de três por três aos canais três e quatro. Isso reduzirá o ruído nas imagens entrando no menu de processamento de imagem e selecionando suavização.Após o filtro mediano, selecione ambos os canais e aplique um tamanho de filtro três por três por um para a quantificação dos sinais celulares. Detecte as células no canal quatro selecionando a visualização surpass e clicando no ícone. Adicionar novas superfícies.Defina os parâmetros do algoritmo de detecção na janela de superfície e ative as duas caixas de seleção. Segmentar apenas uma região de interesse e processar a imagem inteira. Por fim, defina a região de interesse editando suas dimensões.Selecione o canal quatro como canal de origem e defina o limiar acessando o menu de limiarização e selecionando a subtração de fundo. Defina o diâmetro como 10 micrômetros, o limiar mínimo de intensidade manualmente como zero e o limiar máximo como intensidade máxima. Filtre as estruturas por área e defina o valor mínimo como 187 micrômetros quadrados.Em seguida, finalize a detecção da superfície. Por fim, extraia os valores médios da intensidade de fluorescência do doador no canal um e do coeficiente de fret relativo no canal três, juntamente com seus desvios-padrão na entidade celular. Para demonstrar a capacidade deste método em analisar quantitativamente a translocação de efetores para dentro de células-alvo, duas linhagens de yersinia com diferentes cinéticas de translocação foram estudadas utilizando tanto a fluorescência do doador quanto os coeficientes de fret relativos.As células infectadas com o tipo selvagem mostram um aumento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Como esperado, a inclinação máxima da intensidade de fluorescência é positivamente correlacionada com a duração da infecção, indicando que diferentes concentrações de beta-lactamase traduzida podem ser distinguidas, de acordo com estudos anteriores. Células infectadas com o mutante de deleção YOPE da yersínia exibem um aumento mais rápido da intensidade de fluorescência em comparação com a linhagem tipo selvagem.Curiosamente, expandir a infecção para 90 minutos não acelerou ainda mais o aumento da fluorescência do doador em comparação com 60 minutos de infecção. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que o processamento do composto CCR quatro começa imediatamente após sua adição. Portanto, é essencial iniciar a aquisição de imagens no momento certo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Este artigo ilustra o uso de marcação de rádio de perseguição de pulso em combinação com fotocrosslinking específico do local para monitorar as interações entre uma proteína de interesse e outros fatores em E. coli. Ao contrário dos métodos tradicionais de reticulação química, essa abordagem gera "instantâneos" de alta resolução de uma via de montagem ordenada em uma célula viva.

Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Investigar as interações entre patógenos bacterianos e seus hospedeiros é uma importante área de pesquisa biológica. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para medir efetoras translocação por Coxiella burnetii durante o silenciamento do gene siRNA usando substrato BlaM.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Este artigo fornece um protocolo simples e claro para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio de expansão do código genético (GCE) e obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)...

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Aprenda a medir a translocação de efetores em células HeLa usando fusões beta-lactamase e microscopia confocal. Este método oferece uma ferramenta sensível para estudar mecanismos de virulência em Yersinia.

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