Análises de Yersinia enterocolitica Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a translocação da proteína efetora em células hospedeiras por meio do sistema de secreção tipo três de vérnia. Isso é obtido incubando células heela com mutantes de yersinia expressando fusões efetoras TEM uma beta lactamase para permitir a translocação de fusões efetoras para as células HELOC. Como segundo passo, as células HELOC infectadas são carregadas com um composto repórter de traste permean celular, que é processado pelo estro celular para o CCF quatro carregado na fluorescência e, portanto, preso dentro da célula.

A próxima clivagem do CCF quatro pela beta-lactamase translocalizada resulta na interrupção da frequência, que é registrada por microscopia de varredura a laser para analisar as intensidades de fluorescência do doador e do aceitador. Os resultados mostram diferentes quantidades de TEM efetor translocado uma fusão beta lactamase com base em diferentes cinéticas de aumento da fluorescência do doador. Uma das principais vantagens dessa técnica sobre os métodos existentes é que o processamento intercelular do composto CCF quatro fornece uma ferramenta altamente específica e sensível para medir a translocação.

O método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese bacteriana, como a forma como a translocação é ajustada durante a interação de bactérias e células hospedeiras Um dia antes da infecção. Inocular três frascos separados contendo três mililitros de meio LB e os antibióticos necessários com uma colônia de cada uma das cepas transformadas de Y enterocolitica preparadas conforme descrito no protocolo de texto anexo. Prepare também placas contendo células heela no dia anterior à infecção, semeando 15.000 células em 200 microlitros de meio de cultura em nove poços de uma placa de 96 poços, incube as células em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 graus Celsius no dia da infecção.

Inocule dois mililitros da cultura noturna em 40 mililitros de meio fresco sem antibióticos. Incube as bactérias por 90 minutos a 37 graus Celsius em um shaker a 180 RPMs. Isso induzirá a expressão do sistema de secreção tipo três após 90 minutos, transferirá as culturas para um tubo fresco e manterá as culturas no gelo.

Deste ponto em diante. Centrifugue as culturas durante 10 minutos a 5 000 g e quatro graus Celsius para pellet as bactérias. Em seguida, suspenda novamente o pellet em dois a três mililitros de PBS gelado, dilua a suspensão bacteriana a uma concentração de 800 milhões de unidades formadoras de colônias por mililitro e, em seguida, coloque as culturas no gelo.

Em seguida, determine a densidade óptica correspondente de cada cultura. Adicione 3,5 microlitros da suspensão bacteriana de cada cepa a diferentes poços dos 96 preparados. Poço e misture pipetando suavemente o meio duas vezes, permita que as bactérias sedimentem nas células em um mês de infecção de cerca de 100 bactérias por célula.

Realize um curso de tempo iniciando infecções em intervalos de 30 minutos e mantendo as células em uma câmara de 5% de CO2 a 37 graus Celsius. Após cada infecção, 90 minutos após a primeira infecção, aspire cuidadosamente o meio sem remover nenhuma das células hela. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS contendo 20 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 2,5 milimolares prônicos.

Isso interromperá a expressão de efetores e reduzirá a exportação de CCF quatro. Para preparar a microscopia, garanta a imersão contínua espalhando o meio de imersão no fundo dos poços, usando uma seringa de um mililitro. Evite prender bolhas de ar no meio de imersão.

Em seguida, transfira a placa de 96 poços para a platina do microscópio e localize pontos adequados para análise posterior em cada um. Bem, termine esta etapa em 10 minutos. Em seguida, adicione 70 microlitros de solução de carregamento CF 4:00 AM em cada um.

Bem, incube a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução de carga e adicione 100 microlitros de PBS contendo 20 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 2,5 milimolares prônicos. Em seguida, inicie rapidamente a microscopia.

Coloque uma objetiva de imersão de alta abertura numérica com ampliação de 20 vezes no lugar e abra o orifício do detector para 2,5 unidades arejadas e transfira a placa de 96 poços para o estágio de varredura a laser confocal. Em seguida, escolha detectores de fosfato de arseneto de gálio de alta sensibilidade com canais doadores e aceitadores simultaneamente ativos. Média de quadro triplo de profundidade de oito bits e excitação com 10% de um laser de diodo de 405 nanômetros.

Para garantir a quantificação correta, defina o ganho do detector de ambos os canais para o mesmo valor e evite pixels saturados. Em seguida, ative a luz transmitida e verifique novamente os campos de visão representativos em cada bem, ajuste e salve novamente as posições conforme necessário usando um estágio automático calibrado. Por fim, defina o lapso de tempo para dois minutos, a duração para duas horas e comece a adquirir imagens.

Após a aquisição da imagem, importe o conjunto de dados para um software que permita cálculos aritméticos de matrizes de pixels. Subtraia o plano de fundo em ambos os canais usando o mesmo deslocamento clicando primeiro no menu e, em seguida, vá para o processamento de imagem e selecione a subtração da linha de base. Em seguida, selecione cada canal e insira o valor da linha de base.

Corrija o sangramento do canal doador, canalize um para o canal aceitador canal dois com o fator de correção predeterminado, criando um novo canal de canal dois primo para esse fim. Clique no menu e selecione processamento de imagem seguido de canal Aritmética e insira o valor absoluto do canal dois subtraído pelo ponto 33 vezes. Canal um depois, exclua o canal dois e certifique-se de que o sangramento através do canal Aceitador corrigido permaneça como o novo canal dois.

Em seguida, crie um novo canal com a operação mostrada aqui para determinar o coeficiente relativo do traste. Em seguida, volte ao menu de aritmética do canal e insira o canal dois dividido pelo canal um mais o canal dois para uma visualização adequada do canal do traste. Em uma imagem de oito bits, crie um quarto canal quatro canal, que é igual a 255 vezes o canal três.

Altere a cor do canal acessando o menu de propriedades da imagem, selecione o canal quatro, depois a cor mapeada, seguida pelo arquivo da tabela de cores e selecione o jato. Em seguida, aplique um filtro mediano de três por três aos canais três e quatro. Isso reduzirá o ruído nas imagens entrando no menu de processamento de imagem e selecionando suavização.

Seguido pelo filtro mediano, selecione os dois canais e aplique um tamanho de filtro três a três por um para quantificação dos sinais celulares. Detecte as células no canal quatro selecionando superar visualização e clicando no ícone. Adicione novas superfícies.

Defina os parâmetros do algoritmo de detecção na janela de superfície e ative as duas caixas de seleção. Segmente apenas uma região de interesse e processe toda a imagem. Por fim, a seguir, defina a região de interesse editando suas dimensões.

Selecione o canal quatro como o canal de origem e defina o limite acessando o menu de limite e selecionando a subtração em segundo plano. Defina o diâmetro para 10 micrômetros, o limite de intensidade mínima manualmente para zero e o limite máximo para intensidade máxima. Filtre as estruturas por área e defina o valor mínimo para 187 micrômetros quadrados.

Em seguida, conclua a detecção de superfície. Finalmente, extraia os valores médios da intensidade de fluorescência do doador no canal um e do coeficiente de traste relativo no canal três, juntamente com seus desvios padrão na entidade celular. Para mostrar a capacidade deste método de analisar quantitativamente a translocação efetora em células-alvo, duas cepas de yersinia com diferentes cinéticas de translocação foram estudadas usando fluorescência do doador e coeficientes de traste relativos.

As células infectadas do tipo selvagem mostram um aumento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Como esperado, a inclinação máxima da intensidade de fluorescência está positivamente correlacionada com a duração da infecção, indicando que diferentes concentrações de beta lactamase traduzida podem ser distinguidas de acordo com estudos anteriores. As células infectadas com o mutante de deleção yersinia YOPE exibem um aumento mais rápido da intensidade de fluorescência em comparação com a cepa do tipo selvagem.

Curiosamente, expandir a infecção para 90 minutos não acelerou ainda mais o aumento da fluorescência do doador em comparação com 60 minutos de infecção Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que o processamento do composto CCR quatro começa imediatamente após sua adição. Portanto, é importante iniciar a aquisição da imagem a tempo.