A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a secreção de proteínas de células individuais com alta resolução temporal e espacial. Isso é conseguido fabricando litograficamente nanossensores plasmônicos de ouro em lamínulas de vidro para a imagem sem rótulos de secreções de células únicas. Como segunda etapa, o chip do sensor é limpo e revestido com a monocamada automontada e, em seguida, funcionalizado com ligantes que têm alta afinidade pelas proteínas do analito secretadas.

As células seguintes são integradas nos chips sensores funcionalizados para medir suas secreções no espaço e no tempo. Os resultados mostram que as secreções de proteínas de células individuais podem ser mapeadas espacial e temporalmente sem a necessidade de rotulagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da comunicação intercelular, como como as vias de sinalização parácrinas e autócrinas governam a motilidade celular.

Para iniciar este procedimento, deposite um filme fino de cromo de 10 nanômetros em lamínulas previamente limpas por evaporação do feixe de elétrons para evitar efeitos de carga durante a padronização e imagem de nanoestruturas. Após esta rotação, a primeira camada de resistência de bicamada consiste em copolímero de lactato de etila e metilmetacrilato a 2000 RPM por 45 segundos. Em seguida, asse o substrato a 150 graus Celsius depois de permitir que o substrato esfrie até a temperatura ambiente.

Gire a segunda camada de polimetilmetacrilato a 3000 RPM por 45 segundos e asse o substrato a 150 graus Celsius. A bicamada resiste usando litografia por feixe de elétrons ou EBL. Desenvolva um álcool isopropílico ou IPA metil isobutilcetona, ou MIBK na proporção de dois para um e enxágue em IPA.

Remova o cromo da área desenvolvida das nanoestruturas através da gravura em àgua forte molhada usando a gravura forte do CR sete por 10 segundos na temperatura ambiente e enxágüe então na água destilada deionizada, destilada Deposite um filme titanium do ouro na carcaça usando o evaporador do feixe de elétrons que segue o depósito do ouro. Levante a bicamada de copolímero. Resista embebendo o substrato em acetona por quatro horas.

Em seguida, inspecione o substrato usando um microscópio eletrônico de varredura para confirmar a forma e o tamanho da nanoestrutura. As nanoestruturas resultantes são normalmente separadas por um passo de 300 nanômetros. 20 por 20 matrizes de nanoestruturas são espaçadas por 30 mícrons centro a centro.

Deixando amplo espaço para imagens de células, um chip típico conterá 300 matrizes. Remova o cromo restante do substrato por meio de borda úmida usando CR sete gravura por 60 segundos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue o substrato em água destilada deionizada.

Em seguida, inspecione um subconjunto de matrizes usando o microscópio de força atômica para a verificação de tamanho e uniformidade. Esta lamínula de vidro estampada pode ser usada várias vezes, desde que os procedimentos de limpeza adequados sejam seguidos para limpar e regenerar o plasma de superfície localizada e os chips de ressonância ou LSPR. Cinzas de plasma a uma potência de 40 watts em uma mistura de 300 mili a 5% de hidrogênio e 95% de argônio por 45 segundos.

Funcionalize a superfície do ouro e as nanoestruturas imediatamente após a incineração do plasma. Imergindo o chip em uma solução de tiol de etanol de dois componentes consistindo em uma proporção de três para um de SPO e SPC. Depois de deixar o chip na solução de tiol durante a noite para formar uma monocamada automontada, enxágue-o com etanol e seque com gás nitrogênio, carregue o chip LSPR dentro de um suporte microfluídico feito sob medida, colocando o chip em uma peça inferior de alumínio.

Em seguida, coloque o chip entre esta peça inferior e uma junta de silicone e uma peça superior de plástico transparente usando quatro parafusos para prender o conjunto. Para uma aplicação típica de tiol à base de SPC, coloque 300 microlitros de uma mistura de um para um de EDC 133 milimolar e NHS 33 milimolar em água destilada deionizada para ativar os grupos carboxila do componente tiol SPC. Depois de esperar 10 minutos, enxágue manualmente a superfície com PBS 10 milimolares após este conjugar o grupo carboxila ativado com o ligante de interesse por revestimento de gota de 300 microlitros da solução do ligante.

Depois de esperar uma hora e enxaguar a superfície com código de gota PBS de 10 milimolares, 300 microlitros de etanolamina 0,1 molar em PBS no chip para minimizar a ligação inespecífica. Após esperar 10 minutos, lave a etanolamina com PBS contendo 0,005% entre 20 ou PBST 20. Em seguida, coloque uma peça de quartzo acima do chip para reduzir as flutuações nos dados relacionados a um menisco em mudança.

Mantenha o chip úmido com tampão PBST 20 durante a montagem no microscópio. Conecte a tubulação microfluídica ao conjunto e ao tampão de fluxo até que um estado estacionário seja alcançado. Em seguida, coloque o conjunto do chip LSPR firmemente no suporte de amostra do estágio aquecido.

A configuração óptica para este método é mostrada aqui. A luz da lâmpada halógena é passada através de um filtro de passagem longa de 593 nanômetros para eliminar comprimentos de onda, que não contribuem para a resposta nanoplasmônica. A luz é então polarizada linearmente e a amostra é iluminada por meio de uma objetiva de abertura numérica de 40 x 1,4 para a excitação das nanoestruturas plasmônicas de ouro.

A luz espalhada é coletada pela objetiva e passada por um polarizador cruzado para reduzir o sinal de fundo do substrato de vidro. Um divisor de feixe 50 50 é inserido no caminho de luz coletado para análise espectroscópica e de imagens simultâneas. Depois de permitir que a montagem e o microscópio se equilibrem por pelo menos duas horas, alinhe o chip usando o joystick para que a matriz central fique alinhada com a fibra óptica para espectroscopia.

Depois de cultivar e peletizar células DOMA híbridas por centrifugação, colhe-as e teste a viabilidade antes de introduzi-las nos chips LSPR. Em seguida, introduza 50 microlitros da solução celular manualmente nos chips LSPR com uma micropipeta. Finalmente, lave as células restantes em solução com meio livre de soro fresco usando um sistema de profusão microfluídica para preparar os chips LSPR para imagem.

Uma sobreposição de uma imagem de imagem LSPR, que destaca as matrizes quadradas e uma imagem iluminada por luz transmitida, que destaca a célula no canto inferior esquerdo, é mostrada aqui. Uma célula corada com a haste de corante de membrana fluorescente Domine, DHPE exibe extensões semelhantes a filopódios. Se tais extensões se sobrepusessem às matrizes, elas dariam um falso positivo para dados de espectrometria de secreção de proteínas antes e depois da introdução de uma solução saturante de anticorpos antis cmic nas matrizes funcionalizadas cmic ser exibida aqui.

Este método é usado para calibrar as matrizes. A calibração das matrizes ajuda a normalizar a resposta dos sensores e determinar a ocupação fracionária com base no perfil de biofuncionalização de cada execução. Um instrumento SPR comercial é usado para determinar a constante de dissociação, bem como para estudar a resistência à ligação não específica usando o mesmo protocolo descrito para o chip LSPR.

Os valores normalizados de duas matrizes são mostrados aqui. Uma matriz estava a 10 micrômetros da célula, enquanto o controle estava a 130 micrômetros da célula. O aumento repentino na resposta normalizada da matriz mais próxima da célula em relação à resposta plana da matriz de controle é indicativo de uma explosão localizada de anticorpos secretados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como medir as secreções de proteínas de células individuais com alta resolução espacial e temporal.