Name: A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a medir secreções proteicas de células individuais com alta resolução temporal e espacial usando nanossensores plasmônicos de ouro. Este método sem marcadores permite mapear dinâmicas de secreção celular em tempo real.

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Os autores não têm nada a divulgar.

1. Nanostructure Fabrication <ol><li> Escolha de 25 mm de diâmetro, com lamelas de vidro de uma espessura aproximada de 170 fim (N ° 1.5) como substratos para nanofabrication. </li><li> Mergulhar as lamelas em solução de piranha (razão 3: 1 de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio) durante pelo menos 6 horas. Lavar a piranha lamela embebido com quantidade abundante de ultrapura 18,2 mohms água destilada deionizada (DDW). CUIDADO: Piranha ácido reage violentamente com materiais orgânicos e devem ser manuseados com extremo cuidado. </li><li> Depósito de 10 nm de crómio película fina sobre as lamelas por evaporação e-feixe para evitar os efeitos de carga durante a modelação e de imagem de nanoestruturas. </li><li> Girar a primeira camada da camada dupla de resistir constituído por metacrilato de etil lactato de metilo copolímero (MMA_EL6) a 2.000 rpm durante 45 segundos e, em seguida, cozer a 150 ° C. Girar a segunda camada de poli-metacrilato de metilo (950PMMA_A2) a 3.000 rpm durante 45 segundos, em seguida, cozer a 180 ° C. </li><li> Tamborilarn bicamada resistir usando a litografia por feixe de elétrons (EBL) a 25 kV com uma dose de 300 uC / cm 2 de área. Desenvolver em álcool isopropílico (IPA) / metil-isobutil-cetona (MIBK): 2/1 e enxaguar em IPA. </li><li> Depósito Ti (5 milhas náuticas) / Au (80 nm) filme sobre o substrato usando um evaporador e-feixe. </li><li> Após a deposição de ouro, levante a bicamada copolímero resistir por imersão do substrato em acetona, durante 4 h. </li><li> Inspecione o suporte usando o microscópio eletrônico de varredura (MEV) para confirmar a forma e tamanho nanoestrutura, remover o cromo restante do substrato via etch molhado usando CR-7 etchant durante 60 segundos à temperatura ambiente e depois enxaguar em DDW. </li><li> Projete um espaçamento de centro a centro matriz de 33 mm de deixar espaço para imagens de células entre matrizes. Padrão as nanoestruturas em 20 x 20 padrão para cada matriz com um arremesso de 300 nm usando um escritor e-feixe. Cada chip contém 300 arrays com uma dimensão típica nanoestrutura de altura de 80 ± 2,5 nm e 70 nm ± 2,5 Diameter. </li><li> Inspecione um subconjunto de arrays usando o microscópio de força atômica (AFM) para a verificação do tamanho e uniformidade. </li><li> Anexar um anel de suporte, tipicamente, de silício, para a parte de trás da lamela utilizando um epoxi de cura por UV. </li></ol> 2. Chip Limpeza e Aplicação de auto-montados Monolayer <ol><li> Para a limpeza e regeneração das batatas fritas, as cinzas de plasma a uma potência de 40 W em uma mistura de 300 mTorr de 5% de hidrogénio, 95% de árgon, durante 45 segundos após a limpeza da câmara durante 5 min sob as mesmas condições. </li><li> Funcionalizar o nanoestruturas de ouro imediatamente após a calcinação por plasma pela imersão do chip em uma solução etanólica tiol de dois componentes consistindo de uma proporção 3: 1 de SH-(CH2) 8 EG 3 -OH (SPO) e um componente ou com uma amina carboxilo ou grupo funcional, ou seja, SH- (CH2) 11 EG 3 -NH2 (SPN) ou SH- (CH2) 3-COOH 11 EG (SPC). </li><li> Deixe o chip de in a solução tiol O / N para formar uma monocamada auto-montada (SAM). </li><li> Lavar o chip com etanol e seco com azoto gasoso. </li><li> Se necessário, armazenar o chip funcionalizado por até 2 semanas a 4 ° C. </li><li> Quando pronto para uso reagir o SPN ou componente SPC com o ligando utilizando uma química de acordo com o ligando de escolha (ver abaixo). Nota: Os chips podem ser regenerado e re-funcionalizado dezenas de vezes. Um dado chip pode ser usado por períodos que variam de 6 meses a mais de um ano. O espectro medido em uma determinada matriz são reproduzidas de forma confiável após repetidas regenerações por incineração plasma, seguido de biofunctionalization. 29 </li></ol> 3. A funcionalização de superfície e Caracterização Cinética Nota: usar o chip funcionalizado no instrumento comercial SPR para caracterizar as constantes cinéticas entre o ligando e o analito, bem como para o estudo da resistência de SAM para não específica binding. Existe uma vasta gama de taxas de fluxo e desenhos de microfluidos que permitem para a funcionalização da superfície eficiente. Como temos um SPR disponível comercialmente padronizamos em torno de suas taxas de fluxo recomendados. Notamos que estas taxas de fluxo são típicos de todos os instrumentos da SPR e por isso não são restritivas. O instrumento SPR não é uma necessidade uma vez que todos funcionalização pode ser feito diretamente no chip LSPR, mas fez reduzir a nossa carga de trabalho porque é um instrumento multiplexado ao passo que a nossa configuração microfluídico LSPR não é. <ol><li> Funcionalizar um chip nua ouro comercial com a SAM, conforme descrito na Seção 2. </li><li> Se for utilizada uma SAM com base SPC, activar o grupo carboxilo, com uma mistura 1: 1 de 133 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 33 mM e N-hidroxissuccinimida de (NHS) em DDW durante 10 min. </li><li> Conjugar o grupo carboxilo activado com o anticorpo / ligando de interesse para 300 seg usando um caudal de 30 ul / min. Prepare os ligandos empH 6 tampão fosfato, tipicamente, mas este pode variar dependendo da molécula. </li><li> Após a conjugação ligando, fluxo de 0,1 M de etanolamina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) como um desactivador de passo para 300 seg a uma taxa de 30 ul / min. Etanolamina ajuda a minimizar a ligação não específica. </li><li> Introduzir o analito de interesse a um caudal de 100 ul / min usando uma gama de concentrações e calcular as constantes de velocidade cinéticas, utilizando um software de análise cinética. </li><li> Se a ligação não específica é problemático, aumentar a proporção de SPO SPC ou SPN. </li></ol> Definições 4. LSPR Gerais <ol><li> Microscópio configurações: <ol><li> Use uma lâmpada de 100 W halogênio para Koehler iluminar a amostra. Usar um filtro de passagem longa (tipicamente 593 nm de corte) no caminho da luz para eliminar comprimentos de onda que não contribuem para o deslocamento de ressonância (Figura 2). </li><li> Para a coleta de dados LSPRi, use um microscópio invertido com um immersio óleo de 40Xobjectivo N (1,4 NA) e uma câmara CCD arrefecida termoelectricamente de 16 bits. </li><li> Coloque um divisor de feixe para a porta de saída do microscópio para obter espectros de aparência e simultaneamente. </li><li> Regule a temperatura controlada palco microscópio para 37 ° C e equilibrar durante 4 h. </li><li> Incorporar uma montagem de incubação adicional sobre o microscópio para regular a concentração de humidade e de CO2 a 5% e 95%, respectivamente. </li></ol></li><li> Chip preparação e montagem: <ol><li> Funcionalizar o chip LSPR como descrito na secção 2, com as relações de SAM de dois componentes óptimos determinados a partir das experiências de SPR. </li><li> Coloque o chip dentro de um titular microfluídico feito sob encomenda da seguinte forma. Coloque o chip em uma parte inferior de alumínio. Sanduíche do chip entre esta parte inferior e uma junta de silicone e um pedaço de plástico transparente superior. Use 4 parafusos para fixar o conjunto. </li><li> Para uma aplicação tiol típico baseado no SPC, queda revestimento 300 ï¿½ de 1: 1 mixtura de 133 mM de EDC e 33 mM de NHS em DDW para activar os grupos carboxilo do componente tiol SPC. </li><li> Esperar durante 10 min e enxaguar manualmente a superfície com PBS 10 mM. </li><li> Conjugar o grupo carboxilo activado com o ligando (tipicamente um anticorpo ou fragmento de anticorpo) de interesse a gota revestimento 300 ul de solução de ligando. </li><li> Aguarde 30 minutos e enxágüe manualmente com PBS 10 mM. </li><li> Largar coat 300 mL de etanolamina 0,1 M em PBS no chip para minimizar a ligação não específica. Aguarde 10 min. </li><li> Lava-se a etanolamina com PBS contendo 0,005% de Tween 20 (PBS-T20). </li><li> Coloque um pedaço de quartzo acima do chip para reduzir as flutuações nos dados relacionados a um menisco mudança. </li><li> Mantenha o chip molhado com tampão PBS-T20, enquanto a montagem em microscópio. </li><li> Coloque o conjunto de chips LSPR firmemente no suporte de amostras a fase aquecida e prenda o tubo de microfluidos. </li><li> Conecte a tubulação de microfluídica à montagem e de fluxo de buffer (ou meio livre de soro para estudos de células) até um estado de equilíbrio é atingido. </li><li> Permitir que o conjunto de microscópio e a equilibrar durante pelo menos 2 horas. </li><li> Alinhar o chip utilizando joystick de modo que a matriz central é alinhado com a fibra óptica para a espectroscopia. Os dados espectroscópicos são feitas usando um espectrómetro e software de análise espectral. </li><li> Mantenha matrizes em foco durante todo o experimento usando autofocus software, Zeiss Definite Focus ou dispositivo equivalente autofocus. </li></ol></li></ol> 5. LSPR imagem de secreções-c-myc Anti de Células de hibridoma 9E10 Nota: A linha celular de hibridoma utilizado para este estudo expressam o anticorpo anti-c-myc de forma constitutiva e, portanto, não requerem um gatilho química <ol><li> Funcionalizar o nanoestruturas com péptido c-myc. Isto tem um valor de K D de 1,77 nM para os anticorpos anti-c-myc 9E10 secretados pelo clone de hibridoma de células. </li><li> Cultura as células de hibridoma em complete meio de crescimento com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibióticos num balão T75 a 37 ° C sob 5% de CO 2. Manter uma densidade celular de 4 x 10 5 células / ml. </li><li> Para os estudos da secreção de células, as células pellet a partir do balão T75 por centrifugação, lava-se duas vezes com RPMI-1640 livre de soro meios (SFM) para remover os anticorpos segregados e ajustar a densidade celular a 4 x 10 6 células / ml. </li><li> Colheita das células e teste de viabilidade antes de introduzir-los para os chips LSPR. </li><li> Introduzir 50 ul da solução de células manualmente sobre os chips LSPR com uma micropipeta. Depois de alguns minutos, de 25 a 50 células aderem à superfície das batatas fritas LSPR. </li><li> Lave as células restantes em solução com fresco SFM usando o sistema de perfusão microfluídico. </li><li> Selecione as matrizes LSPR para imagens que estejam próximas, num raio de 10 mm, mas não se sobrepõem com as células. </li><li> Para assegurar que o sinal é específico para o ANTIB anti-c-myc segregadaodies introduzir o meio de cultura de células com e sem os anticorpos presentes, bem como com os anticorpos, mas com os seus locais de ligação bloqueada pela presença de uma concentração saturante de c-myc péptido na solução. </li><li> Calibrar os sensores no final de cada ensaio com uma solução satura de anticorpos anti-c-myc (250 nm). Isto ajuda na normalização da resposta dos sensores e determinam ocupação fraccionada com base no perfil biofunctionalization de cada prazo. </li><li> Corrigir a deriva na direção X e Y usando software de alinhamento de imagem. </li></ol>

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<li>Bramswig, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Carcinoembryonic+Antigen+Activates+Endothelial+Cells+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).</li>
</ol>

Agradecemos a George Anderson pelos comentários e discussões úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Nanociência do Laboratório de Pesquisa Naval e pelo Prêmio de Associação de Pesquisa do Conselho Nacional de Pesquisa.

A técnica de imagem LSPR descrita neste trabalho tem inúmeras vantagens sobre as metodologias mais tradicionais para detecção de secreções celulares. Primeiro, a resolução de tempo de nossa técnica é da ordem de segundos, enquanto a alternativa comercial, um ensaio de imunoareia conhecido como EliSpot, tem uma resolução de tempo típica de 2 a 3 dias. 7,32 Como resultado, conseguimos resolver mudanças bruscas na taxa de secreção de proteínas, como a mostrada na Figura 6. Em segundo lugar, ter matrizes distribuídas no chip permite que o sinal secretado seja rastreado no espaço e no tempo, o que permite comparações mais rigorosas com modelos de secreção celular baseados em difusão. Além disso, matrizes como a matriz de controle mostrada na Figura 6 podem ser usadas para subtrair mudanças globais na imagem que normalmente surgem de fatores instrumentais, como desvio de foco. Terceiro, nossa técnica não requer modificação das células. Se desejado, o experimento pode incorporar tags comumente usadas, como proteínas fluorescentes, mas se houver preocupação de que tais tags possam afetar negativamente a viabilidade ou a homeostase celular, a natureza livre de rótulos de nossa abordagem não as exige. Em quarto lugar, usando os dados espectroscópicos, demonstramos que informações quantitativas sobre a ocupação fracionada de ligantes ligados à superfície podem ser calculadas.
Existem vários métodos alternativos ao EBL para a fabricação de nanopartículas metálicas. No entanto, descobrimos que o EBL oferece flexibilidade considerável para otimizar as dimensões da nanoestrutura e da matriz para melhor se adequar à óptica e às células sob investigação. Também crítico é o fato de que os chips podem ser facilmente regenerados por cinzas de plasma. Desta forma, um chip típico pode ser usado dezenas de vezes. Os detalhes de biofuncionalização devem ser modificados para a aplicação específica. O protocolo aqui apresentado conjugou a superfície com ligantes do peptídeo c-myc relativamente pequenos. Ligantes maiores, como anticorpos inteiros, normalmente requerem mais espaçamento e, portanto, uma proporção mais alta de SPO para SPN/SPC. Independentemente disso, uma camada SAM bem formada é essencial para evitar a ligação não específica em experimentos com células vivas. Em geral, analitos de maior peso molecular são mais facilmente detectados por LSPR. Assim, em sua manifestação unicelular, essa técnica pode não ser apropriada para detectar a secreção de pequenas proteínas, como as citocinas. 
A configuração atual tem sido usada para estudar células individuais não aderentes. Há um número significativo de proteínas e vesículas sinalizadoras secretadas às quais os resultados relatados neste trabalho são diretamente aplicáveis. Por exemplo, antígeno carcinoembrionário (CEA), que há décadas tem sido um marcador diagnóstico de câncer. Sabe-se que as células cancerígenas do cólon secretam CEA a taxas de milhares de moléculas/célula/hora e o peso molecular é de 180 kDa, o que excede o dos anticorpos IgG. Acredita-se que o CEA esteja envolvido em vias de sinalização autócrinas e parácrinas, mas a natureza espaço-temporal dessas secreções nunca foi medida. Nossa técnica pode abordar diretamente essas questões de sinalização. Uma extensão deste trabalho será medir a natureza espaço-temporal da secreção de CEA a partir de células individuais. 33 Trabalhos futuros também se concentrarão na integração de LSPRi com culturas de células bidimensionais e tridimensionais de células aderentes. Ao incorporar matrizes multiplexadas capazes de detectar várias proteínas secretadas em paralelo, essa técnica tem o potencial de abrir uma nova janela para as secreções celulares e como elas influenciam as células vizinhas.

Comunicação inter-celular é crucial para a regulação de muitas atividades fisiológicas dentro e fora da célula. Uma variedade de proteínas e vesículas pode ser secretado que posteriormente desencadear processos celulares complexos, tais como a diferenciação, a cicatrização de feridas, a resposta imune, migração, proliferação e. 1-5 O mau funcionamento de vias de sinalização inter-celulares têm sido implicados em numerosas doenças, incluindo o cancro, aterosclerose , e diabetes, para citar alguns. O ensaio de secreção celular óptima deve ser capaz de espacialmente e temporalmente o mapeamento da proteína segregada de interesse sem interromper as vias de sinalização relevantes. Desta forma relações causais entre os perfis de concentração e a resposta das células receptoras pode ser inferida. Infelizmente, muitas das técnicas baseadas em fluorescência mais geralmente utilizados não satisfazem estes critérios. Proteínas de fusão fluorescentes podem ser utilizadas para etiquetar o analito Within da célula, mas podem interromper a via secretora, ou, se segregado, resulta em uma luz difusa no exterior da célula que é difícil de quantificar. Ensaios baseados em immunosandwich fluorescentes são as técnicas mais vulgarmente utilizadas para a detecção de secreções celulares, mas tipicamente requerem o isolamento de células individuais. 6-11 Além disso, a introdução do anticorpo de detecção, tipicamente interrompe ou termina a experiência e o tamanho das etiquetas de anticorpos, 150 kDa para IgG, é um impedimento para sinalização a jusante. Devido a estas barreiras é preferível que uma técnica livre rótulo ser utilizado para secreção de proteínas e entre tecnologias de imagem livre de etiquetas existentes, a superfície de ressonância de plasmão (SPR) e sensores localizados de ressonância de plasmon de superfície (LSPR) são excelentes candidatos. 12-17 Estes sensores têm sido amplamente utilizados para estudos de ligação de analisável, exossomas de proteínas e outros biomarcadores. 18-24 Em caso de LSPR, o nanostr plasmonicuctures pode ser modelado lithographically em lamelas de vidro e animado usando luz visível através de configurações padrão de microscopia de campo amplo. Devido à sua presença em nanoescala, a maioria do substrato de vidro está disponível para imagens técnicas comuns, tais como de campo brilhante e microscopia de fluorescência tornando assim estas sondas adequados para integração com microscopia de células vivas. 25-28 Demonstrámos a medição em tempo real de secreção de anticorpos a partir de células de hibridoma utilizando nanoestruturas plasmonic ouro funcionalizado com resoluções espaciais e temporais de 225 mseg e 10 uM, respectivamente. A configuração básica do chip é ilustrado na Figura 1. 28 O percurso de luz de saída do microscópio é dividido entre uma câmara CCD usada para aparência e um espectrómetro de fibra-opticamente acoplada para a determinação quantitativa de ocupação fraccionada de uma dada matriz de nanoestruturas (Figura 2 ). O PROTOCol apresentada neste documento descreve a concepção experimental para a medição em tempo real das secreções celulares individuais enquanto monitorando simultaneamente a resposta das células utilizando a microscopia de campo brilhante padrão. A abordagem multidisciplinar inclui a fabricação de nanoestruturas, funcionalização das nanoestruturas para a ligação de analitos de elevada afinidade, a optimização da superfície tanto para minimizar a ligação não específica e caracterização das constantes cinéticas usando uma superfície comercial Plasmon Resonance (SPR) instrumento, a integração de linhas celulares sobre o substrato, e a análise de imagens e de dados espectrais. Prevemos que esta técnica seja uma tecnologia capacitadora para o mapeamento espaço-temporal das secreções celulares e suas relações causais com células receptoras.

<table><tbody><tr><td>25&#160; lamínulas de vidro de mm de diâmetro</td> Ferramentas <td>de Biociência&nbsp;</td><td>CSHP-No1.5-25</td><td>&nbsp; 170&plusmn; 5 &micro; m é ideal</td></tr><tr><td>Poli-metacrilato de metila</td><td>Microchem</td><td>PMMA 950 A4</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de etila metacrilato de metila</td><td>Microchem</td><td>MMA EL6</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador de feixe de elétrons</td><td>Temescal</td><td>FC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Litografia de feixe de elétrons</td><td>Raith</td><td>Series 150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>CR-7 cromo gravante</td><td>Cyantek</td><td>CR-7</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de força atômica</td><td>Veeco</td><td>Nanoscope III</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incineração de plasma</td><td>Technics</td><td>Series 85 RIE</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m8.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)</td><td>Prochimia</td><td>TH 003m11n3-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)</td><td>Prochimia</td><td>TH 002-m11.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ressonância plasmônica de superfície</td><td>Biorad</td><td>XPR36</td><td></td></tr><tr><td>Chip de ouro nu</td><td>Biorad</td><td>GLC chip</td><td>Plasma queimado para remover a monocamada</td></tr><tr><td>1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida</td><td>Thermo</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Thermo</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Pentilamina-Biotina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21345</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Neutraavidina</td><td>Thermo</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermo</td><td>28374</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td>O microscópio está equipado com objetiva de imersão em óleo 40X; CO2 e incubação de umidade da câmera CCD Pecon GmbH</td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>Orca R2</td><td>Resfriado termoeletricamente (16 bits)</td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65Pro</td><td></td></tr><tr><td>Spectrasuite</td><td>Ocean Optics</td><td>versão1.4</td><td></td></tr><tr><td>peptídeo c-myc HyNic Tag</td><td>Solulink</td><td>SP-E003</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal anti-c-myc</td><td>Linha</td> celular de hibridoma Sigma-Aldrich <td>M4439</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1729</td><td></td></tr><tr><td>Solução antimistótica antibiótica (100 vezes;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Serum mídia livre RPMI 1640&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine DHPE</td><td>Life Technologies</td><td>L-1392</td><td></td></tr></tbody></table>

a técnica de livre-label para a imagem espaço-temporal do secreções única célula

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

A comunicação intercelular é parte integrante de um sistema complexo que ajuda a manter as atividades celulares básicas. Como resultado, o mau funcionamento dessa sinalização pode levar a muitos distúrbios. Para entender a sinalização célula a célula, é essencial estudar a natureza espacial e temporal das moléculas secretadas da célula sem perturbar o ambiente local. Vários ensaios foram desenvolvidos para estudar a secreção de proteínas, no entanto, esses métodos são normalmente baseados em sondas fluorescentes que interrompem as vias de sinalização relevantes. Para superar essa limitação, é necessária uma técnica sem marcadores.
Neste artigo, descrevemos a fabricação e aplicação de uma tecnologia de ressonância plasmônica de superfície localizada sem marcação (LSPRi) capaz de detectar secreções de proteínas de uma única célula. As nanoestruturas plasmônicas são padronizadas litograficamente em uma lamínula de vidro padrão e podem ser excitadas usando luz visível em microscópios de luz disponíveis comercialmente. Apenas uma pequena fração da lamínula é coberta pelas nanoestruturas e, portanto, essa técnica é adequada para combinar técnicas comuns, como fluorescência e imagens de campo claro.
Uma abordagem multidisciplinar é usada neste protocolo que incorpora nanofabricação de sensores e subsequente biofuncionalização, caracterização cinética de ligação de ligante e analito, integração do chip e células vivas e análise do sinal medido. Como um todo, essa tecnologia permite uma abordagem geral sem rótulos para mapear as secreções celulares e correlacioná-las com as respostas das células próximas.

Em um estudo típico secreção de células vivas existem vários modos de recolha de dados em curso. A Figura 3 mostra uma sobreposição de uma imagem LSPRi, que destaca as matrizes quadradas, e uma imagem iluminada da luz transmitida que destaca a célula no canto inferior esquerdo. Os dados são tipicamente recolhida durante um período de 3 horas seguido pela introdução de uma solução satura da substância a analisar para o cálculo de normalização descrito abaixo. Imagens de fluorescência também pode ser integrado na rotina de recolha de dados pela comutação automática de um cubo de filtro. Na Figura 4 uma célula corada com o corante fluorescente rodamina DHPE membrana apresenta extensões lamellipodia-like (setas). Se essas extensões foram a sobrepor-se com as matrizes que iriam dar um falso-positivo para a secreção de proteínas. Tendo vários modos de imagem podem ajudar a identificar essas ocorrências. A Figura 5 mostra dados de espectrometria de antes e réer a introdução de uma solução de saturação (400 nM) de comercialmente adquirido anticorpos anti-c-myc para as matrizes funcionalizados c-myc. Não células estavam presentes nesta experiência. O espectro mostra tanto um desvio para o vermelho e um aumento na intensidade. A diferença entre as áreas sob as curvas de duas resulta em um aumento na intensidade de imagem na matriz de modo LSPRi na câmara CCD. Uma abordagem menos análise de dados quadrados não-linear foi desenvolvido para inferir ocupação fraccionada ligada à superfície de ligandos a partir dos espectros 30,31. No final da experiência, os valores de intensidade saturado (isto é, ocupação fraccionada ≈ 1) são utilizados para calcular uma resposta normalizada para cada matriz com a seguinte fórmula: Onde são a intensidade normalizada no ponto do tempo t, a intensidade inicial no início da experiência, intensidade final saturado, e a intensidade medida da matriz no ponto de tempo t </em&gt;, respectivamente. Os valores normalizados a partir de duas matrizes são mostrados na Figura 6. Uma matriz estava dentro de 10 um da célula sob investigação enquanto a outra, utilizada como controlo, era uma distância de 130 um a partir da célula. O aumento repentino na resposta normalizados da matriz mais próxima à célula, relativamente à resposta plana da matriz de controlo é indicativo de uma explosão localizada de anticorpos segregados. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> Figura 1. Sensor de design. Um desenho que representa a geometria de uma experiência típica a secreção de células vivas. A célula (esferóide azul) é depositada sobre o chip para LSPR que contém as matrizes de nanoestruturas bioativa de ouro. Na vista ampliada em, a secreção de células de interesse, neste caso mostrado anticorpos como moléculas em forma de Y, é medida à medida que se ligam à superfíciedas nanoestruturas funcionalizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> Figura 2. Configuração óptica. A luz iluminada por uma lâmpada halógena é filtrado primeiro por um filtro de passagem longa (LP). A luz é polarizada linearmente (P1) e ilumina a amostra através de um NA objetiva de 40X / 1.4. A luz dispersa é recolhido por o objectivo e passados ​​através de um polarizador cruzado (P2). Um divisor de feixe 50/50 (BS) é inserido no caminho de luz coletada para espectroscópica simultânea e análise de imagens. Top Right:. Uma imagem microscopia de força atômica de 9 nanoestruturas individuais separados por um campo de 300 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> LSPRi Figura 3. Estudo de células vivas. Um fundiu imagem LSPRi luz transmitida e que mostra uma única célula de hibridoma (inferior esquerdo), circundado por 12 matrizes. Esta é uma imagem de contraste melhorado. Barra de escala é de 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> Figura 4. Estudo de fluorescência de células vivas. Uma imagem em cores falsas fluorescente de uma única célula de hibridoma DHPE coradas com rodamina, o qual é um corante de membrana. No modo de imagiologia fluorescente as matrizes não são geralmente visíveis, no entanto, um conjunto próxima é observável como aqui abfalta quadrado no canto inferior direito. A célula pode ser visto para ser separada da matriz embora as extensões tentáculo-like (possivelmente filopodia ou lamellipodia) são estende para fora a partir das células (setas). Barra de escala é de 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> Figura 5. Modalidade espectral. O espectro obtido a partir de uma matriz funcionalizada C-myc antes e após a introdução da solução de 400 nM de anticorpos anti-c-myc. Não células estavam presentes neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src= &quot;/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. A secreção única célula. A resposta de uma matriz de 15 um localizado dentro de uma única célula e um localizado 130 um de distância (de controlo). Barra de escala é de 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A comunicação inter-celular é crítico para controlar várias actividades fisiológicas dentro e fora da célula. Este documento descreve um protocolo para avaliar a natureza espaço-temporal de secreção das células individuais. Para conseguir isso, uma abordagem multidisciplinar é usado que integra livre-label nanoplasmonic sentindo com imagens de células vivas.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

O objetivo geral do seguinte experimento é medir a secreção proteica de células individuais com alta resolução temporal e espacial. Isso é alcançado por meio da fabricação litográfica de Nanossensores plasmônicos de ouro em lamínulas de vidro para a imagemagem isenta de marcadores das secreções de células únicas. Como segundo passo, o chip sensor é limpo e revestido com uma monocamada auto-organizável e, em seguida, funcionalizado com ligantes que possuem alta afinidade pelas proteínas analito secretadas.Em seguida, as células são integradas aos chips de sensor funcionalizados para medir suas secreções no espaço e no tempo. Os resultados mostram que as secreções proteicas de células individuais podem ser mapeadas tanto espacial quanto temporalmente, sem a necessidade de marcação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da comunicação intercelular, como as vias de sinalização parácrina e autócrina regulam a motilidade celular.Para iniciar este procedimento, deposite um filme fino de cromo de 10 nanômetros sobre lamínulas previamente limpas por evaporação por feixe de elétrons, a fim de evitar efeitos de carga durante a padronização e a imagem de nanoestruturas. Em seguida, gire a primeira camada de resist bicalor, consistindo em lactato de etila e copolímero de metilmetacrilato, a 2000 RPM por 45 segundos. A seguir, aqueça o substrato a 150 graus Celsius após permitir que o substrato esfrie até a temperatura ambiente.Centrifugue a segunda camada de polimetilmetacrilato a 3000 RPM por 45 segundos e aqueça o substrato a 150 graus Celsius. Patterne a resistência em duas camadas utilizando litografia por feixe de elétrons ou EBL. Revele em álcool isopropílico ou IPA e metil isobutil cetona, ou MIBK, na proporção de dois para um, e enxágue em IPA.Remova o cromo da área desenvolvida de nanoestruturas por meio de ataque úmido utilizando CR Seven por 10 segundos à temperatura ambiente e, em seguida, enxágue em água desionizada, destilada e duplamente destilada. Deposite uma camada de titânio-ouro sobre o substrato utilizando o evaporador por feixe de elétrons após a deposição de ouro. Remova a bicamada de copolímero pelo resistente mergulhando o substrato em acetona por quatro horas.Em seguida, inspecione o substrato utilizando um microscópio eletrônico de varredura para confirmar a forma e o tamanho da nanoestrutura. As nanoestruturas resultantes são tipicamente separadas por um passo de 300 nanômetros. Arranjos de 20 por 20 nanoestruturas são espaçados de centro a centro por 30 mícrons.Deixando espaço suficiente para a imagem das células, um chip típico conterá 300 matrizes. Remova o cromo remanescente do substrato por meio de ataque úmido utilizando CR seven por 60 segundos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue o substrato com água destilada desionizada.Em seguida, inspecione um subconjunto de matrizes utilizando o microscópio de força atômica para verificação do tamanho e uniformidade. Este escorredor de vidro padronizado pode ser usado várias vezes, desde que os procedimentos adequados de limpeza sejam seguidos para limpar e regenerar os chips de ressonância de plasmon superficial localizada ou LSPR. Realize a remoção por plasma com potência de 40 watts em uma mistura de 300 militorr de 5% de hidrogênio e 95% de argônio durante 45 segundos.Funcionalize a superfície de ouro e as nanoestruturas imediatamente após a limpeza com plasma. Mergulhando o chip em uma solução binária de etanol e tiol contendo uma proporção de três para um de SPO e SPC. Após deixar o chip na solução de tiol durante a noite para formar uma monocamada auto-organizada, enxágue-o com etanol e seque com gás nitrogênio. Carregue o chip LSPR dentro de um suporte microfluídico personalizado colocando o chip sobre uma peça inferior de alumínio.Em seguida, monte o chip entre esta peça inferior, uma junta de silicone e uma peça superior de plástico transparente usando quatro parafusos para prender o conjunto. Para uma aplicação típica de tiol baseada em SPC, adicione por gotejamento 300 microlitros de uma mistura um para um de EDC 133 milimolar e NHS 33 milimolar em água destilada desionizada para ativar os grupos carboxila do componente de tiol SPC. Após aguardar 10 minutos, enxágue manualmente a superfície com PBS 10 milimolar e, em seguida, conjugue o grupo carboxila ativado com o ligante de interesse aplicando por gotejamento 300 microlitros da solução do ligante.Após aguardar por uma hora e enxaguar a superfície com PBS 10 milimolar gota a gota, adicione 300 microlitros de etanolamina 0,1 molar em PBS sobre o chip para minimizar a ligação inespecífica. Após aguardar por 10 minutos, lave a etanolamina com PBS contendo 0,005% de Tween 20 ou PBST 20. Em seguida, posicione um pedaço de quartzo acima do chip para reduzir flutuações nos dados relacionadas à alteração do menisco.Mantenha o chip úmido com o tampão PBST 20 durante a montagem no microscópio. Conecte a tubulação microfluídica ao conjunto e faça fluir o tampão até que um estado estável seja alcançado. Em seguida, posicione firmemente o conjunto do chip LSPR no suporte da amostra do estágio aquecido.A configuração óptica para este método é mostrada aqui. A luz da lâmpada de halogênio passa por um filtro passa-alta de 593 nanômetros para eliminar comprimentos de onda que não contribuem para a resposta nano-plasmônica. Em seguida, a luz é linearmente polarizada e a amostra é iluminada por meio de uma objetiva de 40 x 1,4 de abertura numérica para a excitação das nanoestruturas plasmônicas de ouro.A luz dispersada é coletada pelo objetivo e passa por um polarizador cruzado para reduzir o sinal de fundo proveniente do substrato de vidro. Um divisor de feixe 50 50 é inserido no trajeto da luz coletada para permitir análise espectroscópica e de imagem simultaneamente. Após permitir que o conjunto e o microscópio atinjam o equilíbrio por pelo menos duas horas, alinhe o chip usando o joystick, de modo que a matriz central fique alinhada com a fibra óptica para espectroscopia.Após o cultivo e centrifugação das células híbridas DOMA para formação do pellet, recolha-as e teste a viabilidade antes de introduzi-las nos chips LSPR. Em seguida, adicione manualmente 50 microlitros da solução celular nos chips LSPR com uma micropipeta. Por fim, remova as células remanescentes na solução com meio livre de soro fresco, utilizando um sistema de perfusão microfluídica, para preparar os chips LSPR para a imagem.Uma sobreposição de uma imagem de microscopia de ressonância de plasmones de superfície localizados (LSPR), que destaca as matrizes quadradas, e uma imagem iluminada por luz transmitida, que destaca a célula na parte inferior esquerda, é mostrada aqui. Uma célula corada com o corante fluorescente de membrana rodamina DHPE exibe extensões semelhantes a filopódios. Se tais extensões se sobrepuserem às matrizes, elas gerariam um falso positivo nos dados de espectrometria de secreção proteica. Antes e depois da introdução de uma solução saturante de anticorpos anti-cmic nos arrays funcionalizados com cmic é exibido aqui.Este método é utilizado para calibrar as matrizes. A calibração das matrizes auxilia na normalização da resposta dos sensores e na determinação da ocupação fracional com base no perfil de biofuncionalização de cada ensaio. Um instrumento SPR comercial é usado para determinar a constante de dissociação, bem como para estudar a resistência à ligação não específica, utilizando o mesmo protocolo descrito para o chip LSPR.Valores normalizados de dois arranjos são mostrados aqui. Um arranjo estava a até 10 micrômetros da célula, enquanto o controle estava a 130 micrômetros da célula. O aumento súbito na resposta normalizada do arranjo mais próximo da célula, em comparação com a resposta plana do arranjo controle, indica uma explosão localizada de anticorpos secretados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir secreções proteicas de células individuais com alta resolução espacial e temporal.

a-label-free-technique-for-spatio-temporal-imaging-single-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra imagens de ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula. Usando uma configuração microfluídica e um chip de nanoestrutura plasmônica ligado a peptídeos, as mudanças na intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância revelam interações com proteínas secretadas de uma única célula.

Ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

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Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

Apresentamos um protocolo para a detecção óptica em tempo real de proteínas sem rótulo única, como eles são secretados de células vivas. Isto é baseado em microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), que pode ser aplicada a uma variedade de diferentes sistemas biológicos e configurações.

Etiqueta-Free Imaging de único proteínas secretadas de células vivas através de iSCAT microscopia

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Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

Apresentamos um método para a aquisição de cursos de tempo de repórter fluorescência de células únicas usando matrizes micropatteradas. O protocolo descreve a preparação de matrizes unicelulares, a configuração e o funcionamento de microscopia de lapso de tempo de varredura de células vivas e uma ferramenta de análise de imagem de código aberto para pré-seleção automatizada, controle visual e rastreamento de cursos de tempo de fluorescência integrados por células por local de adesão.

Imagem de células vivas de matrizes unicelulares (LISCA) - uma técnica versátil para quantificar cinética celular

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Aprenda a medir secreções proteicas de células individuais com alta resolução temporal e espacial usando nanossensores plasmônicos de ouro. Este método sem marcadores permite mapear dinâmicas de secreção celular em tempo real.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

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