Name: Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a estudar regeneração funcional de conexões intraspinais em culturas organotípicas de medula espinhal usando arrays multi-eletrodo. Este método permite avaliar a regeneração neuronal em ambiente controlado.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional Suíça (n° 3100AO-120327 e 31003A_140754/1)

Cuidados com os animais foi de acordo com as directrizes aprovadas pelas autoridades locais suíços (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, Nrs aprovação. 52/11 e 35/14). Essas diretrizes estão de acordo com a directiva comunitária 2010/63 / UE. Nota: Trabalho em uma capela de fluxo laminar com instrumentos e soluções estéreis para todas as etapas 1 - 5, incluindo sub-etapas. 1. Preparação de acordos ambientais multilaterais Nota: AAM são compostas de um substrato de vidro, eletrodos pré-fabricadas das micro do metal e uma camada de isolamento de polímeros SU-8 (ver também Tscherter et al. 3). Para o propósito deste estudo, AAM disponíveis comercialmente foram encomendados com um esquema de conjunto de eléctrodos personalizado (Figura 1 A e B). Os eléctrodos 68 estão dispostas numa grelha rectangular que é dividida em duas zonas por uma ranhura 300 um de largura livre de eléctrodos, electrleads iCal e isolamento. Cada um dos eléctrodos é de 40 x 40 um em tamanho e estão espaçados por 200 um de centro a centro. Quatro grandes eléctrodos de terra estão posicionados em torno do local de gravação. Eles diferem de outros acordos ambientais multilaterais padrão disponíveis comercialmente em seu tamanho (21 milímetros x 21 mm) e eles não têm câmara de gravação fixo. <ol><li> Para a desinfecção de enxaguamento AAM em 100% de etanol (2x), etanol a 70% (1x) e água destilada (2x) durante pelo menos 30 seg cada. Deixe secar. Colocar 10 - 12 AAM numa placa de Petri de vidro limpo (150 mm x 25 mm) e feche a tampa. </li><li> AAM autoclave durante 20 min a 120 ° C. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Preparar a solução de revestimento (ver lista de materiais) para os acordos ambientais multilaterais e armazenar alíquotas a -20 ° C. </li><li> Colocar cada MEA numa placa de Petri estéril indivíduo (35 mm x 10 mm). </li><li> Usar uma pipeta para colocar arrefecida 150 ul de solução de revestimento refrigerada no topo dos eléctrodos e fechar a tampa do prato de petri. Após cerca de 10 min, verificar se há bolhas de ar no topo doos eletrodos e removê-los delicadamente com uma espátula de borracha coberta, se necessário. Deixe repouso durante 1 h à TA. </li><li> Aspirar resíduos de solução de revestimento, lavagem 1x com meio otimizado para pré-natal e neurônios embrionários e 2x com água destilada e estéril. Se AMA não são usadas até o dia seguinte, mantê-los em água destilada, água estéril a 37 ° C na incubadora de O / N. Caso contrário, deixa directamente seco à TA. </li></ol> 2. Os ingredientes necessários para a preparação e Crescimento de culturas organotípicas <ol><li> Preparar a solução de lavagem sem cálcio (ver lista de materiais). </li><li> Reconstituir plasma frango em solução de lavagem (1: 1, agite, evitar a formação de bolhas), centrifugar a 3000 xg durante cerca de 20 minutos e decantar o conteúdo claro em um tubo estéril. Alíquota de 200 ul em criotubos e armazenar a -20 ° C. </li><li> Reconstituir trombina a partir de plasma bovina em conformidade (200 U / mL) e esterilizado por filtração (filtro de 0,2 um de poro). Alíquota de 200 ul em crytotubes e armazenar a -20 ° C. </li><li> Por 30 culturas preparar 100 ml de meio nutriente (ver lista de materiais). </li></ol> 3. Spinal Cord Tissue Dissection Nota: o rendimento Processo, de acordo com o número de embriões, fatias de medula espinal durante cerca de 25 - 35 co-cultura, é preparado dentro de uma câmara de fluxo laminar em condições estéreis. <ol><li> Aplicar uma dose letal de pentobarbital (0.4 ml) a mãe do animal por injecção intramuscular. Confirme anestesia profunda, verificando o reflexo de retirada do pedal. Entregar embriões de ratos E14 por cesariana e sacrifício por decapitação. </li><li> Transferir os corpos dos embriões numa placa de petri cheia com, refrigerada, a solução de lavagem estéril. </li><li> Realizar um corte transversal completo com um bisturi acima dos membros posteriores e outro acima dos membros anteriores e remover os membros do corpo. Em seguida, faça um corte no plano frontal para separar as vísceras da peça de volta contendo o co espinhalrd. </li><li> Para cortar, transferir as peças de volta contendo a medula espinal um de cada vez sobre um disco de montagem e cortada a uma espessura de 225 - 250 fim com um cortador de tecido. Colocar uma gota da solução de lavagem sobre o tecido picado e transferir as fatias com uma espátula em 35 mm x 10 mm com placas de petri cheias, refrigerada, a solução de lavagem estéril. </li><li> Para cada fatia separadamente, dissecar medula espinhal longe do restante tecido. Deixe gânglio da raiz dorsal anexado. </li><li> Deixe as fatias descansar durante 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 4. Montagem da Coluna Vertebral fatias de tecido Cord sobre acordos ambientais multilaterais <ol><li> Aqueça meio nutriente estéril na incubadora (37 ° C, levemente tampa para a oxigenação desatarraxou). </li><li> Posição MEA com pinças estéreis com dicas cobertas de borracha em temperatura ambiente na placa de Petri sob um microscópio estéreo com o conjunto de eletrodos em foco. Centralize uma gota 6 mL de plasma de frango no conjunto de eletrodos limpo, livre de poeira, e estéril. Usando uma pequena espátula, cuidadosamente deslizeduas secções da espinal medula com lados ventral frente para o outro dentro da gota de plasma. Não toque os eletrodos com a espátula. </li><li> Adicionar 8 mL de trombina em torno da gotícula de plasma de galinha. Usando a ponta trombina pipeta, cuidadosamente misturar e espalhar a mistura de frango plasma / trombina em torno das duas fatias. Mais uma vez, não toque no conjunto de eletrodos diretamente frágil. Pouco antes de coagulação, aspirar o excesso de frango plasma / trombina. </li><li> Tapar o prato de petri para reter humidade elevada, enquanto o conjunto do MEA / cultura senta-se durante cerca de 1 h numa câmara humidif içada no interior da incubadora a 37 ° C. </li><li> Adicionar cuidadosamente 10 ml de meio nutriente para a câmara de cultura, tampar a placa de Petri e colocar de volta na incubadora por cerca de 30 min. </li><li> Coloque cada conjunto MEA / cultura com, dicas cobertas de borracha estéreis em um tubo de rolo, adicionar 3 ml de meio nutritivo e bem perto da tampa. Colocar o tubo de enrolamento no tambor de rolos que roda a 1 - 2 rpm na incubadora em 5% de CO <sub&gt; 2 -containing atmosfera a 37 ° C. </li><li> Mudar metade do meio nutriente depois de 7 dias in vitro (DIV) e, depois, 1 - 2 vezes por semana. </li></ol> 5. As lesões mecânicas <ol><li> Leve o conjunto MEA / cultura com, dicas cobertas de borracha estéreis para fora do tubo de rolo e coloque em um prato de petri sem meio nutriente sob um microscópio estéreo com o tecido em foco. Visualmente verificar que as duas fatias são fundidos. </li><li> Segure o MEA / cultura montagem estável, colocando uma pinça com pontas cobertas de borracha na MEA. </li><li> Coloque uma lâmina de bisturi na ranhura do MEA perto das fatias de tecido. Segurar o bisturi em vez horizontalmente. </li><li> Levante o bisturi lidar com até mas deixe a lâmina de bisturi ficar na ranhura da MEA, de tal forma que a lâmina &quot;rola&quot; da base à ponta e reduz, assim, através do tecido que cobre a ranhura. </li><li> Graves quaisquer ligações de tecido residual com uma agulha de 25 G ponta se necessary. Trabalhar somente na área dentro do sulco e não toque nas bordas do concurso. </li><li> Coloque o conjunto da MEA / cultura de volta para dentro do tubo de rolo. Fornecer 3 mL de meio nutriente fresco para as culturas e colocá-los de volta para dentro do tambor de rolos na incubadora. </li></ol> 6. As gravações eletrofisiológicas da atividade espontânea <ol><li> Para investigar a regeneração funcional entre as duas fatias de medula espinhal após o número escolhido de DIV, monte o conjunto MEA / cultura em uma câmara de gravação em um microscópio e aplicar cerca de 500 solução extracelular ul (ver lista de materiais). </li><li> Esperar 10 min antes da primeira gravação para permitir que o sistema se estabilize. </li><li> Grave 2x atividade espontânea básicos para cerca de 10 min de cada eletrodo do MEA a RT-detectar atividade. </li><li> Para garantir condições estáveis ​​extracelulares, trocar solução extracelular após cada sessão de gravação. </li><li> Para desinibir a rede, aplique a solução de co extracelularntaining estricnina (1 uM) e gabazine (10 uM). Aguarde pelo menos 2 minutos antes de iniciar a gravação. </li></ol> Análise 7. Dados Nota: Para a detecção dos potenciais de acção extracelularmente gravados para cada eléctrodo usar um detector baseado no desvio padrão e um discriminador subsequente. Este procedimento é descrito em detalhe em Tscherter et al. 3. <ol><li> Mostrar a actividade neuronal detectada de cada eléctrodo num lote raster de acordo com procedimentos padrão 3 (Figura 1F). </li><li> Determinar e exibir a actividade da rede total para cada fatia através da soma do número de eventos nos canais de acordo dentro de uma janela deslizante de 10 mseg, deslocada em passos mseg (Figura 1G 1 e ver Tscherter et al. 3). </li><li> Detectar em cada fatia rajadas individuais (clusters de actividade que aparecem em vários eletrodos). Portanto, Definir um limite mínimo de atividade pico na atividade de rede total correspondente e definir cada início e fim estourar estourar. Por exemplo, um limite adequado é de 25% da amplitude média de ruptura e um início de ruptura pode ser definido por ser o primeiro evento numa janela de tempo de pelo menos 5 mseg, uma extremidade de explosão, sendo o último caso de uma janela de tempo de pelo menos 25 ms (ver Heidemann et al. 10). </li><li> Para quantificar a regeneração funcional calcular a porcentagem de explosões sincronizadas entre as duas fatias. Para fazer isto, calcule a latência entre uma explosão numa fatia e a seguinte explosão na outra fatia. Nota: Um par de ruptura é denominado &quot;sincronizado&quot;, quando a latência é menor do que o comprimento de ruptura médio. Especialmente em co-culturas com uma grande quantidade de actividade, existe a possibilidade de ambos os lados coincidentemente iniciar uma explosão na janela latência escolhido. Este facto deve ser tido em conta na quantificação da percentagem de SYrajadas nchronized. Para uma descrição pormenorizada dos cálculos ver Heidemann et ai. 10. </li></ol> 8. Fixação das Culturas e imunohistoquímica <ol><li> Para todas as etapas que incluem a lavagem ou incubação certifique-se de colocar as culturas em uma mesa basculante para garantir a difusão adequada da solução através do tecido. </li><li> Imediatamente após a sessão de gravação for concluído tomar a montagem MEA / cultura para fora da instalação, colocá-lo em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) e adicionar cerca de 2 ml de solução extracelular. </li><li> Para separar as fatias a partir de células que rodeiam as camadas que se formaram durante o tempo in vitro, ter uma ponta de pipeta 10 ul e circundar as fatias. Preste atenção para não danificar as culturas. É possível omitir este passo, mas incorporando mais tarde é mais fácil quando esta é realizada. </li><li> Use uma agulha de seringa não metálica fina (ver lista de materiais), em combinação com uma seringa de 1 ml preenchido com soluti extracelularsobre a soprar delicadamente a cultura fora do MEA. </li><li> Remover a ponta de uma pipeta de Pasteur e encaixar o bolbo de borracha na extremidade lascas. Utilizar a extremidade traseira para transferir a cultura em fixador (paraformaldeído a 4% com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,1 M)). Não use o padrão ponta da pipeta Pasteur para a transferência, porque é muito pequeno e as culturas seriam dobradas e provavelmente danificado. Fix durante 1 - 2 h a 4 ° C. Lavar o MEA com água destilada e remover os resíduos de tecido com os dedos, mas não arranhar com a unha. Loja AAM em água destilada a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as culturas 3x em PBS durante pelo menos 10 min cada. Armazenar em PBS a 4 ° C ou começar directamente com o processo de coloração. </li><li> Incubam-se as culturas durante pelo menos 90 minutos em solução de (5% de soro de cabra, 1% de albumina de soro bovino, 0,3% de detergente em PBS) de bloqueio. </li><li> Adicione o primeiro anticorpo diluído em solução de bloqueio e incubar durante 3 noites a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x em PBS durante pelo lleste 30 min cada. </li><li> Adicionar o segundo anticorpo diluído em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x em PBS durante pelo menos 30 minutos cada. </li><li> Transfira as fatias com uma pipeta Pasteur com ponta removido em um objeto slide. Retire o excesso de PBS e incorporar com meio de montagem. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Vários elementos do processo apresentados são fundamentais para a realização de experimentos precisos e reprodutíveis. Todos os passos durante a preparação das soluções e meas, a produção das culturas de fatias são realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os antibióticos não são aplicados ao meio nutriente, pois podem afectar a actividade espontânea 14. Durante o revestimento MEA, a parte mais importante é certificar-se que a solução de gel matriz extracelular permanece frio em todos os momentos. Descongele na geladeira e mantê-lo em gelo durante todo o procedimento para garantir uma temperatura máxima próxima de 0 ° C. Durante a preparação do fatias rápido isolamento e corte, bem como prestar atenção a uma baixa temperatura, utilizando gelo buffers dissecção fria aumenta a porcentagem de culturas saudáveis. Além disso, o / trombina coagulação do plasma é um dos passos mais críticos. Primeiro, certifique-se de que o plasma é adequadamente mixed com a trombina. Em segundo lugar, prestar especial atenção à remoção de resíduos tanto quanto possível para assegurar a fixação adequada das fatias para os acordos ambientais multilaterais. Este passo é extremamente sensível ao tempo; Se o intervalo de tempo for demasiado curto, o excesso da mistura de plasma / trombina é removido. Se o intervalo de tempo for demasiado longo, já ocorreu coagulação, aumentando o risco de a remoção das fatias, juntamente com o resíduo de plasma / trombina. Se as lesões mecânicas são planejadas, é importante a utilização de acordos ambientais multilaterais, com um planeamento cuidadoso. A área onde a lesão se destina precisa estar livre de eletrodos, fios e isolamento. Caso contrário, o sistema eléctrico do MEA vão ser danificado e, portanto, não há gravações pode mais ser executada. Um outro passo crucial diz respeito ao tamanho da lesão. Foi demonstrado anteriormente que a reconexão duas pequenas fatias após lesão leva cerca de dois dias a 10. Para todos os experimentos, a regra de ouro foi usado que o espaço betwebr as fatias após lesão não deve ser maior do que a largura da ranhura de MEA (300 uM). Um tamanho maior lesão pode resultar em um prazo mais longo para a reconexão ou, se a lesão é muito grande, não reconexão em tudo. Para anotar, ex experiências revelaram que uma colocação inicial das duas fatias mais longe do que 1 mm resultados em uma taxa de ligação muito reduzida. Antes do início da gravação, um tempo de ajuste de pelo menos 10 min à temperatura ambiente, em vez de 37 ° C da incubadora, e à solução extracelular, em vez do meio de nutrição é recomendado. Fechar observação do padrão de atividade durante esses minutos iniciais garante que os dados medidos representam o padrão estouro da cultura de forma adequada após a gravação foi iniciada. Para a detecção da actividade, aquisição de dados e posterior processamento, hardware caseiro (câmara de gravação, ligações para os amplificadores e amplificadores), programas em laboratórioVIEW, C ++ e IgorPro são usados. Setups MEA comerciais e outros pacotes de software são adequados, bem como para estas operações. Aqui, os sinais observados pelos eléctrodos são amplificados de 1001 vezes e, em seguida digitalizou a uma taxa de 6 kHz. O modelo apresentado pode ser uma ferramenta útil para examinar as conexões propriospinal porque in vivo, eles são difíceis de estudar sem a interferência do ascendente e descendente feixes de fibras. O co-cultura das duas fatias de medula espinhal pode elegantemente contornar este problema. As culturas proporcionar um microambiente que pode ser rigorosamente controlado e manipulado facilmente. Por outro lado, a entrada sensorial e supraespinal é falta de curso. Além disso, o processo da preparação de cultura representa uma situação de lesão do SNC. As células da glia como microglia e astrócitos são conhecidos por responder à lesão com o aumento da proliferação e, portanto, o tecido é, em certa medida reorganizado. Relativa ao modo apresentadol a formação de uma cicatriz glial após a realização de lesões mecânicas não foi observado. Uma explicação pode ser que os mecanismos adaptativos de astrócitos já foram desencadeadas durante o processo de preparação e que as lesões das culturas não resultou em uma resposta ainda mais. Além disso, não há evidências para o envolvimento de inibidores associados mielina, por exemplo., Nogo-A, em baixo potencial de regeneração de culturas lesionados em idade avançada. No entanto, foi demonstrado que o tratamento com o inibidor da fosfodiesterase 4 Rolipram, começando imediatamente após a realização de lesões em 23 DIV aumenta a regeneração funcional entre as fatias 10. Estes resultados demonstram que a recuperação funcional pode ser aumentado em culturas velhas. Visivelmente, quando a contagem do número de axônios que cruzam o local da lesão, não houve diferença entre as culturas lesionados em uma idade jovem e culturas lesionados em uma idade avançada foi descoberto. Estes resultados sugerem que a falta de regeneração axonal não é a razão principal fou a perda de recuperação após lesões tardias na cultura e, portanto, enfatizam a necessidade de um modelo que permite a análise funcional da regeneração. Formação sináptica e plasticidade sináptica poderia desempenhar um papel importante no processo de recuperação 10. Estes mecanismos ganhou muita atenção nos últimos anos e é hoje amplamente aceito que eles têm um grande impacto sobre o resultado após a lesão medular. Portanto, um modelo que proporciona condições estáveis ​​para a investigação dos processos em isolamento e em grande detalhe pode certamente ajudar a obter uma visão sobre a regeneração funcional na medula espinhal.

Culturas organotípicas de fatias do sistema nervoso central (SNC) tem sido amplamente utilizado para estudar vários fenómenos fisiológicos e patológicos que vão desde o desenvolvimento neuronal a neurodegeneração. Em comparação com culturas de células dissociadas, fatias organotípicas oferecem a vantagem de uma maior complexidade com um citoarquitetura intacta e circuitos sináptica local. Ao mesmo tempo, o tecido pode ser analisada de uma maneira isolada, sem a necessidade de comprometer a complexidade do conjunto no contexto in vivo. Além disso, o acesso fácil e repetido para as células de escolha é justificada, o ambiente extracelular pode ser controlada com precisão e, geralmente, em modelos in vitro são menos onerosos do que os seus homólogos in vivo. Nos últimos anos, vários estudos apresentados semelhanças notáveis ​​entre os perfis de desenvolvimento de culturas de longo prazo contra os animais que vivem correspondente 1,2. Demonstrou-se que os circuitos neuronais do CNS vários Regions expressar atividade de rede espontânea durante o desenvolvimento e que fatias organotípicas manter parcialmente este fenómeno 3 -7. Isolado preparações da medula espinal têm sido especialmente usados ​​para investigar geração ritmo 6 e a formação de circuitos neuronais 1. Uma maneira de gravar a atividade espontânea de fatias organotípicas é a cultura deles em cima de arrays multi-eletrodo (AMA). Estes dispositivos contêm múltiplos eletrodos que podem monitorar os potenciais extracelulares geradas por potenciais de ação de numerosas células simultaneamente (gravação multi-unidade). A alta resolução temporal das gravações MEA pode ser usado para reconstruir a dinâmica atividade precisa dentro de um dado circuito neuronal. Além disso, em contraste com o remendo de fixação da técnica é não-invasiva, que permite medições de longo prazo e que resulta no fato de que os neurónios não são afectados no seu comportamento. Fou o propósito deste estudo, a combinação de organotípicas espinal medula co-culturas e gravações multisite foi utilizado para investigar a regeneração funcional no interior da medula espinal. Desde adultos vertebrados superiores têm potencial para recuperar de danos da espinal medula limitado, diferentes estratégias têm sido estudados para promover a regeneração após a lesão da medula espinal. Até agora, o trato corticoespinhal geralmente tem sido o sistema de modelo de escolha para tais investigações. Estas experiências são geralmente demorado, caro e exige grandes grupos de animais, devido à alta variabilidade dentro dos grupos individuais. Além disso, as evidências sugerem que as conexões propriospinal (neurônios que são totalmente confinados dentro da medula espinhal) pode desempenhar um papel fundamental no processo de recuperação após lesões da medula espinhal 8. Estas fibras são difíceis de estudar in vivo sem a interferência de ascendentes e descendentes tratos de fibras. Bonnici Kapfhammer e 9 utilizada medula espinhal longitudinalculturas fatia de ratos pós-natais como uma abordagem alternativa. Após a realização de lesões mecânicas eles analisaram semi-quantitativamente a regeneração morfológica de axônios entre segmentos da medula espinhal. Eles observaram menos, mas não nenhum axônios que cruzam o local da lesão em culturas cortadas em uma idade madura. Em contraste, as culturas que foram lesionados numa fase mais jovem exibido uma elevada quantidade de regeneração axonal 5 - 7 dias após o dano. No entanto, a prova para conexões funcionais não foi apresentada. Por conseguinte, o desenvolvimento de um modelo in vitro representativo de fibras propriospinal que permite a investigação de regeneração funcional pode ser uma ferramenta valiosa para estender o nosso conhecimento sobre os processos de regeneração da medula espinhal.

<table><tbody><tr><td>Matriz de multieletrodos planar</td><td>Qwane Biosciences</td><td></td><td>feito sob medida de acordo com o design do nosso laboratório</td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> nutriente <td>Para 100 ml</td></tr><tr><td>Dulbeccos modificado Meio de águia Gibco</td><td></td><td>31966-021</td><td>80 ml</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>10 ml</td></tr> de <tr><td>água</td><td></td><td></td> destilada, estéril <td>10 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Fator de crescimento nervoso-7S [5 ng/ml]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0513</td><td>200 &micro; l</td></tr><tr><td colspan="4">reconstituído em solução de lavagem com solução</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de revestimento</td></tr> BSA a 1% <tr><td>Gel de matriz extracelular</td><td>BD Biosciences</td><td>356230</td><td>Deve permanecer frio o tempo todo; diluir 1:50 com meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários</td></tr><tr><td>meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td> <td>de lavagem</td><td>[mg/L]</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>60</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>8.000</td></tr><tr><td>Na2HPO4 anidro</td><td></td><td></td><td>48</td></tr><tr><td>D-Glicose (Dextrose)</td><td></td><td></td><td>1.000</td></tr><tr><td colspan="4">De acordo com o protocolo http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td></tr><tr><td>Solução extracelular (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>[mM]</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>4</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>Glicose</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td><td></td>de Bloqueio</tr><tr><td>Detergente: Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0,3%, prejudicial se engolido</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Soro de cabra</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>5%</td></tr> <tr><td>Plasma de frango</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2366</td><td>liofilizado, reconstituir com solução de lavagem</td></tr><tr><td>Gabazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SR-95531</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de mecamilamina</td><td>Tocris</td><td>2843</td><td>tóxico por ingestão</td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td></td><td></td><td>prejudicial, 4%</td></tr> <tr><td>SMI-31</td><td>Covance</td><td>SMI-31P</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32</td><td>Covance</td><td>SMI-32R-500</td><td></td></tr><tr><td>Estricnina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>trombina tóxica</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>1123740001</td><td>irritante, sensibilizante, reconstituir com solução</td></tr> <tr><td>de lavagemTubo plano de cultura de tecidos 10 (= tubo de rolo)</td><td>Techno Plastic Products AG</td><td>91243</td><td></td></tr></tbody></table>

investigando regeneração funcional em organotï¿½icas medula espinhal co-culturas cultivadas em arrays multi-eletrodo

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Os vertebrados superiores adultos têm um potencial limitado de recuperação de lesões na medula espinhal. Recentemente, surgiram evidências de que as conexões proprioespinhais são um alvo promissor para intervenção para melhorar a regeneração funcional. Até o momento, não existe nenhum modelo in vitro que conceda a possibilidade de examinar a recuperação funcional das fibras proprioespinhais. Portanto, foi desenvolvido um modelo representativo baseado em duas seções organotípicas da medula espinhal de ratos embrionários, cultivadas uma ao lado da outra em matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs). Essas fatias crescem e, em poucos dias in vitro, se fundem ao longo dos lados voltados um para o outro. O desenho dos MEAs utilizados permite a realização de lesões com lâmina de bisturi através deste local de fusão sem infligir danos aos MEAs. As fatias mostram atividade espontânea, geralmente organizada em rajadas de atividade de rede, e parâmetros de atividade espacial e temporal, como a localização das origens das rajadas, velocidade e direção de sua propagação e latências entre as rajadas podem ser caracterizados. Usando esses recursos, também é possível avaliar a conexão funcional das fatias calculando a quantidade de rajadas sincronizadas entre os dois lados. Além disso, os cortes podem ser analisados morfologicamente por meio da realização de colorações imuno-histoquímicas após os registros. 
Várias vantagens das técnicas utilizadas são combinadas neste modelo: as fatias preservam em grande parte a arquitetura original do tecido com circuitos sinápticos locais intactos, o tecido é fácil e repetidamente acessível e a atividade neuronal pode ser detectada simultaneamente e de forma não invasiva em um grande número de pontos em alta resolução temporal. Essas características permitem a investigação da regeneração funcional das conexões intraespinhais isoladamente in vitro de forma sofisticada e eficiente.

Para investigar o potencial para a recuperação funcional dos co-culturas derivadas da espinal medula de embriões de rato E14, lesões foram realizados em uma janela de tempo de 8-28 DIV. 2 a 3 semanas mais tarde, a atividade neuronal espontânea foi gravado com os acordos ambientais multilaterais (Figura 1 C &amp; D). Os potenciais de ação extracelular registrados foram identificados off-line para cada eletrodo indivíduo (Figura 1E). A partir destes dados foram gerados lotes de varredura (Figura 1F), seguido por parcelas de actividade de rede para visualizar a actividade total separadamente de cada lado (Figura 1G). Em cada fatia da atividade espontânea é normalmente organizado em rajadas. Se as fatias estão funcionalmente ligados, estes rajadas pode propagar de uma fatia para o outro. Portanto, a quantidade de rajadas sincronizados entre as duas fatias foi calculada para medir quantitativamente a regeneração funcional. Para uma descrição detalhada de como a transformação into as diferentes parcelas é realizado e como a fórmula para calcular a porcentagem de atividade sincronizada foi derivado, consulte Heidemann et al. 10. Em todas as experiências, a actividade foi registado em primeiro lugar sob as condições padrão. Num segundo passo, a inibição sináptica foi bloqueada por adição de estricnina (1 uM) e gabazine (10 uM) à solução de banho extracelular. Isto conduz geralmente a desinibição de um padrão de actividade mais regular com rajadas e prolongados intervalos de explosão, o que facilita a definição de rajadas e, assim, a determinação de rajada de sincronização entre as fatias. Culturas lesionados numa idade jovem (7 - 9 DIV) exibido uma elevada quantidade de actividade sincronizado 2-3 semanas após a lesão lesionado ao passo que as culturas nos estádios mais tardios (&gt; 19 DIV) mostraram uma nítida redução na capacidade de regenerar (Figura 2 A - F). Estes resultados indicam que a capacidade de regeneraçãode conexões funcionais da coluna vertebral em culturas fatia cordão diminui a partir de um nível elevado, representando o estado embrionário in vivo, a um nível baixo, o que representa o estado mais desenvolvido in vivo, no prazo de três semanas em cultura. Que tipos de conexões estão realmente envolvidos na sincronização estourou entre as duas fatias? Além conexões propriospinal, as fibras também pode surgir a partir de neurónios motores ou dorsal neurônios do gânglio da raiz. Foi demonstrado anteriormente que os neurónios do gânglio da raiz dorsal não são relevantes para a ligação funcional entre a medula espinal 10 fatias. No entanto, o envolvimento dos neurónios motores permaneceu uma possibilidade. Desde motoneurons são conhecidos para formar conexões colinérgicos para neurônios da medula espinhal através de receptores nicotínicos 13, a atividade da medula espinhal co-culturas foi gravado em 8 DIV, num momento em que as culturas mostram altamente atividade 10 sincronizado, e o antagonista nicotínico Mecamilamina (MEC, 100 pM) foi adicionada à solução do banho extracelular. A participação de motoneurónios na conexão entre as duas fatias iria resultar numa diminuição da percentagem de actividade sincronizado. No entanto, este não era o caso (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; controle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p&gt; 0,05, teste pareado de Wilcoxon). Estes resultados sugerem que as sinapses colinérgicas não contribuem para a ligação funcional entre fatias. No entanto, uma vez que os motoneurónios também foram exibidas para libertar glutamato nas sinapses no sistema nervoso central 11, 15, estas experiências não excluir totalmente o seu envolvimento. Para identificar motoneurons colorações de imuno-histoquímica contra a neurofilament não fosforilada H com SMI-32 foram realizadas. Eles revelaram vários corpos rotulados grandes celulares típicos para motoneurons, distribuídos ao longo do fatias (Figura 3A). O anticorpo SMI-32 tem sido relatado para rotular os corpos celulares de motoneurons 12 e esta constatação também vale para as culturas utilizadas 13. Além disso, colorações de corpos celulares neuronais em geral, por exemplo, contra o b-III-tubulina ou NeuN, bem como corpos celulares gliais, por exemplo., Astrócitos com anticorpo GFAP estão em linha com outros relatórios e combinar as descrições morfológicas desses tipos de células ( Figura 3 B - D). No entanto, a rotulagem dos axônios com o anticorpo SMI-32 é relativa (Figura 3E). Contra as expectativas, uma enorme rede de fibras aparece quando usando este anticorpo e parece semelhante à coloração SMI-31 que rotula fosforilada neurofilament H (Figura 3F). Uma interpretação desse resultado poderia ser que a regulação do desenvolvimento de neurofilament fosforilação / desfosforilação não é tão apertado nas culturas utilizadas em relação à situação in vivo. Uma ocorrência mista de neurofilamentos fosforiladas e não fosforiladas-no mesmo axónio pode explain este achado. Outra possibilidade é que os SMI-32 axónios marcados surgir a partir de neurónios de projecção. Tsang e seus colegas demonstraram que 16 por exemplo, colunas e colunas de células intermediolateral neurônios de Clark estão manchadas pela SMI-32 além de neurónios motores. Proliferação de neurites pronunciado desses neurônios também poderia explicar a abundância de SMI-32 fibras positivos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Figura 1. Visualização e análise da atividade espontânea. (A) Diagrama de um MEA. Os eletrodos de platina coberto são retratados em preto, os fios transparentes em vermelho e do sulco no meio do MEA em amarelo. (B) Close-up do conjunto de eléctrodos localizados no centro da MEA. Os diagramas são gentilmente cedido pelo Dr. M. Heuschkel. Imagem de campo brilhante de um velho cultur 8 DIV (C)e. As fatias foram cultivadas e fundida ao longo dos lados voltados um para o outro. A barra amarela representa o sulco electrode- e sem isolamento do MEA. Barra de escala = 400 mm (D) Timeline de experimentos. Duas fatias de medula espinhal de embriões de ratos E14 são colocados ao lado do outro em acordos ambientais multilaterais. Dentro de poucos dias, as fatias de crescer e se fundem ao longo dos lados voltados um para o outro. Em um prazo de 8-28 DIV, lesões completas são realizadas através do site de fusão. Duas a três semanas mais tarde, a actividade espontânea é registada e as culturas são fixadas por colorações imuno-histoquímica. (E) vestígios atividade espontânea de cada eletrodo individual de uma cultura de 23 DIV idade. Para visualização mais clara, única a cada segundo traço é ilustrada. Traços de laranja retratam atividade que foi gravada a partir da fatia no lado direito, traços azuis do lado esquerdo. A maioria das @ bursts @ são sincronizados entre os dois. A seta aponta para uma explosão que ocorrem na fatia deixou que só partially propagadas para a fatia direita. A actividade na fatia direita no entanto não atinja o limiar escolhido de pelo menos 25% do pico de actividade máxima média de acordo com o lado e, por conseguinte, não é detectada como uma explosão. Ampliações à direita retratam o último par explosão sincronizado. (F) Raster gráfico da actividade mostrada em (E). (G) lote de atividade de rede com rajadas definidos (barras abaixo da linha de base) da atividade mostrada em (E). Adaptado de Heidemann et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Figura 2. Sincronizado ou Atividade não sincronizado. (A, B) parcelas Raster de culturas Lesioned em idade jovem (a 7 - 9 DIV), que mostra a actividade sincronizados sob condições padrão (A) e sob desinibição (B). (C, D) parcelas raster de culturas lesionados em idade avançada (a&gt; 19 DIV), que apresentam uma actividade não sincronizado, sob condições padrão (C) e sob desinibição (D). (E, F) Percentagem média de actividade sincronizado representada para cada lesão individual dia registada sob condições padrão (E) e sob desinibição (F). As gravações foram tomadas 2 - 3 semanas após o dia da lesão. Adaptado de Heidemann et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização imuno-histoquímica. (A) Coloração de corpos celulares motoneurônio com SMI-32. (B) tubulina rotulagem de corpos celulares neuronais maduros e os seus processos de β-III. (C) Identificação de astrócitos com GFAP. (D) Rotulagem de corpo celular neuronal maduro com NeuN. (E) SMI-32 coloração de não-fosforilada neurofilament H. (F) neurofilament fosforilada H identificado por SMI-31. Adaptado de Heidemann et al. 10. Note-se que com ambos, SMI-31 e SMI-32, uma grande rede de fibras é visível nas culturas. Bares AD = 20 mm, H &amp; F = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a regeneração funcional de conexões intramedulares em culturas co-organotípicas da medula espinhal utilizando matrizes multieletrodo, as chamadas meas. Isso é conseguido cultivando dois cortes transversais da medula espinhal lado a lado sobre meas para simular conexões intramedulares entre diferentes segmentos da medula espinhal. In vitro, os cortes crescem e, dentro de poucos dias in vitro, fundem-se pelas bordas voltadas uma para a outra.Como segundo passo, são realizadas lesões após diferentes intervalos de tempo em cultura, o que leva à completa separação dos fragmentos. Em seguida, as culturas são mantidas no incubador por pelo menos duas semanas.Para dar tempo às redes espinais de regenerarem, a atividade de disparo entre as duas fatias mostra que culturas lesadas em idade precoce apresentam um alto potencial de regeneração funcional, enquanto essa capacidade é claramente reduzida em culturas lesadas em idades mais avançadas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como fatias, culturas em membranas, culturas dissociadas ou em BSAs, é que a combinação de culturas típicas de Ergon com matrizes multieletrodo permite avaliar aspectos funcionais da regeneração no microambiente da medula espinhal com acesso experimental direto. Para começar, fabrique ou adquira matrizes multieletrodo pré-fabricadas, como a mostrada aqui, esterilize as matrizes multieletrodo enxaguando-as por 30 segundos, duas vezes em etanol 100%, uma vez em etanol 70% e, em seguida, duas vezes em água destilada. Após secas, coloque de 10 a 12 matrizes em uma placa de Petri de vidro e feche a tampa depois de autoclavar as matrizes por 20 minutos a 120 graus Celsius.Coloque cada matriz de microeletrodos em uma placa de Petri estéril separada de 35 milímetros. Retire uma pipeta resfriada do congelador. Utilize-a para adicionar 150 microlitros de solução de revestimento de matriz extracelular gelada sobre o eletrodo.Feche a tampa da placa de Petri e incube o arranjo por uma hora em temperatura ambiente. Após cerca de 10 minutos, verifique a presença de bolhas de ar na parte superior dos eletrodos e remova-as suavemente com uma espátula revestida de borracha. Se necessário, verifique o desaparecimento de todas as bolhas.Em seguida, aspire a solução de revestimento. Lave o substrato com meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários e, depois, enxágue duas vezes com água destilada e estéril. Após a lavagem, deixe repousar à temperatura ambiente até secar.Imediatamente após a extração da mãe, transfira os embriões de rato E14 decapitados para uma placa de Petri contendo solução estéril e fria de lavagem. Realize um corte transversal completo com um bisturi acima das patas traseiras e outro acima dos quatro membros, removendo os membros do corpo. Em seguida, faça um corte no plano frontal para separar as vísceras da porção dorsal contendo a medula espinhal.Em seguida, transfira as fatias dorsais contendo a medula espinhal, uma de cada vez, para um disco de montagem. Corte a medula com uma espessura de 225 a 250 micrômetros utilizando um cortador de tecidos. Em seguida, coloque uma gota de solução de lavagem sobre o tecido cortado e transfira as fatias para placas de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros preenchidas com solução de lavagem estéril e resfriada.Disseque a medula espinhal de qualquer tecido remanescente em cada fatia, tomando cuidado para manter os gânglios das raízes dorsais presos. Transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo solução de lavagem estéril e refrigerada.Em seguida, deixe as fatias repousarem por uma hora a quatro graus Celsius. Coloque uma placa de Petri com um arranjo de microeletrodos revestido no interior sob um microscópio estereoscópico. Foque o arranjo e centralize-o.Uma gota de seis microlitros de plasma de frango sobre a matriz de eletrodos. Usando uma espátula pequena, deslize cuidadosamente dois cortes da medula espinhal com suas faces ventrais voltadas uma para a outra dentro da gota de plasma de frango. Em seguida, adicione oito microlitros de trombina ao redor da gota de plasma de frango.Em seguida, use a ponteira da pipeta para misturar e espalhar cuidadosamente a mistura de frango, plasma e trombina. Pouco antes de a mistura de plasma de frango e trombina ficar muito fibrosa e começar a coagular, aspire o excesso de líquido, tampe a placa de Petri e coloque-a em uma câmara umidificada. Coloque a câmara dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius por cerca de uma hora. Após a incubação, adicione cuidadosamente 10 microlitros de meio nutriente à amostra.Tampe a placa de Petri e coloque-a novamente no incubador por mais 45 minutos. Em seguida, coloque cada um dos conjuntos de cultivo com matriz de eletrodos múltiplos em um tubo rotativo e adicione três mililitros de meio nutritivo. Feche bem a tampa e coloque o tubo rotativo no tambor rotativo.Gire o tambor a uma ou duas RPM no incubador a 37 graus Celsius usando pinças com ponta de borracha estéril. Remova os conjuntos de cultura de matriz multieletrodo do tubo rotativo e coloque-os em uma placa de Petri sob um microscópio estereoscópico. Foque o tecido e verifique se as duas fatias estão fundidas.Em seguida, mantenha o conjunto estável e posicione uma lâmina de bisturi no sulco do arranjo de múltiplos eletrodos. Próximo às fatias de tecido. Segure o bisturi de forma mais horizontal e, então, levante a empunhadura do bisturi para cima.Mas mantenha a lâmina do bisturi no sulco da matriz de modo que a lâmina gire da base até a ponta, cortando o tecido e percorrendo o sulco. Seccione quaisquer conexões residuais de tecido com a ponta de uma agulha de 25 gauge, se necessário, trabalhando apenas na área dentro do sulco e sem tocar as bordas delicadas. Coloque os conjuntos de cultivo da matriz multieletrodo de volta no tubo rotativo e adicione três mililitros de meio nutritivo fresco às culturas.Em seguida, coloque o tubo rolete de volta no tambor rotativo no incubador a 37 graus Celsius. Monte um conjunto de cultura com matriz de múltiplos eletrodos em uma câmara de gravação e aplique cerca de 500 microlitros de solução extracelular sobre a matriz. Em seguida, monte o conjunto no microscópio.Aguarde 10 minutos para que o sistema se estabilize e, em seguida, registre a atividade espontânea básica de cada um dos eletrodos detectores de atividade durante 10 minutos. Repita os registros um total de duas vezes para garantir condições extracelulares estáveis. Troque a solução extracelular após cada sessão de registro, se desejado.Desiniba a rede aplicando uma solução extracelular contendo um micromolar de strict nine e 10 micromolares de gazin, e aguarde pelo menos dois minutos antes de registrar a atividade elétrica para investigar o potencial de recuperação funcional das culturas co derivadas da medula espinhal de embriões de rato E14. As lesões foram realizadas em uma janela temporal de oito a 28 dias in vitro. Duas a três semanas depois, a atividade neuronal espontânea foi registrada.Utilizando a matriz de múltiplos eletrodos, os dados brutos são então transformados em gráficos de raster, seguidos por gráficos de atividade em rede para visualizar a atividade total separadamente por lado em cada fatia. A atividade espontânea geralmente é organizada em rajadas, mostradas aqui em fatias sob desinibição, que foram separadas em uma idade jovem e aparecem aqui como funcionalmente conectadas. No entanto, aquelas separadas em uma idade mais avançada aparecem assíncronas.Com base nessas informações, a quantidade de rajadas sincronizadas entre fatias em diversas idades pode ser determinada e visualizada conforme mostrado aqui, seguindo este procedimento. Outros métodos, como coloração imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais tipos celulares contribuem para a conexão funcional entre as duas fatias quartas da medula espinhal.

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Este vídeo demonstra o processo de isolamento de explantes de gânglios espirais do ouvido interno e co-cultura com o órgão de Corti em uma matriz de multieletrodos. Os gânglios espirais são cuidadosamente extraídos e seccionados em seções de tecido menores ou explantes. Esses explantes são cultivados na área ativa da matriz de multieletrodos para promover o crescimento do processo neuronal.

Cultura de explantes de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de multieletrodos

O vídeo demonstra a regeneração funcional das conexões proprioespinhais usando um ensaio baseado em matriz de múltiplos eletrodos (MEA). As fatias da medula espinhal são colocadas no MEA e podem se fundir. As fatias fundidas são separadas mecanicamente criando uma lesão, induzindo os neurônios proprioespinhais a crescer sobre a lesão e conectar as fatias. A atividade elétrica das fatias é avaliada para identificar a regeneração das conexões funcionais.

Estudando a regeneração de conexões funcionais entre fatias da medula espinhal usando um arranjo de múltiplos eletrodos

Este vídeo apresenta gravações eletrofisiológicas de co-culturas organotípicas de fatias da medula espinhal, capturadas usando uma matriz de múltiplos eletrodos ou dispositivo MEA. Essas gravações avaliam a regeneração neuronal entre as fatias. A atividade elétrica sincronizada observada confirma a regeneração neural bem-sucedida.

Registros eletrofisiológicos para avaliação de regenerações neuronais em fatias de medula espinhal co-cultivadas

Este vídeo demonstra o procedimento de uso da matriz de multieletrodos (MEA) para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D. Este método permite entender a dinâmica da rede neural e a atividade de explosão da rede sináptica dentro das esferas 3D.

Utilizando matrizes de multieletrodos para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

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Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Neste artigo, fornecemos um método reprodutível para gerar e manter fatias organotípicas da medula espinhal de longo prazo transplantadas com células-tronco neurais como um modelo ex vivo para testar terapias de reposição celular.

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Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a estudar regeneração funcional de conexões intraspinais em culturas organotípicas de medula espinhal usando arrays multi-eletrodo. Este método permite avaliar a regeneração neuronal em ambiente controlado.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

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