Investigando regeneração funcional em organot�icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a regeneração funcional das conexões intraespinhais em coculturas organotípicas da medula espinhal usando matrizes de múltiplos eletrodos, as chamadas medidas. Isso é conseguido cultivando duas fatias transversais da medula espinhal uma ao lado da outra em medidas para imitar as conexões intraespinhais entre diferentes segmentos da medula espinhal. In vitro as fatias crescem e dentro de alguns dias in vitro se fundem ao longo dos lados voltados um para o outro.

Como um segundo passo. As lesões são realizadas após diferentes períodos de tempo na cultura, o que leva a uma separação completa das fatias. Em seguida, as culturas são deixadas na incubadora por pelo menos duas semanas.

A fim de dar tempo às redes espinhais para se regenerar, a explosão de atividade entre os dois cortes mostra que as culturas lesionadas em idade precoce apresentam um alto potencial de regeneração funcional, enquanto essa capacidade é claramente reduzida em culturas lesionadas em idades posteriores. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como fatias, cultivadas em membranas, culturas dissociadas ou em BSAs, é que a combinação de culturas típicas Ergon com feixes de múltiplos eletrodos nos permite avaliar aspectos funcionais da regeneração no microambiente da medula espinhal com acesso experimental direto Para começar a fabricar ou comprar feixes de múltiplos eletrodos pré-fabricados como o mostrado aqui, Esterilize as matrizes de eletrodos múltiplos, enxaguando-as por 30 segundos, duas vezes em etanol 100%, uma vez em etanol 70% e depois duas vezes em água destilada. Depois de seco, coloque de 10 a 12 matrizes em uma placa de Petri de vidro e feche a tampa depois de autoclavar as matrizes por 20 minutos a 120 graus Celsius.

Coloque cada matriz de eletrodos múltiplos em uma placa de Petri estéril separada de 35 milímetros. Retire uma pipeta resfriada do freezer. Use-o para colocar 150 microlitros de solução de revestimento de matriz extracelular resfriada no topo do eletrodo.

Feche a tampa da placa de Petri e incube a matriz por uma hora em temperatura ambiente. Após cerca de 10 minutos, verifique se há bolhas de ar na parte superior dos eletrodos e remova-os suavemente com uma espátula coberta de borracha. Se necessário, verifique o desaparecimento de todas as bolhas.

Em seguida, aspire a solução de revestimento. Lave o apagamento com meio, otimizado para neurônios pré-natais e embrionários, e depois enxágue-os duas vezes com água destilada estéril. Depois de enxaguados, deixe-os descansar em temperatura ambiente até secar.

Imediatamente após a extração da mãe, transferir os embriões de ratos E 14 decapitados para uma placa de Petri cheia de solução de lavagem gelada estéril. Realizar um corte transversal completo com bisturi acima dos membros posteriores e outro acima dos quatro membros, e retirar os membros do corpo. Em seguida, faça um corte no plano frontal para separar as vísceras da peça posterior que contém a medula espinhal.

Em seguida, transfira as peças traseiras contendo a medula espinhal, uma de cada vez, para um disco de montagem. Corte o cordão com uma espessura de 225 a 250 mícrons usando um picador de tecido. Em seguida, coloque uma gota de solução de lavagem no tecido picado e transfira as fatias para placas de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros cheias de solução de lavagem gelada estéril.

Disseque a medula espinhal de qualquer tecido remanescente em cada uma das fatias. Tomando cuidado para deixar os gânglios da raiz dorsal presos. Transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros cheia de solução de lavagem gelada estéril.

Em seguida, deixe as fatias descansarem por uma hora a quatro graus Celsius. Coloque uma placa de Petri com um conjunto de microeletrodos revestidos sob um microscópio estéreo. Traga a matriz para o foco e o centro.

Uma gota de seis microlitros de plasma de galinha no conjunto de eletrodos. Usando uma pequena espátula, deslize cuidadosamente duas seções da medula espinhal com o tamanho ventral voltado um para o outro na gotícula de plasma. Em seguida, oito microlitros de trombina ao redor da gota de plasma de frango.

Em seguida, use a ponta da pipeta para misturar e espalhar cuidadosamente a mistura de frango, plasma e trombina. Pouco antes de a mistura de plasma e trombina de frango ficar muito fibrosa e começar a coagular, aspire o excesso de líquido, tampe a placa de Petri e coloque-a em uma câmara umidificada. Coloque a câmara dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius por cerca de uma hora Após a incubação, adicione cuidadosamente 10 microlitros de meio nutriente à amostra.

Tampe a placa de Petri e coloque-a de volta na incubadora por mais 45 minutos. Em seguida, coloque cada um dos conjuntos de cultura de matriz de eletrodos múltiplos em um tubo de rolo e adicione três mililitros de meio nutriente. Feche bem a tampa e coloque o tubo do rolo no tambor do rolo.

Gire o tambor em um a dois RRP M na incubadora a 37 graus Celsius usando uma pinça de ponta de borracha estéril. Remova os conjuntos de cultura de matriz de eletrodos múltiplos do tubo de rolo e coloque-os em uma placa de Petri sob um microscópio estéreo. Colocar o tecido em foco e verificar se as duas fatias estão fundidas.

Em seguida, segure o conjunto com firmeza e coloque uma lâmina de bisturi na ranhura do conjunto de eletrodos múltiplos. Perto das fatias de tecido. Segure o bisturi na horizontal e, em seguida, levante o cabo do bisturi.

Mas deixe a lâmina do bisturi ficar na ranhura da matriz de forma que a lâmina role da base à ponta cortando o tecido, cobrindo a ranhura. Corte quaisquer conexões de tecido residual com uma ponta de agulha de calibre 25, se necessário, trabalhe apenas na área dentro da ranhura e não toque nas bordas sensíveis. Coloque os conjuntos de cultura de matriz de eletrodos múltiplos de volta no tubo do rolo e adicione três mililitros de meio nutriente fresco às culturas.

Em seguida, coloque o tubo do rolo de volta no tambor do rolo na incubadora a 37 graus Celsius. Monte um conjunto de cultura de matriz de vários eletrodos em uma câmara de gravação e aplique cerca de 500 microlitros de solução extracelular na matriz. Em seguida, monte o conjunto no microscópio.

Aguarde 10 minutos para que o sistema se estabilize e, em seguida, registre a atividade espontânea básica de cada um dos eletrodos de detecção de atividade por 10 minutos. Repita as gravações um total de duas vezes para garantir condições extracelulares estáveis. Troque a solução extracelular após cada sessão de gravação, se desejar.

Desinibir a rede aplicando solução extracelular contendo um micromolar de nove estrito e 10 micromolar de gazina e aguardar pelo menos dois minutos antes de registrar a atividade elétrica para investigar o potencial de recuperação funcional das coculturas derivadas da medula espinhal de embriões de ratos E 14. As lesões foram realizadas em uma janela de tempo de oito a 28 dias in vitro. Duas a três semanas depois, a atividade neuronal espontânea foi registrada.

Usando a matriz de vários eletrodos, os dados brutos são então transformados em gráficos raster, seguidos por gráficos de atividade de rede para visualizar a atividade total separadamente por lado em cada fatia. A atividade espontânea é geralmente organizada em rajadas mostradas aqui sob fatias de desinibição que foram separadas em uma idade jovem aparecem aqui como funcionalmente conectadas. No entanto, aqueles separados em uma idade mais avançada parecem assíncronos.

Usando essas informações, a quantidade de rajadas sincronizadas entre fatias em várias idades pode ser determinada e visualizada conforme mostrado aqui Seguindo este procedimento. Outros métodos, como coloração imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais tipos de células contribuem para a conexão funcional entre as duas fatias de litro espinhal.