No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

O objetivo geral deste procedimento é determinar o efeito antiviral de compostos em teste contra etapas específicas da entrada viral inicial. Isso é realizado primeiramente semeando as células hospedeiras para a infecção viral. O segundo passo consiste em realizar a infecção viral e os tratamentos com os compostos em teste em diferentes momentos e temperaturas.

Em seguida, os inóculos tratados com o fármaco são removidos por lavagem e as células são recobertas com meio basal. O passo final é incubar as células. Por fim, a infectividade viral é analisada para determinar a influência dos compostos em teste nas etapas iniciais de entrada viral durante a infecção viral.

Por exemplo, um luminômetro é usado para avaliar a atividade de luciferase na amostra celular obtida após infecção por um vírus repórter. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode permitir uma abordagem mais baseada em mecanismos na identificação de agentes antivirais, particularmente aqueles que atuam na entrada viral. Para começar, primeiro prepare soluções estoque dos compostos em teste, ácido triterpênico ou CHLA e colágeno punicicínico ou PUG, em DMSO, e dissolva heparina em água estéril duplamente destilada para usar como controle positivo, além de preparar as células hospedeiras para o cultivo do ensaio.

Células de carcinoma hepático humano, HUH 7.5, cultivadas durante a noite em DMEM fresco suplementado com FBS e antibióticos. Lembre-se de seguir os procedimentos de nível biosseguro dois durante todo o experimento para testar a citotoxicidade dos compostos em análise. Trate as células com concentrações crescentes de CHLA ou PUG, de zero a 500 micromolar, diluídos em meio basal, ou com 1% de DMSO como controle negativo, e então incube as células por 72 horas a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura celular.

Remova o meio e lave as células duas vezes com 200 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 100 microlitros do reagente do ensaio XT T e incube a 37 graus Celsius por três horas. Depois, use um leitor de microplacas para determinar a absorbância em 492 nanômetros com um comprimento de onda de referência em 690 nanômetros.

Calcule a porcentagem de viabilidade com uma fórmula dada a partir desses valores. Determine as concentrações de citotoxicidade celular 50% para cada composto. Para iniciar o ensaio de inativação viral.

Primeira placa, uma vez 10 à quarta células por poço. Em uma placa de 96 poços, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite para adesão antes da infecção. Preparar partículas do vírus da hepatite C marcadas com o repórter luciferase Gaia ou partículas de VHC conforme referenciado no protocolo do texto.

Em um tubo estéril, misture 100 microlitros de CHLA 100 micromolar ou PUG com 100 microlitros de 10 à quarta unidade formadora de focos ou FFU de HCV para uma mistura controle positivo. HCV com heparina numa concentração final de 1000 microgramas por mililitro.

Incubar a 37 graus Celsius por três horas. Após três horas, diluir a mistura do composto viral 50 vezes com 9,8 mililitros de meio basal à temperatura ambiente. Em seguida, preparar uma nova mistura do composto viral e, imediatamente, diluir essa mistura em meio basal para a amostra de incubação de tempo zero.

Após remover o meio de incubação das células, adicione 100 microlitros da solução diluída do fármaco viral por poço, em triplicata. A solução agora contém 10 elevado à segunda FFU por poço; incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a infecção viral das células. Após a incubação, remova a suspensão viral dos poços e lave suavemente as células com 200 microlitros de PBS duas vezes.

Incube as células em 100 microlitros de meio basal por 72 horas para replicação viral e liberação do repórter luciferase no sobrenadante. Em seguida, colete o sobrenadante dos cultivos e dos tubos de microcentrifugação e centrifugue a 17.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para remover detritos celulares, misture 20 microlitros de cada sobrenadante com 50 microlitros do reagente do ensaio gaussi luciferase e meça a luminiscência da atividade do repórter luciferase em um luminômetro.

De acordo com as instruções do fabricante para o ensaio de adesão viral, adicione uma vez 10 à quarta células por poço em uma placa de 96 poços e incube durante a noite para adesão celular. Na manhã seguinte, resfrie primeiro a placa de 96 poços contendo a monocamada celular a quatro graus Celsius por uma hora.

Prepare as misturas de compostos-teste e vírus em gelo. Por exemplo, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1% DMSO ou soluções de controle positivo de HCV com heparina contendo 10 elevado à segunda FFU de vírus. Para cada tratamento, remova suavemente o meio dos poços de cultura celular por aspiração.

Em seguida, adicione imediatamente 100 microlitros da mistura do composto em teste para o vírus em poços triplicados, tomando cuidado para não elevar a temperatura. Incube a placa em uma geladeira mantida a quatro graus Celsius por três horas. As partículas virais se ligarão à superfície celular a quatro graus Celsius, mas não serão internalizadas.

Em seguida, aspire os sobrenadantes. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS frio. Adicione 100 microlitros de meio basal a cada poço e, então, incube a 37 graus Celsius por 72 horas.

Por fim, para quantificar a liberação do repórter luciferase a partir das células infectadas. Colete o sobrenadante de cada poço da amostra e realize o ensaio de luciferase gaussiana para avaliar a fusão e entrada viral. Resfrie previamente a placa de cultura celular a quatro graus Celsius por uma hora.

Após a incubação de overnight para adesão celular, remova o meio existente dos poços e infecte as células com 10 à segunda F-F-U-H-C-V no gelo. Incube a placa a quatro graus Celsius por três horas. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS frio para remover o vírus não aderido.

Em seguida, sobre gelo, trate as células com os compostos em teste dissolvidos no meio basal ou no meio basal com 1% de DMSO como controle e incube a placa a 37 graus Celsius por três horas. Isso permite a avaliação dos compostos em teste sobre a entrada viral, que ocorre a 37 graus Celsius. Aspire o meio e lave os vírus não internalizados duas vezes com 200 microlitros de tampão citrato ou PBS.

Adicione 100 microlitros de meio basal por poço e incube a 37 graus Celsius por mais 72 horas. Colete o sobrenadante e realize o ensaio de Luciferase Gaussiana conforme demonstrado anteriormente para detectar o repórter de luciferase liberado mostrado Aqui estão os efeitos dos compostos testados sobre o VHC. Na ativação, o vírus foi incubado com os compostos testados por zero ou três horas antes da infecção.

O percentual de inibição da infecção viral é representado graficamente para cada tratamento. O controle negativo com DMSO não mostra inibição. O CHLA exibe alta inibição após o contato, seguindo incubação de zero hora, bem como após a incubação mais longa de três horas.

Resultados adicionais com outro teste. O composto PUG é mostrado aqui, adaptando este delineamento experimental geral, CHLA e PUG demonstraram também inibir a infectividade do citomegalovírus humano ou HCMV em fibroblastos pulmonares embrionários. O efeito de CHLA e PUG na ligação do HCV é mostrado aqui.

Lembre-se de que as células foram incubadas com o vírus na presença ou ausência dos compostos em teste a quatro graus Celsius, e então, após a remoção das células com vírus não ligado, as células foram incubadas a 37 graus Celsius para infecção pelo vírus. As barras sombreadas demonstram o efeito de C-H-L-A-P-U-G ou heparina na entrada do VHC nas células. Observe que, neste caso, a ligação viral foi inicialmente realizada a quatro graus Celsius.

Em seguida, após a remoção do vírus não ligado, as células foram incubadas com os compostos em teste a 37 graus Celsius para entrada viral. De forma semelhante, no caso do HCMV, a infecção de fibroblastos pulmonares embrionários tratados com CHLA ou PUG mostra forte inibição da fixação viral e da entrada viral. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de executar os passos na temperatura indicada, o que influenciará a precisão dos resultados.