No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

O objetivo geral deste procedimento é determinar o efeito antiviral dos compostos de teste em relação a etapas específicas de entrada viral precoce. Isso é feito primeiro semeando as células hospedeiras para a infecção viral. O segundo passo é realizar a infecção viral e os tratamentos compostos de teste em diferentes momentos e temperaturas.

Em seguida, os inóculos tratados com drogas são lavados e as células são revestidas com meio basal. A etapa final é incubar as células. Em última análise, a infectividade viral é analisada para determinar a influência dos compostos de teste nas etapas iniciais de entrada viral da infecção viral.

Por exemplo, um luminômetro é usado para avaliar a atividade da luciferase no snat celular da infecção por um vírus repórter. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode permitir uma abordagem mais baseada em mecanismos na identificação de agentes antivirais, particularmente aqueles direcionados à entrada viral. Para começar, primeiro, prepare soluções de estoque dos compostos de teste, ácido trilogia ou CHLA e colágeno púnico ou PUG em DMSO dissolver a heparina para um controle positivo em água dupla destilada estéril para preparar as células hospedeiras para a cultura do ensaio.

Carcinoma hepato humano, células HUH 7,5 durante a noite em DMAM fresco suplementado com FBS e antibióticos. Lembre-se de seguir os procedimentos de nível de biossegurança dois ao longo do experimento para testar a citotoxicidade dos compostos de teste. Trate as células com concentrações crescentes de CHLA ou PUG de zero a 500 micromolares diluídos em meio basal, ou 1% de DMSO como controle negativo e, em seguida, incube as células por 72 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células.

Remova o meio e lave as células com 200 microlitros de PBS duas vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros de reagente de ensaio XT T e incube a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, use um leitor de microplacas para determinar a absorbância em 492 nanômetros com um comprimento de onda de referência em 690 nanômetros.

Calcule a porcentagem de viabilidade com uma determinada fórmula a partir desses valores. Determine as concentrações de citotoxicidade celular de 50% para cada composto. Para iniciar o ensaio de inativação viral.

Primeira placa, uma vezes 10 elevado a quarto células por poço. Em uma placa de 96 poços, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite para fixação de infecção. Prepare o repórter de luciferase Gaia marcado com vírus da hepatite C ou partículas de HCV conforme referenciado no protocolo de texto.

Em um tubo estéril, misture 100 microlitros de CHLA ou PUG 100 micromolar com 100 microlitros de 10 elevado ao quarto. Unidades formadoras de foco ou FFU de HCV para uma mistura de controle positivo. HCV com heparina na concentração final de 1000 microgramas por mililitro.

Incube a 37 graus Celsius por três horas. Após três horas, dilua a mistura do composto do vírus 50 vezes com 9,8 mililitros de meio basal em temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma nova mistura de compostos virais e dilua imediatamente essa mistura em meio basal para a amostra de incubação de zero hora.

Depois de remover o meio de incubação das células, adicione 100 microlitros da solução diluída do medicamento viral por poço em triplicata. A solução agora contém 10 para a segunda FFU por poço incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a infecção viral das células. Após a incubação, remova a suspensão viral dos poços e lave suavemente as células com 200 microlitros de PBS. Duas vezes.

Incubar as células em 100 microlitros de meio basal por 72 horas para replicação viral e liberação de luciferase repórter no sobrenadante. Em seguida, colete o supernat das culturas e microtubos e centrifugue a 17.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para remover detritos celulares, misture 20 microlitros de cada supernat com 50 microlitros de reagente de ensaio de luciferase gaussi e meça a luminescência da atividade repórter de luciferase em um luminômetro.

De acordo com as instruções do fabricante para a placa de ensaio de fixação viral, uma vezes 10 elevado a quarto células por poço. Em uma placa de 96 poços e incubar durante a noite para fixação da célula na manhã seguinte. Primeiro frio, a placa de 96 poços contendo a monocamada celular a quatro graus Celsius por uma hora.

Preparar os compostos de ensaio e a mistura de vírus no gelo. Por exemplo, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1% DMSO ou soluções de heparina HCV de controle positivo com 10 elevado ao segundo vírus FFU. Para cada tratamento, aspire bem o meio dos poços de cultura de células suavemente.

Em seguida, adicione imediatamente 100 microlitros da mistura de compostos de teste de vírus em poços triplicados, tomando cuidado para não aumentar a temperatura. Incube a placa em uma geladeira mantida a quatro graus Celsius por três horas. As partículas de vírus se ligam ao serviço celular a quatro graus Celsius, mas não são internalizadas.

Em seguida, aspire os sobrenadantes. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de gelo frio. A PBS adiciona 100 microlitros de meio basal a cada poço e, em seguida, incuba a 37 graus Celsius por 72 horas.

Finalmente, para quantificar a liberação repórter de luciferase das células infectadas. Colete o supernat de cada poço de amostra e realize o ensaio de luciferase gaussiana para testar a fusão e entrada viral. Pré-resfrie a placa de cultura de células a quatro graus Celsius por uma hora.

Após a incubação noturna para fixação celular, remova o meio existente dos poços e infecte as células com 10 elevado ao segundo F-F-U-H-C-V no gelo. Incube a placa a quatro graus Celsius por três horas. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS gelado para remover o vírus não aderido ao anúncio.

Em seguida, no gelo, trate as células com os compostos de teste dissolvidos em meio basal ou meio basal com 1% de DMSO como controle e incube a placa a 37 graus Celsius por três horas. Isso permite a avaliação dos compostos de teste na entrada viral, que ocorre a 37 graus Celsius. Aspire o meio e lave os vírus não internalizados duas vezes com 200 microlitros de tampão citrato ou PBS.

Adicione 100 microlitros de meio basal por poço e incube a 37 graus Celsius por mais 72 horas. Colete o supernat e execute o ensaio de luciferase gaussiana conforme demonstrado anteriormente para detectar o repórter de luciferase liberado mostrado Aqui estão os efeitos dos compostos de teste no HCV. Na ativação, o vírus foi incubado com os compostos de teste por zero ou três horas antes da infecção.

A porcentagem de inibição da infecção viral é plotada para cada tratamento. O DMSO controlado negativo não mostra inibição. O CHLA exibe alta inibição ao contato, após a incubação de zero hora, bem como após a incubação mais longa por três horas.

Resultados adicionais com outro teste. O composto PUG é mostrado aqui, adaptando este desenho experimental geral, CHLA e PUG são mostrados para inibir adicionalmente a infectividade do citomegalovírus humano ou HCMV em fibroblastos pulmonares embrionários. O efeito de CHLA e PUG na fixação do HCV é mostrado aqui.

Lembre-se de que as células foram incubadas com o vírus na presença ou ausência dos compostos de teste a quatro graus Celsius e, em seguida, removendo as células virais não ligadas foram incubadas a 37 graus Celsius para infecção pelo vírus. As barras sombreadas demonstram o efeito do C-H-L-A-P-U-G ou da heparina na entrada do HCV nas células. Observe que, neste caso, a fixação viral foi realizada pela primeira vez a quatro graus Celsius.

Então, após a remoção do vírus não ligado, as células foram incubadas com compostos de teste a 37 graus Celsius para entrada viral. Da mesma forma, no caso do HCMV, o tratamento com infecção de fibroblastos pulmonares embrionários com CHLA ou PUG mostra forte inibição da ligação viral e da entrada viral. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de executar as etapas na temperatura indicada, o que influenciará na precisão dos resultados.