Name: No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a avaliar compostos antivirais contra etapas iniciais da entrada viral usando ensaios de luciferase em células HUH 7.5. Este protocolo permite identificar agentes que inibem a infecção viral de forma mecanística.

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Este estudo é apoiado por financiamento do Hospital da Universidade Médica de Taipei (102TMU-TMUH-19) e do Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Nota: Certifique-se de que todos os procedimentos que envolvem cultura celular e infecção pelo vírus são realizados em capuzes de biossegurança certificados que são apropriadas para o nível de biossegurança das amostras sendo manipulado. Para a finalidade de descrever os protocolos, Gaussia luciferase de VHC marcada com repórter é utilizado como um vírus modelo 32. No contexto dos resultados representativos, o ácido compostos chebulagic (CHL) e punicalagina (PUG) são utilizados como medicamentos antivirais candidatos que têm como alvo as interacções de glicoproteínas virais com os glicosaminoglicanos da superfície celular durante a entrada viral precoce passos 31. A heparina, que é conhecida por interferir com a entrada de muitos vírus 30,31,33,34, é utilizada como um tratamento de controlo positivo, em tal contexto. Para o fundo de base em técnicas de virologia, propagação de vírus, a determinação do título do vírus e a expressão de dose infecciosa em unidades formadoras de placas (PFU), concentrar unidades formadoras de FFU (), ou multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é rerido para fazer referência a 35. Para exemplos anteriores e condições otimizadas utilizados para vírus mostrados nos resultados representativos, o leitor é remetido para referências 30-32,36-39, bem como detalhes listados na Tabela 1, Figura 1A e 2A. 1. Cultura celular, Composto de preparação, e o Composto Citotoxicidade <ol><li> Crescer a linha celular correspondente para o sistema de infecção por vírus a ser analisado (Tabela 1). Para o HCV, crescer as células Huh-7.5 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 200 U / ml de penicilina G, 200 ug / ml de estreptomicina, e 0,5 ug / ml de anfotericina B. </li><li> Preparar os compostos de teste e controlos utilizando os seus respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHL e PUG em sulfóxido de dimetilo (DMSO); preparar heparina em água bidestilada estéril. Para todas as diluições subseqüentes, utilize meios de cultura. Nota: O último concentração de DMSO nos tratamentos composto do teste é inferior a 1% nas experiências; 1% de DMSO é incluído como um tratamento de controlo negativo nos ensaios para comparação. </li><li> Determinar a citotoxicidade dos compostos de teste (por exemplo, Chla PUG) e sobre as células para a infecção virai utilizando uma determinação de viabilidade celular, tais como reagente de XTT (2,3- bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-fenilamino) -carbonil] -2H-tetrazólio): <ol><li> Para o HCV, sementes células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada. </li><li> Aplicar controlo de DMSO (1%) ou concentrações crescentes de compostos de teste a CHL e PUG (ex. 0, 10, 50, 100, e 500 ^ M) aos poços de cultura em triplicado. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 72 h, em seguida, descartar o meio na placa e lavar as células com 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes. </li><li> Adicionar 100 ul de assaying de solução a partir do kit de ensaio de toxicologia in vitro na base de XTT-se a cada poço e incubar as placas a 37 ° C durante mais 3 horas para permitir a produção de formazano XTT. </li><li> Determinar a absorvência com um leitor de microplacas a um comprimento de onda de teste de 492 nm e um comprimento de onda de referência de 690 nm. </li><li> Calcula-se a percentagem de células sobreviventes com a seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = A / Como × 100%, em que &#39;A&#39; e &#39;As&#39; referem-se a absorvância dos compostos de teste e o controlo de solvente (1% de DMSO ex. ) tratamentos, respectivamente. Determinar a concentração de 50% de citotoxicidade celular (CC50) dos compostos de teste a partir de um software de análise, tais como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Leitura de infecção viral Nota: A leitura da infecção virai depende do sistema de vírus utilizado e pode envolver métodos tais como ensaios de placa ou MEAsuring sinais repórter de vírus marcado-repórter. O método para detectar a infecção por HCV-repórter com base na actividade repórter da luciferase é descrito abaixo. <ol><li> Recolhe-se os sobrenadantes dos poços infectados e clarificar a 17000 xg numa microcentrífuga durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Misturar 20 ul de sobrenadante de teste a 50 ul de substrato de luciferase a partir do kit de ensaio de luciferase e Gaussia medir directamente com um luminómetro de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Expresso de infecciosidade de HCV como log 10 de unidades relativas de luz (RLU) para a determinação da inibição virai (%) e calcular a concentração 50% eficaz (CE 50) dos compostos de ensaio contra a infecção pelo HCV usando algoritmos de software GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 3. Inactivação Viral Assay Nota: Os exemplos de período de incubação e a dose virai de vários vírus deestá listada na Figura 1A. Concentrações mais elevadas do vírus também pode ser testado através do aumento da MOI / UFP. <ol><li> Semente células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada. </li><li> Incubar os compostos de teste ou controles (concentrações finais são: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) com as partículas de HCV a 37 ° C (Figura 1A, &quot;a longo prazo&quot; ) em uma proporção de 1: 1. Por exemplo, para um inoculo de vírus de 100 ul contendo 1 x 10 4 FFU, adicionar 100 ul de uma diluição de trabalho 100 uM CHL; este tratamento proporciona CHLA a uma concentração final de 50 uM. </li><li> Dilui-se a mistura de vírus-droga (ineficaz) concentração de &quot;sub-terapêutica&quot; dos compostos de teste. Por exemplo, a concentração da CHL ineficaz e PUG contra o HCV é a 1 uM 31; portantoisto requer uma diluição de 50 vezes da mistura de vírus-droga que pode ser realizada com 9,8 ml de meio basal (meio de cultura de células com 2% de FBS). Nota: A diluição para a concentração sub-terapêutica impede interacção significativa entre os compostos de teste e da superfície da célula o hospedeiro e permite o exame do efeito do tratamento sobre os viriões livres de células. Note-se que esta diluição é dependente da dose resposta antiviral dos compostos de ensaio contra a infecção virai em particular, e é determinada antes de se efectuar este ensaio particular 31. </li><li> Para comparação, o vírus misturar com os compostos de ensaio e imediatamente diluídas (sem período de incubação) a concentração sub-terapêutica antes da infecção (Figura 1A, &quot;Short-Term&quot;). </li><li> Adicionar 100 ul da mistura de HCV-droga diluída para o Huh-7,5 monocamada de células (a quantidade de vírus é agora a 1 x 10 2 FFU; finais MOI = 0,01) e incubar durante 3 horas a 37 ° C para permitir viraladsorção. </li><li> Após a infecção, remover os inóculos diluído e lava-se suavemente os poços com 200 ul de PBS, duas vezes. Nota: Execute as lavagens com cuidado para evitar levantar as células. </li><li> Adicionar 100 ul de meio basal de cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 72 h. </li><li> Analisar a infecção resultante por doseamento do sobrenadante para a actividade de luciferase tal como descrito em &#39;2. Leitura de infecção viral &#39;. </li></ol> 4. Acessório viral Assay Nota: Os exemplos de período de incubação e a dose viral para vários vírus são listados na Figura 2A, &quot;Anexo&quot;. Concentrações mais elevadas do vírus também pode ser testado através do aumento da MOI / UFP. <ol><li> Semente células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada. </li><li> Pré-relaxar as monocamadas de células em placas a 4 ° C FoR 1 h. </li><li> Co-tratar as células com HCV inoculo (MOI = 0,01) e os compostos de teste ou os controlos (concentrações finais são: CHL = 50 | iM; PUG = 50 | iM; heparina = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C durante 3 hr. Por exemplo, para um inoculo de vírus de 90 ul contendo 1 x 10 2 FFU, adicionar 10 ul de uma diluição de trabalho de 500? M CHL; este tratamento proporciona CHLA a uma concentração final de 50 uM e uma infecção por HCV a MOI = 0,01 na monocamada de células. Nota: É importante realizar a experiência a 4 ° C uma vez que permite a ligação do vírus, mas impede a entrada que ocorre mais eficientemente a 37 ° C. Realizar a adição de compostos de vírus e de ensaio em gelo e o que se seguiu incubação num frigorífico a 4 ° C para assegurar que a temperatura é mantida a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar cuidadosamente a monocamada de células com 200 ul de PBS gelado duas vezes. Nota: Execute as lavagens com cuidado para evitar levantar as células &lt;./ li&gt; <li> Adicionar 100 ul de meio basal de cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 72 h. </li><li> Analisar a infecção resultante por doseamento do sobrenadante para a actividade de luciferase tal como descrito em &#39;2. Leitura de infecção viral &#39;. </li></ol> 5. Viral Entrada / ensaio de fusão Nota: Exemplo de períodos de incubação ea dose viral para vários vírus são listados na &#39;Entry / Fusão&#39; Figura 2A. Concentrações mais elevadas do vírus também pode ser testado através do aumento da MOI / UFP. <ol><li> Semente células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada. </li><li> Pré-relaxar as monocamadas de células em placas a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Infectar as células com VHC (MOI = 0,01), a 4 ° C durante 3 h. Por exemplo, usar um inoculo de vírus de 100 ul contendo 1 x 10 2 UFF. Nota: Execute o addição do inoculo virai em gelo e o que se seguiu incubação num frigorífico a 4 ° C para manter a temperatura a 4 ° C, o que permite a entrada de ligação mas não virai. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar suavemente as monocamadas de células com 200 ul de PBS gelado duas vezes. Nota: Execute as lavagens com cuidado para evitar levantar as células. </li><li> Tratar os poços com os compostos de teste ou os controlos (concentrações finais são: CHL = 50 | iM; PUG = 50 | iM; heparina = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) e incuba-se a 37 ° C durante 3 h. Por exemplo, adicionar 10 ul de uma diluição de trabalho 500 mm CHLA para 90 l de mídia, misture, e tratar os poços; este tratamento proporciona CHLA a uma concentração final de 50 uM. Nota: A passagem de 4 ° C a 37 ° C agora facilita o evento de entrada / fusão viral e, portanto, permite a avaliação do efeito de compostos de teste &#39;sobre este passo particular. </li><li> Aspirar o sobrenadante que contém o fármaco e remover não-internalizadovírus extracelulares através de lavagem com 200 ul de tampão citrato (citrato de sódio 50 mM, cloreto de potássio a 4 mM, pH 3,0) ou PBS. Adicionar 100 ul do meio de base antes da incubação a 37 ° C durante 72 h. </li><li> Analisar a infecção resultante por doseamento do sobrenadante para a actividade de luciferase tal como descrito em &#39;2. Leitura de infecção viral &#39;. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não existem interesses conflitantes.

Neste relatório, foram descritos os métodos para identificar e avaliar compostos antivirais com base em uma abordagem mecanicista de dissecar os eventos iniciais de entrada viral. Especificamente, os ensaios nos permitiram examinar o efeito dos compostos de teste em partículas virais livres, ligação viral e entrada/fusão viral. Etapas críticas foram implementadas para avaliar distintamente o efeito do medicamento no estágio específico da entrada viral precoce. Por exemplo, no 'ensaio de inativação viral', a diluição da mistura vírus-medicamento para concentração subterapêutica evita uma interação significativa entre o composto de teste e a superfície da célula hospedeira, 'titulando' o medicamento. Isso garante que o efeito inibitório observado na infecção subsequente da célula hospedeira seja devido a uma interação direta entre o composto de teste e os vírions livres de células, em vez de um efeito do composto de teste na membrana da célula hospedeira ou moléculas associadas à membrana, incluindo receptores virais30. Do mesmo modo, a variação de temperatura entre 4 °C (que permite a ligação mas não a entrada de vírus) e 37 °C (que facilita a entrada/fusão de vírus) no «ensaio de fixação viral» e no «ensaio de entrada/fusão viral» é crucial para determinar o efeito do composto de ensaio em cada um destes acontecimentos específicos. Isso é viável devido à sensibilidade à temperatura dos vírus envelopados durante essas etapas da infecção24-29. Portanto, é importante que os ensaios sejam realizados na temperatura indicada para garantir a precisão dos resultados; por exemplo, realizando o experimento no gelo para manter a 4 °C e colocando a amostra diretamente em uma incubadora de 37 °C para a mudança de temperatura. Além disso, o uso de controles negativos (por exemplo, solvente DMSO para preparação de medicamentos) e positivos (por exemplo, tratamento com heparina) também ajudam a estabelecer ainda mais a precisão dos ensaios. A utilidade e aplicabilidade de tais métodos foram demonstradas em muitos estudos antivirais26,30,31,40,41. Observe que, embora a heparina seja incluída como controle para todos os três ensaios no contexto dos resultados representativos, ela normalmente bloqueia a ligação inicial do vírus em vez da etapa de fusão/entrada subsequente (conforme refletido pelos dados na Figura 2). Controles adicionais também podem ser usados, como anticorpos neutralizantes direcionados contra o vírus (para ensaio de inativação viral), anticorpos que mascaram os receptores de superfície celular para o vírus (para ensaio de ligação viral) e inibidores de fusão de membrana (para ensaio de fusão/entrada viral). 
Os ensaios descritos neste relatório, que são específicos para os estágios iniciais da infecção viral, são úteis em termos de aplicação como testes secundários para caracterizar o mecanismo de ação de medicamentos candidatos a partir de telas primárias que normalmente visam a infecção viral de forma mais ampla. Alternativamente, eles também podem ser incorporados em telas primárias se alguém estiver procurando especificamente por inibidores da entrada viral precoce, incluindo agentes inativadores de vírus, antagonistas de ligação viral e inibidores da entrada/fusão viral. Nesse caso, seu uso permite uma análise de triagem mais focada e precisa para a identificação de candidatos antivirais específicos do mecanismo, o que, por sua vez, aceleraria o desenvolvimento de medicamentos a jusante. 
O uso de ensaios baseados em células na identificação de agentes antivirais oferece várias vantagens importantes em comparação com os ensaios bioquímicos, incluindo a revelação de potenciais efeitos fora do alvo (como citotoxicidade) e a adição de relevância fisiológica à bioatividade dos agentes de teste42. Essas questões são considerações importantes para decidir se um agente candidato é valioso para a continuação nas fases subsequentes do desenvolvimento do medicamento. Da mesma forma, os ensaios iniciais específicos de entrada viral descritos neste relatório permitem examinar o efeito do medicamento no estágio de entrada viral distinto no nível celular e, mais especificamente, no contexto de uma infecção viral autêntica in vitro. Os resultados obtidos a partir de tais ensaios ajudariam, portanto, a prever melhor a eficácia antiviral dos compostos de teste e também a identificar efeitos fora do alvo potencialmente indesejados contra a célula hospedeira. Uma limitação potencial, porém, é que um ensaio baseado em células in vitro pode não refletir completamente a etapa real de entrada in vivo no contexto de uma infecção viral natural. No entanto, os ensaios apresentados neste protocolo servem como uma plataforma analítica para identificação e avaliação baseadas em mecanismos de novos agentes antivirais.
O desenvolvimento de vírus repórteres ou sistemas de células repórteres para quantificar a quantidade de infecção viral facilitou muito a triagem e avaliação de compostos antivirais baseados em células. Exemplos incluem o uso de vírus recombinantes portadores de um gene repórter ou por meio de linhagens celulares humanas recombinantes contendo um gene repórter acionado pelo promotor específicodo vírus 31,43. Neste relatório, a infecção pelo HCV marcado com luciferase pode ser facilmente monitorada quantificando o sinal do repórter, facilitando assim a análise dos dados. Ao incorporar essas ferramentas úteis baseadas em repórteres, os primeiros ensaios de entrada viral descritos aqui podem ser essencialmente adaptados em formato de alto rendimento para triagem baseada em mecanismo de bibliotecas de pequenas moléculas.
Em conclusão, foi descrito um protocolo para ensaios de dissecação da entrada viral precoce como meio de identificar e avaliar compostos antivirais específicos do mecanismo. Esses ensaios seriam úteis para descobrir novos antagonistas/inibidores da entrada viral e ajudar a expandir o escopo dos agentes antivirais para desenvolvimento como tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.

As infecções virais são uma ameaça constante à saúde pública e uma causa significativa de doenças epidêmicas, morbidade e mortes em todo o mundo. Modos específicos de controle contra infecções virais incluem o desenvolvimento de vacinas e terapias antivirais. Embora os esforços de vacinação tenham se mostrado bem-sucedidos na imunização contra vários vírus, muitos patógenos virais permanecem sem uma vacina protetora, incluindo o vírus da dengue (DENV), citomegalovírus humano (HCMV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus sincicial respiratório (VSR)1-5. Os antivirais, por outro lado, desempenham um papel importante no manejo dessas infecções virais quando as vacinas profiláticas não estão disponíveis. No entanto, até o momento, apenas alguns medicamentos antivirais licenciados e econômicos estão disponíveis em comparação com o número de patógenos virais que ameaçam a saúde pública. Mais importante, devido ao aumento das viagens globais e à rápida urbanização, a situação é agravada pelos riscos de surtos epidêmicos de infecções virais emergentes/reemergentes que estão sendo introduzidas em áreas não indígenas6. Surtos recentes causados pelo vírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS), vírus influenza (H1N1, H5N1, H3N2 e H7N9), DENV, vírus do Nilo Ocidental (WNV), vírus do sarampo (MV), vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS) e vírus Ebola6-12 estão entre os exemplos que refletem a necessidade de desenvolvimento de antivirais quando a imunização e/ou terapêutica não estão disponíveis. Além disso, há sempre um risco potencial de gerar infecções resistentes a medicamentos com antivirais usados atualmente. Assim, o desenvolvimento contínuo e a expansão do escopo dos antivirais para essas infecções virais emergentes/reemergentes são necessários para fornecer melhores estratégias de gerenciamento e salvaguardar a saúde pública.
A maioria das terapias antivirais consiste em antivirais de ação direta (DAAs) que têm como alvo uma proteína ou cofator viral específico que medeia etapas importantes no ciclo de vida viral. Por exemplo, o análogo do nucleosídeo Aciclovir inibe a DNA polimerase do herpesvírus, os inibidores da protease Boceprevir e Telaprevir antagonizam o HCV NS3 e o Oseltamivir e o Zanamivir são inibidores da neuraminidase que bloqueiam a liberação de partículas do vírus influenza das células infectadas13-15. No entanto, existem muito poucos inibidores de entrada viral licenciados, incluindo Enfuvirtida, que tem como alvo o HIV gp41 para prevenir a fusão, e Maraviroc, que bloqueia o co-receptor do HIV CCR5, impedindo assim a entrada viral16. A exploração de novos antagonistas/inibidores da entrada viral pode ajudar a fornecer terapêuticas adicionais para uso profilático ou terapêutico, como em combinação com outros antivirais com um mecanismo de ação diferente para melhor gerenciar infecções virais17-19. 
A identificação de antivirais pode envolver o design de medicamentos guiados por estrutura e a estratégia baseada em triagem de medicamentos candidatos. Os métodos para avaliar a atividade antiviral dos agentes de teste incluem ensaios bioquímicos de atividade enzimática e avaliação por sistemas baseados em células20-23. Em sistemas baseados em células, o ciclo de vida viral pode ser dissecado em estágios distintos de infecção, como eventos de entrada (fixação, fusão, desrevestimento), fase de replicação (replicação do genoma viral e tradução de proteínas) e saída do vírion (montagem, maturação e liberação). Uma vez que os ensaios podem ser adaptados para investigar cada estágio específico usando várias ferramentas e métodos, essa abordagem permite a identificação/exame de potenciais antivirais candidatos com um mecanismo de ação específico direcionado ao estágio distinto analisado. Por exemplo, para analisar o efeito do medicamento especificamente nas partículas de vírus livres antes da ligação à célula hospedeira, um 'ensaio de inativação viral' pode ser realizado. Neste ensaio, o vírus pode incubar com o medicamento de teste e, em seguida, diluído para titular o medicamento antes de infectar uma monocamada de célula. Etapas adicionais, como fixação viral e estágios de entrada/fusão, também podem ser analisadas individualmente, mudando a temperatura durante a infecção. Para muitos vírus envelopados, a entrada / fusão viral na membrana da célula hospedeira é muito facilitada a 37 ° C, mas normalmente é excluída a 4 ° C, o que não afeta a ligação ao vírus24-29. Finalmente, o uso de vírus repórteres ou sistemas celulares pode facilitar esses estudos e permitir uma análise de alto rendimento.
Anteriormente, empregamos a abordagem baseada em células e dissecamos a entrada precoce de vários vírus envelopados para o exame de compostos antivirais que potencialmente antagonizam a entrada viral30,31. Aqui, os vários métodos usados, incluindo inativação viral, fixação viral e ensaios de entrada/fusão viral, são descritos.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>B GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de toxicologia in vitro,</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr> <tr><td>baseado em XTTPBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Leitor</td> de microplacas <td>GIBCO 10010023</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Gaussia kit de ensaio de luciferase</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luminômetro</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio, di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

no início virais ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Os sistemas baseados em células são úteis para descobrir agentes antivirais. A dissecação do ciclo de vida viral, particularmente os estágios iniciais de entrada, permite uma abordagem mecanicista para identificar e avaliar agentes antivirais que visam etapas específicas da entrada viral. Neste relato, são descritos os métodos de exame da inativação viral, fixação viral e entrada/fusão viral como ensaios antivirais para tais fins, usando o vírus da hepatite C como modelo. Esses ensaios devem ser úteis para descobrir novos antagonistas/inibidores da entrada viral precoce e ajudar a expandir o escopo de agentes antivirais candidatos para o desenvolvimento de medicamentos.

Na Figura 1, foi realizado o &quot;ensaio de inactivação virai&quot; para examinar se dois compostos específicos e CHLA PUG natural poderia inactivar os vírus com envelope diferentes em estado isento de células e prevenir a infecção subsequente. A citotoxicidade e de resposta à dose antiviral destes compostos foram determinados antes de se efectuar o estudo mecanicista 31. Os vírus foram pré-tratadas com os compostos de teste e, em seguida, as misturas de vírus-drogas foram diluídas para concentrações sub-terapêuticos antes da inoculação para a respectiva monocamada de células para cada sistema vírus. Como mostrado na Figura 1, tanto CHL e PUG apareceu para interagir com os viriões livres de células, resultando em efeitos irreversíveis que a monocamada de células protegidas da infecção subsequente. Os dois compostos de teste alcançou uma inibição quase 100% contra HCMV, HCV e DENV-2, enquanto que um 60 - bloco de 80% foi observada contra MV e RSV. Estes resultados suggest que CHLA e PUG têm impacto direto sobre estas partículas virais livres, desativando-os e neutralizando sua infectividade. Na Figura 2, o anexo e entrada / ensaios de fusão foram realizados para explorar o efeito da CHLA e PUG contra esses eventos relacionados à entrada virais início de HCMV, HCV, DENV-2, MV, e RSV. Ambos CHL e PUG prevenida eficazmente a ligação dos vírus investigados para a respectiva célula hospedeira, como mostrado pela inibição da infecção viral resultante (Figura 2, &#39;anexo&#39;: barras cinzentas claras). O efeito inibitório sobre a fixação do vírus por ambos os compostos foi semelhante contra HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), e RSV (Figura 2F), variando de 90 - 100%. Por outro lado, PUG pareceu ser mais eficaz do que CHLA contra MV ligação (Figura 2E), com a taxa de inibição do TWS compostos que variam entre 50 - 80%. O tratamento de controlo de heparina, que é conhecido por bloquear a entrada de muitos vírus, também inibiu a fixação de HCMV, DENV-2, RSV, anúncio MV, mas foi menos eficaz contra o HCV. O &#39;ensaio de entrada / fusão viral &quot;que se seguiu examinou se CHLA e PUG mantido a sua actividade durante a fase de entrada do vírus / fusão (Figura 2,&#39; Entry / Fusão &#39;: barras cinza escuro). Novamente, tanto CHL e PUG foram observados para prejudicar a eficácia do passo de entrada / fusão viral dos vírus examinados (Figura 2B - F), obtendo-se um 50 - efeito protector de 90% no respectivo monocamada de células. A heparina também inibiu potencialmente entrada / fusão em infecções de RSV e DENV-2, mas foi menos eficaz contra CMVH, VHC, e MV (&lt;40% de inibição, em média). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Vírus </td><td> Tipo celular </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td> Huh-7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Tipo de célula hospedeira por infecção viral O tipo de célula utilizado para cada sistema de infecção virai descrito nos resultados representativos está indicado. Detalhes adicionais referentes as células podem ser encontradas na referência 31. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> Figura 1. A inactivação de infecções virais por o CHLA compostos de teste e PUG vírus diferentes foram tratadas com os compostos de teste durante um longo período. (Incubadas durante 1,5 - 3 horas antes da titulação; barras cinzentas claras) ou curto prazo (imediatamente diluída; cinzento escuro bares) a 37 ° C antes de uma diluição à Concentra sub-terapêuticação e subsequente análise de infecção sobre as células respectivo hospedeiras. (A) Esquema da experiência (mostrada à esquerda) com a concentração de vírus final (PFU / poço ou MOI), período de incubação de vírus-drogas de longo prazo (i), e tempo de incubação posterior (ii) indicada para cada vírus no quadro à direita. Análise para (B) de HCMV, (C) de HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) de RSV são indicados em cada painel adicional. Os resultados são representados graficamente contra o tratamento de DMSO de controlo negativo para a infecção pelo vírus e os dados apresentados são as médias ± erros padrão da média (EPM) de três experiências independentes. Esta figura foi modificado a partir da referência 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> Figura 2. A avaliação das actividades anti-virais dos compostos de teste a CHL e PUG fixação contra vírus e entrada / fusão. (A) O procedimento experimental, a concentração de vírus (pfu / poço ou MOI), e o tempo de adição e o tratamento com os compostos de ensaio (I, II, III) são apresentados para cada virus nos esquemas e as tabelas associadas. Na análise acessório do vírus (barras cinzentas claras), as monocamadas de diferentes tipos de células foram pré-arrefecidas a 4 ° C durante 1 h, em seguida, co-tratadas com os respectivos vírus e os compostos de teste a 4 ° C (1,5 - 3 h; i) antes de lavar os inóculos e compostos de teste para a subsequente incubação (37 ° C, ii) e exame da infecção pelo vírus. Na entrada do vírus / análise de fusão (barras cinza escuro), as monocamadas de células semeadas foram pré-refrigerada a 4 ° C durante 1 hr e depois desafiado com os respectivos vírus a 4 ° C durante 1,5 - 3 h (i). As células foram entãolavados e tratados com os compostos de teste durante um período de incubação adicional (ii) durante o qual a temperatura foi mudada para 37 ° C para facilitar o evento de entrada / fusão viral. No final da incubação, os vírus extracelulares foram removidos por qualquer tampão de citrato (pH 3,0) ou de lavagens com PBS e as células foram incubadas adicionalmente (iii) para a análise da infecção pelo vírus. Os resultados para (B) de HCMV, (C) de HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) de RSV são indicados em cada painel adicional. Os dados são representados graficamente contra o controlo negativo DMSO tratamento da infecção pelo vírus e são apresentados como médias ± SEM de três experiências independentes. Esta figura foi modificado a partir da referência 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo que examina etapas específicas da entrada viral para identificar e avaliar novos agentes antivirais.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o efeito antiviral de compostos em teste contra etapas específicas da entrada viral inicial. Isso é realizado primeiramente semeando as células hospedeiras para a infecção viral. O segundo passo consiste em realizar a infecção viral e os tratamentos com os compostos em teste em diferentes momentos e temperaturas.Em seguida, os inóculos tratados com o fármaco são removidos por lavagem e as células são recobertas com meio basal. O passo final é incubar as células. Por fim, a infectividade viral é analisada para determinar a influência dos compostos em teste nas etapas iniciais de entrada viral durante a infecção viral.Por exemplo, um luminômetro é usado para avaliar a atividade de luciferase na amostra celular obtida após infecção por um vírus repórter. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode permitir uma abordagem mais baseada em mecanismos na identificação de agentes antivirais, particularmente aqueles que atuam na entrada viral. Para começar, primeiro prepare soluções estoque dos compostos em teste, ácido triterpênico ou CHLA e colágeno punicicínico ou PUG, em DMSO, e dissolva heparina em água estéril duplamente destilada para usar como controle positivo, além de preparar as células hospedeiras para o cultivo do ensaio.Células de carcinoma hepático humano, HUH 7.5, cultivadas durante a noite em DMEM fresco suplementado com FBS e antibióticos. Lembre-se de seguir os procedimentos de nível biosseguro dois durante todo o experimento para testar a citotoxicidade dos compostos em análise. Trate as células com concentrações crescentes de CHLA ou PUG, de zero a 500 micromolar, diluídos em meio basal, ou com 1% de DMSO como controle negativo, e então incube as células por 72 horas a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura celular.Remova o meio e lave as células duas vezes com 200 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 100 microlitros do reagente do ensaio XT T e incube a 37 graus Celsius por três horas. Depois, use um leitor de microplacas para determinar a absorbância em 492 nanômetros com um comprimento de onda de referência em 690 nanômetros.Calcule a porcentagem de viabilidade com uma fórmula dada a partir desses valores. Determine as concentrações de citotoxicidade celular 50% para cada composto. Para iniciar o ensaio de inativação viral.Primeira placa, uma vez 10 à quarta células por poço. Em uma placa de 96 poços, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite para adesão antes da infecção. Preparar partículas do vírus da hepatite C marcadas com o repórter luciferase Gaia ou partículas de VHC conforme referenciado no protocolo do texto.Em um tubo estéril, misture 100 microlitros de CHLA 100 micromolar ou PUG com 100 microlitros de 10 à quarta unidade formadora de focos ou FFU de HCV para uma mistura controle positivo. HCV com heparina numa concentração final de 1000 microgramas por mililitro.Incubar a 37 graus Celsius por três horas. Após três horas, diluir a mistura do composto viral 50 vezes com 9,8 mililitros de meio basal à temperatura ambiente. Em seguida, preparar uma nova mistura do composto viral e, imediatamente, diluir essa mistura em meio basal para a amostra de incubação de tempo zero.Após remover o meio de incubação das células, adicione 100 microlitros da solução diluída do fármaco viral por poço, em triplicata. A solução agora contém 10 elevado à segunda FFU por poço; incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a infecção viral das células. Após a incubação, remova a suspensão viral dos poços e lave suavemente as células com 200 microlitros de PBS duas vezes.Incube as células em 100 microlitros de meio basal por 72 horas para replicação viral e liberação do repórter luciferase no sobrenadante. Em seguida, colete o sobrenadante dos cultivos e dos tubos de microcentrifugação e centrifugue a 17.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para remover detritos celulares, misture 20 microlitros de cada sobrenadante com 50 microlitros do reagente do ensaio gaussi luciferase e meça a luminiscência da atividade do repórter luciferase em um luminômetro.De acordo com as instruções do fabricante para o ensaio de adesão viral, adicione uma vez 10 à quarta células por poço em uma placa de 96 poços e incube durante a noite para adesão celular. Na manhã seguinte, resfrie primeiro a placa de 96 poços contendo a monocamada celular a quatro graus Celsius por uma hora.Prepare as misturas de compostos-teste e vírus em gelo. Por exemplo, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1% DMSO ou soluções de controle positivo de HCV com heparina contendo 10 elevado à segunda FFU de vírus. Para cada tratamento, remova suavemente o meio dos poços de cultura celular por aspiração.Em seguida, adicione imediatamente 100 microlitros da mistura do composto em teste para o vírus em poços triplicados, tomando cuidado para não elevar a temperatura. Incube a placa em uma geladeira mantida a quatro graus Celsius por três horas. As partículas virais se ligarão à superfície celular a quatro graus Celsius, mas não serão internalizadas.Em seguida, aspire os sobrenadantes. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS frio. Adicione 100 microlitros de meio basal a cada poço e, então, incube a 37 graus Celsius por 72 horas.Por fim, para quantificar a liberação do repórter luciferase a partir das células infectadas. Colete o sobrenadante de cada poço da amostra e realize o ensaio de luciferase gaussiana para avaliar a fusão e entrada viral. Resfrie previamente a placa de cultura celular a quatro graus Celsius por uma hora.Após a incubação de overnight para adesão celular, remova o meio existente dos poços e infecte as células com 10 à segunda F-F-U-H-C-V no gelo. Incube a placa a quatro graus Celsius por três horas. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS frio para remover o vírus não aderido.Em seguida, sobre gelo, trate as células com os compostos em teste dissolvidos no meio basal ou no meio basal com 1% de DMSO como controle e incube a placa a 37 graus Celsius por três horas. Isso permite a avaliação dos compostos em teste sobre a entrada viral, que ocorre a 37 graus Celsius. Aspire o meio e lave os vírus não internalizados duas vezes com 200 microlitros de tampão citrato ou PBS.Adicione 100 microlitros de meio basal por poço e incube a 37 graus Celsius por mais 72 horas. Colete o sobrenadante e realize o ensaio de Luciferase Gaussiana conforme demonstrado anteriormente para detectar o repórter de luciferase liberado mostrado Aqui estão os efeitos dos compostos testados sobre o VHC. Na ativação, o vírus foi incubado com os compostos testados por zero ou três horas antes da infecção.O percentual de inibição da infecção viral é representado graficamente para cada tratamento. O controle negativo com DMSO não mostra inibição. O CHLA exibe alta inibição após o contato, seguindo incubação de zero hora, bem como após a incubação mais longa de três horas.Resultados adicionais com outro teste. O composto PUG é mostrado aqui, adaptando este delineamento experimental geral, CHLA e PUG demonstraram também inibir a infectividade do citomegalovírus humano ou HCMV em fibroblastos pulmonares embrionários. O efeito de CHLA e PUG na ligação do HCV é mostrado aqui.Lembre-se de que as células foram incubadas com o vírus na presença ou ausência dos compostos em teste a quatro graus Celsius, e então, após a remoção das células com vírus não ligado, as células foram incubadas a 37 graus Celsius para infecção pelo vírus. As barras sombreadas demonstram o efeito de C-H-L-A-P-U-G ou heparina na entrada do VHC nas células. Observe que, neste caso, a ligação viral foi inicialmente realizada a quatro graus Celsius.Em seguida, após a remoção do vírus não ligado, as células foram incubadas com os compostos em teste a 37 graus Celsius para entrada viral. De forma semelhante, no caso do HCMV, a infecção de fibroblastos pulmonares embrionários tratados com CHLA ou PUG mostra forte inibição da fixação viral e da entrada viral. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de executar os passos na temperatura indicada, o que influenciará a precisão dos resultados.

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