Preparação de mitocondriais frações enriquecidas para Análise metabólica em

O objetivo geral do experimento a seguir é obter frações mitocondriais enriquecidas que forneçam quantidade suficiente de metabólitos mitocondriais para estudos de metabolômica utilizando drosophila melanogaster. Isso é alcançado primeiramente criando uma quantidade suficiente de moscas para gerar metabólitos em quantidade adequada para frações enriquecidas de mitocôndrias. Como segundo passo, as moscas são homogeneizadas em um homogeneizador de vidro com pistão de teflon, o qual rompe a membrana celular sem danificar a integridade mitocondrial.

Em seguida, os homogenatos são submetidos à centrifugação diferencial para gerar amostras enriquecidas em mitocôndrias. Os resultados mostram que alterações metabólicas mitocondriais acentuadas foram detectadas usando este protocolo, as quais não foram observadas mediante análise metabolômica baseada inteiramente em frações enriquecidas em mitocôndrias e extratos de animais inteiros. A principal vantagem deste procedimento em comparação com a análise metabolômica de moscas inteiras é que o isolamento de mitocôndrias antes da análise metabolômica permite maior sensibilidade e detecção de alterações nos metabólitos mitocondriais.

Para iniciar o experimento, aqueça os ingredientes da ração de moscas em uma chapa aquecedora a 90 graus Celsius. Misture regularmente até que a mistura fique homogênea e ligeiramente densa. Retire a ração da fonte de aquecimento e mexa ocasionalmente enquanto a ração esfria até 80 graus Celsius, adicionando 0,2% TE decept metil 4-hidroxibenzoato dissolvido em Etanol 95%. Em seguida, divida a ração em dois volumes iguais.

Certifique-se de que a temperatura do alimento tenha diminuído para 50 graus Celsius e adicione, sob agitação, 1,1 mililitro de rapamicina 50 milimolar dissolvida em etanol em um volume e 1,1 mililitro de etanol não tratado no segundo volume. Para coletar os adultos, utilize um regulador de estágio único para fornecer dióxido de carbono puro a partir de um tanque de alta pressão. Com um fluxo contínuo de cinco PS, evito eletricidade estática usando um tubo de plástico para conduzir o dióxido de carbono até um frasco de filtração de 500 mililitros com tubos, para borbulhar o dióxido de carbono através da água.

Para fazer isso, use uma rolha de borracha com um orifício para vedar o frasco. Conecte um tubo plástico à abertura lateral do frasco até um coletor de dióxido de carbono para controlar a densidade larval durante o desenvolvimento. Coloque 25 pares de pais em um frasco de cultura e permita que depositem ovos por 48 horas.

Em seguida, remova os pais para regular a densidade de ovos e repita esses passos utilizando a prole F1 emergente para obter duas gerações desse controle de densidade. Após duas gerações sob condições de densidade controlada, separe as moscas por sexo, colocando-as na placa por não mais de 10 a 15 minutos. Permita que as moscas se recuperem da anestesia por 24 horas antes de colocá-las em condições experimentais.

Designe 300 moscas por amostra para gerar quantidade suficiente de metabólitos para frações enriquecidas em mitocôndrias. Transfira 150 moscas para uma gaiola caseira de um litro. Em seguida, transfira as 150 moscas restantes para outra gaiola de um litro e não sobrepovoe as gaiolas com mais de 150 moscas.

Utilize seis amostras replicadas por condição experimental e coloque as gaiolas a 25 graus Celsius em um ciclo claro-escuro de 12 horas para finalizar a criação de drosófila. Forneça às moscas alimento fresco a cada dois ou três dias em um frasco com cinco mililitros de alimento para manter a qualidade do alimento por um total de 10 dias. Inicie o isolamento despejando as moscas de uma gaiola em um homogeneizador de vidro e teflon com fundo aberto, preenchido com um mililitro de tampão de isolamento gelado.

Em seguida, coloque um pouco de cadinho em gelo para manter as mitocôndrias intactas e homogeneíze as moscas com 15 movimentos. Tendo o cuidado de não girar o pistilo, transfira o homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue o tubo a 300 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um tubo diferente e centrifugue o sobrenadante a 6.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius para enriquecer as mitocôndrias.

Após a centrifugação, descarte o sobrenadante contendo a fração citosólica. Resuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão de lavagem pipetando para cima e para baixo. Repita cuidadosamente os passos anteriores para o segundo girocage.

Em seguida, combine os pellets re-suspendidos de ambas as gaiolas em um tubo de microcentrífuga criogênico e centrifugue os pellets combinados a 6.000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e congele rapidamente o pellet em nitrogênio líquido. Por fim, armazene as frações enriquecidas em mitocôndrias a menos 80 graus Celsius.

Este blot ocidental exibe um enriquecimento da proteína transportadora da membrana mitocondrial poin, que atua como um indicador da separação eficaz de mitocôndrias nas frações mitocondriais. A proteína poin é indetectável nas frações citosólicas, enquanto a proteína tubulina, uma proteína de microtúbulos citosólicos, não é detectada na fração mitocondrial, demonstrando a contaminação mínima por proteínas citosólicas. As análises de componentes principais ou PCA foram geradas utilizando os valores obtidos a partir da análise de espectrometria de massas, que foram normalizados à concentração proteica de Bradford, transformados em log e imputados com valores mínimos observados para cada composto.

Os gráficos de PCA foram gerados utilizando o metaboloma completo. Os perfis de metabolitos de cepas nativas e alteradas de moscas trazem diferentes metabólitos de DNA mitocondrial obtidos com um extrato padrão de mosca inteira que podem ser comparados com um gráfico de PCA de metabolitos em extratos enriquecidos para mitocôndrias; os perfis de metabolitos de mosca inteira se separam ao longo do eixo PC dois e refletem os principais efeitos do tratamento com rapamicina. Existem apenas diferenças sutis entre os genótipos alternativos de M-T-D-N-A.

Em contraste, os perfis de metabólitos provenientes de extratos enriquecidos em mitocôndrias mostram uma separação entre o genótipo nativo de DNA mitocondrial em alimento normal e as outras três amostras: o DNA mitocondrial nativo com rapamicina, e o DNA mitocondrial alternativo em alimento normal ou com rapamicina. Isso implica que o efeito do DNA mitocondrial alternativo altera os perfis de metabólitos de maneira análoga aos efeitos do tratamento com rapamicina. Ao realizar este protocolo, é importante — e recomendado — realizar todas as diluições no mesmo dia, para reduzir a variabilidade entre as réplicas.

Recomendo ter um plano preparado com antecedência e a rotulagem dos tubos, além de manter o controle dos registros de espera entre as réplicas para melhorar a qualidade da nossa preparação de amostras.