Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

O objetivo geral desta técnica de microscopia é visualizar proteínas, interações proteicas em escala de molécula única e nanômetro. Portanto, esse método pode nos ajudar a responder a algumas questões-chave no campo da biologia, como interações moleculares em processos de sinalização oncogênica. A principal vantagem dessa técnica é que ela é sensível, específica e oferece resoluções de molécula única e nanômetros.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Tahan, um pesquisador sênior associado em meu laboratório Após a clonagem de RAs e RAF R-B-D-P-A-M Cherry fragmentos empacotados em partículas virais e infectando células U2 OS de acordo com o protocolo de texto. Para preparar uma amostra para placa de imagem cerca de 5,5 vezes 10 para as células de expressão estáveis quartas por poço de uma câmara de fundo de vidro de oito poços, deslize 350 microlitros de DMEM livre de vermelho de fenol. Use paraldeído fresco com glutaraldeído para fixar as células e depois de substituir o fixador por PBS ou vórtice de buffer de imagem partículas de ouro de 100 nanômetros e adicione 35 microlitros por poço para rastrear o desvio do estágio durante a imagem.

Aproxime-se do microscópio e ligue os lasers de 405 e 561 nanômetros mantendo as persianas fechadas neste ponto, certifique-se de que o espelho dicróico de 561 nanômetros e o filtro de entalhe estejam no lugar. Abra o software de aquisição de imagem. Ligue a câmera EMCD e deixe-a esfriar e defina o tempo de exposição para 100 milissegundos e o ganho EMCD para um valor apropriado.

Adicione óleo de imersão à objetiva e proteja a amostra na idade do estágio do microscópio. Em seguida, com campo claro ou laser de 561 nanômetros, coloque a amostra em foco para imagens de RAs e outras proteínas de membrana. Use uma objetiva de grama cromática APO de 60 x com uma abertura numérica de 1,49 e coloque o microscópio na configuração de grama.

Ajuste o laser de excitação para que fique descentralizado ao atingir a abertura traseira da objetiva de grama, o que fará com que o laser desvie ao atingir o buffer de lamínula na face. Continue ajustando a posição de incidência do laser até que o ângulo crítico seja alcançado e o laser esteja sendo refletido de volta. Procure uma célula para criar uma imagem com várias partículas de ouro à vista.

Em seguida, defina uma região de interesse que envolva a célula ou uma região dela e as partículas de ouro, caso já esteja ocorrendo ativação suficiente devido aos altos níveis de expressão. Comece a aquisição com o laser de 405 nanômetros desligado e o laser 561 ligado. Caso contrário, ligue o laser de 405 nanômetros na configuração de potência de fábrica mais baixa e aumente-o gradualmente até que haja dezenas de moléculas por quadro ou para que as moléculas individuais estejam bem separadas.

À medida que a aquisição de dados continua, aumente gradualmente a potência do laser de 405 nanômetros para manter a densidade do ponto aproximadamente constante. Continue a aquisição de imagens até o máximo 4 0 5. O poder não inicia mais.

Os eventos de ativação terminam para processar imagens. Baixe o software de processamento de imagem. Abra o MATLAB e carregue o software de leitura WFI.

Visualize a sequência de imagens brutas e determine a região de interesse ou ROI, selecione a área da pilha a ser processada clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando uma caixa ao redor da área desejada. Se a região de interesse não foi reduzida durante a aquisição, selecione uma área menor para diminuir o tempo de computação para desmarcar uma área e processar todo o quadro corretamente Clique em qualquer lugar da imagem ao lado para definir um conjunto de marcadores fiduciários, como nanopartículas de ouro absorvidas na lamínula que são bem isoladas, uniformes e de forma e presentes no campo de visão em toda a pilha de imagens. Comece selecionando uma partícula de ouro candidata clicando com o botão esquerdo em sua imagem e arrastando uma pequena caixa ao redor dela.

Em Rastreamento de partículas, clique no botão de rastreamento. Aparecerá um gráfico que mostra a posição da partícula de ouro selecionada na pilha de imagens que descrevem a extensão da deriva. Repita esse processo para rastrear o maior número possível de partículas de ouro e determinar as partículas que rastreiam juntas. Idealmente.

O desvio geral está na magnitude de 0,1 pixel no máximo, um de cada vez. Selecione as partículas de ouro que rastrearam juntas e sob rastreamento de partículas. Clique no botão adicionar marcador.

Uma cruz verde aparecerá significando que a partícula foi adicionada como um marcador e será usada para corrigir o desvio. Ajuste o intervalo sigma, o intervalo de suavização e o limite conforme necessário, alterando ligeiramente o valor. Clique no botão localizar partícula para testar as configurações e inspecionar visualmente as partículas do processo, como a cereja PAM, as moléculas que são relativamente redondas e brilhantes serão encaixotadas e as que não forem serão deixadas de fora.

Para iniciar o processamento das imagens, clique no botão criar arquivo de cabo e salve o arquivo com o nome desejado para pós-processar as imagens e renderizar a imagem da palma da mão. Inicie o pacote palm no MATLAB e carregue o arquivo dot core recém-criado. Uma imagem renderizada do curso aparecerá na caixa de imagem ao lado dos botões de controle.

Classifique as coordenadas individuais usando os seguintes valores típicos. Para PAM Cherry um, combinar quadro é igual a oito. A combinação de distâncias em nanômetros é igual a 100, o mínimo RMS é igual a quatro.

A qualidade mínima de ajuste é igual a 0,25 e a excentricidade máxima é igual a 1,4. Clique no botão de classificação para gerar um novo conjunto de coordenadas selecionadas prontas para renderizar imagens de alta resolução. Insira valores para a renderização adequada da imagem final, como o tamanho do pixel bruto, conforme determinado anteriormente, o tamanho do recurso desejado na imagem renderizada, que normalmente é definido em um valor ligeiramente superior à localização média e o tamanho do pixel, como 10 nanômetros.

Para a imagem renderizada, clique no botão renderizar para gerar a imagem da palma da mão. Em seguida, use os ícones de aumento de mais e menos na barra de ferramentas da janela da figura para aumentar e diminuir o zoom para rastrear moléculas únicas em células vivas. Trate a superfície da cultura de tecidos e coloque as células em placas conforme descrito anteriormente neste vídeo.

Certifique-se de que a lamínula tenha a espessura apropriada para a microscopia configurada após a transecção das células e a realização de quaisquer tratamentos e incubações necessários para o experimento, coloque a placa de cultura em uma incubadora no palco. Deixe o prato assentar no palco por alguns minutos até que a temperatura e a concentração de CO2 se estabilizem nesta etapa. Bloqueie os lasers.

Se o controle de CO2 não estiver disponível, mude para um meio independente de CO2 logo antes de obter imagens, como o L 15 de Leibovitz, para deprimir a fluorescência de fundo, finalmente adquirir imagens conforme demonstrado anteriormente, definindo um tempo de exposição apropriado para garantir uma boa relação sinal-ruído sem perder a resolução de tempo. A palma BFC nesta figura é o mutante KRAS G 12 D interagindo com o domínio de ligação RAs ou RBD de CRAF. Cada uma das quatro combinações mostradas aqui foi introduzida em células U2 OS usando células de infecção lentiviral com duas das configurações tinham fortes sinais BFC positivos, conforme identificado pelo aumento abrupto da fluorescência quando o laser de 405 nanômetros foi ligado devido à fotoativação do PAM Cherry reconstituído por BFC, conforme demonstrado aqui, usando as mesmas configurações experimentais do PAM Cherry pai.

Um forte sinal BFC foi gerado após a infecção com RN R e RAF RBD RC. Aqui, RN e RC denotam o fragmento terminal n e C de PAM Cherry um, respectivamente, quando ampliado em moléculas individuais e sua distribuição espacial em nanoescala pode ser vista claramente neste experimento onde a palma de rastreamento de molécula única foi realizada para adquirir trajetórias de difusão de RAs individuais. Complexos RAF RBD sob iluminação contínua com lasers de 561 nanômetros e 405 nanômetros. Individual PA m cereja uma molécula st.

Ligue e dure alguns quadros antes de entrar em estados escuros, onde eles foram encontrados imóveis ou móveis. Este gráfico de gravações para várias moléculas ilustra claramente os dois tipos de trajetórias. A mesma distribuição heterogênea de estados de difusão pode ser inferida a partir do histograma de deslocamento da molécula entre quadros sucessivos que a massa dominou.

Essa técnica pode ser feita em uma a três semanas, dependendo se as construções são transcendentalmente, transfectadas ou oprimidas de forma estável se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar controles como Putins mutantes que não têm a interação após este procedimento. Outros métodos, como uma análise de agrupamento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: como as interações proteicas são organizadas espacialmente na célula?

Para rastreamento de células de laboratório, base de avaliação, rastreamento de partícula única podem ser realizados para determinar os estados de difusão e as probabilidades de transição após seu desenvolvimento. Esta técnica está sendo usada em nosso laboratório no campo da biologia do câncer para explorar as interações do drive de AR, bem como o homo e a ização de seus receptores familiares em células tumorais humanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e implementar uma biópsia da palma da mão para investigar uma interação proteica de interesse.

Não se esqueça de que trabalhar com antivírus e células tumorais pode ser extremamente perigoso e precauções como os protocolos padrão de biossegurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.