Name: Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a técnica BiFC-PALM para visualizar interações proteína-proteína em células U2OS com resolução nanométrica. Este método sensível e específico permite estudar sinalização oncogênica em biologia celular.

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Os autores agradecem aos Drs. Steven Chu e Joe W. Gray pelas discussões úteis, Henry Marr por seu trabalho inicial no projeto BiFC-PALM e Alexis Shoemaker por sua assistência técnica. Este trabalho é apoiado por fundos iniciais para X.N. da OHSU. A pesquisa no laboratório Nan também foi apoiada pelo NIH 5U54CA143836-05, pela Damon Runyon Cancer Research Foundation, pelo MJ Murdock Charitable Trust e pela empresa FEI.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

BiFC tem sido uma técnica vulgarmente utilizada para a detecção e a visualização de IPP em células, enquanto palma é uma técnica de microscopia recente única molécula SuperResolution que permite imagens em nanoescala de amostras biológicas intactas. A combinação de BiFC com PALM alcançado imagem seletiva de PPIs dentro de uma célula com resolução espacial nanométrica e sensibilidade única molécula. BiFC-PALM estende a utilidade de ambas as técnicas, e como demonstrado neste trabalho, mostra uma grande promessa em revela...

Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a biologia 1 e sejam estritamente regulado através de mecanismos de espaço-temporais em muitas escalas de tempo e comprimento. Estudos sobre a sinalização celular na membrana celular, por exemplo, revelaram, compartimentos espaciais em nanoescala dinâmicos que facilitam PPIs específicas e processos celulares 2. Assim, a capacidade de sondar os IPP em sistemas biológicos com resoluções suficientes espaciais e temporais, alta especificidade e alta sensibilidade é fundamental para alcançar um entendimento mecanicista da biologia. Bimolecular fluorescência complementação (BiFC) é uma das poucas ferramentas existentes para visualizar PPIs em uma cela com resolução subcelular e compatibilidade de células viver 3-5. A técnica é relativamente simples e envolve a divisão de uma proteína de fluorescência em dois fragmentos não fluorescentes; quando geneticamente marcado para duas proteínas interagem etrazida para a proximidade, os fragmentos podem reconstituir, para formar uma proteína fluorescente completa, obtendo-se o sinal fluorescente. Quando projetado corretamente, as sondas BiFC não deve reconstituir espontaneamente na ausência de PPIs. Como tal, o sinal de fluorescência num ensaio de BiFC só surgem, na presença de IPP, o que permite a visualização directa dos IPP com alta especificidade. Os benefícios adicionais da utilização de fluorescência como a leitura são de alta sensibilidade, resolução subcelular, e compatibilidade com alto rendimento e alta ensaios de rastreio de conteúdo, entre outros. Para estes benefícios, foram desenvolvidos um número de sondas diferentes com base em BiFC proteínas fluorescentes pai. Tal como em todas as outras técnicas de detecção baseadas em microscopia óptica convencional, no entanto, a resolução espacial de BiFC é limitada a ~ 250 nm pela difracção da luz. Isto o torna um desafio para estudar a regulação dos IPP em nanoescala, que, como referi anteriormente e exemplificados por jangadas lipídicas 6 and Ras nanoclusters 7, é uma escala de comprimento crítico para a compreensão de muitos processos celulares, tais como sinalização. BiFC foi combinada com microscopia localização fotoactivado (PALM) 8,9 para superar este limite em resolução espacial para a imagem latente PPIs 10. PALM é uma recente técnica de microscopia SuperResolution que contorna o limite de difração em imagens de fluorescência através da ativação estocástica e localização subdiffractive de moléculas fluorescentes individuais. Em cada ciclo de activação, uma molécula fluorescente emite de algumas centenas a alguns milhares de fotões e dá origem a uma única molécula de imagem no detector. Quando a imagem é limitado por difracção (~ 250 nm de largura), a sua centróide pode ser determinada com muito maior precisão, tipicamente na ordem de 10-50 nm, dependendo do número de fotões detectados. Através da activação e localização de cada molécula fluorescente na amostra, imagem de alta resolução pode ser reconstruído. Performed em células vivas, monitoramento molécula única (smt-) PALM novas autorizações de aquisição de milhares de trajetórias de difusão proteína a partir de uma única célula 11. Importante, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados, tais como proteínas fluorescentes fotoactivï¿½eis (PA-FPS) para conseguir a ativação estocástica. Uma vez que tanto BiFC e proteínas fluorescentes uso PALM, eles foram combinados, dividindo PAmCherry1, um comumente usado PA-FP para PALM, em dois fragmentos entre os aminoácidos 159 e 160. O sistema baseado em PAmCherry1 BiFC dividido mostra baixo sinal de fundo a partir de reconstituição espontânea dos dois fragmentos. Quando geneticamente marcado para um par de proteínas que interagem, os dois fragmentos (RN = resíduos 1-159; RC = MET + resíduos 160-236) reconstituído para formar de forma eficiente proteínas PAmCherry1 completa mesmo a 37 ° C e sem incubação a temperaturas mais baixas, o que Não é o caso de outros pares BiFC 12, tais como o pai mCherry 13. Furthermore, a proteína PAmCherry1 reconstituído manteve as propriedades fotofísicas da PAmCherry1 pai, como a alta taxa de contraste, o rendimento médio de fótons, e fotoativação rápido, entre outros, que são críticos para precisas de localização única molécula e de alta resolução de imagem PALM. Neste protocolo, o uso de BiFC-PALM para imagiologia interações Ras-Raf em células U2OS usando divisão PAmCherry1 (Figura 1A) é descrito. O primeiro passo consiste em conceber as construções para expressar proteínas de fusão entre fragmentos PAmCherry1 (isto é, RN e RC) e as proteínas de interesse. Em teoria, para cada par de proteínas candidatas (A e B), existem oito pares de proteínas de fusão a ser testada: RN-A / RC-B; RN-A / B-Rc; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Este processo muitas vezes pode ser simplificada, tendo em conta as propriedades estruturais ou bioquímicas das proteínas candidatas. No caso de Ras, a proteína émodificada após tradução na caixa CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = qualquer), após o que o motivo AAX é clivada. Assim, RN ou RC só pode ser fundido ao N-terminal de Ras; Isto reduz o número de pares de proteínas de fusão para quatro (Figura 1B). Para Raf, domínio de ligação a Ras (RBD; resíduos 51-131) é usado e pode ser marcado em cada extremidade. Esses quatro configurações de fusão foram gerados: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; e RC-Kras / Raf RBD-RN. Além disso, o ligante entre os fragmentos e as proteínas de interesse terão de ser consideradas. Um ligante flexível de cerca de dez aminoácidos é frequentemente utilizado como proporciona liberdade suficiente para complementação de ocorrer. Um tal ligante é (GGGGS) x2, embora existam muitos outros que foram aplicadas com êxito, incluindo seqüências aleatórias geradas a partir de um local de clonagem múltipla (MCS) 14. O comprimento dos elementos de ligação podem precisar de ser optimizada depending do tamanho das proteínas de interesse e que interagem quando as suas orientações. Os fragmentos PAmCherry1 estão contidos em um pequeno backbone clonagem com flanqueando MCSs (ver Lista de Materiais). Os genes de interesse pode ser inserido através dos locais de restrição ou com um método independente da ligadura. Após a clonagem e sequência de verificação, a cassete de expressão é transferido para um vector de expressão, utilizando uma reacção de recombinase, um processo de clonagem com alta fidelidade e alta eficiência. Em seguida, as construções de expressão resultantes são transfectados para a linha de células alvo ou, se uma linha celular estável é desejada, empacotado em lentivírus para infectar a linha de células alvo. Transfecção transiente permite a validação rápida das configurações BiFC, mas os potenciais problemas devem ser observados. Transfecção utilizando produtos químicos frequentemente sublinha as células, resultando em alta autofluorescência; enquanto que a utilização de um total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) microscoaa pode mitigar este sinal de fundo, limitando o volume iluminação, TIRF ideal quando os PPIs ocorrem na membrana da célula. Além disso, transfecções transientes muitas vezes levar a elevados níveis de expressão da proteína, muito superiores às das proteínas endógenas, o que pode causar artefactos na detecção do IPP. Assim, recomenda-se que as linhas celulares estáveis ​​após ser estabelecida uma configuração apropriada BiFC foi determinada através de ensaios iniciais. Linhas de células estáveis ​​também têm o potencial para a expressão sintonizável através da indução de doxiciclina 15. Após a infecção, as células são seleccionadas com antibióticos, tipicamente puromicina e neomicina, um para cada constructo. Os passos subsequentes de preparação das amostras, a aquisição de imagem e análise de dados será descrito em detalhe nos protocolos. Com esta abordagem, a formação de clusters em nanoescala em imagens BiFC-palma da Ras-Raf RBD são rotineiramente observados (Figura 2A &lt;/ strong&gt;). Consistentemente, trajetórias smt-palma da Ras-Raf RBD apresentam uma distribuição heterogênea nos estados de difusão (Figura 2B-D). Estes resultados sugerem que os complexos de Ras-Raf existir em vários estados na membrana celular, presumivelmente como monómeros e aglomerados, com potenciais implicações biológicas. Este trabalho demonstra o poder da BiFC-PALM em imagem seletiva de PPIs em células com resolução espacial nanométrica e sensibilidade única molécula, o que seria difícil de obter com BiFC convencional, fluorescência co-localização, ou a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Ao projetar experimentos BiFC e interpretação dos resultados, é importante ter em mente que o processo é irreversível BiFC na maioria dos casos, incluindo PAmCherry1 divisão. Uma vez que os dois fragmentos se combinar e formar uma proteína PAmCherry1 completo, a ligação entre os dois fragmentos, e, assim, torna-se permanente do PPI. Isto limita a utilização de BiFC e BiFC-PALM para monitorar a dinâmica dos PPIs (ou seja, cinética de ligação e não a dinâmica de difusão do complexo de proteína, uma vez que é formado) e às vezes pode até mesmo levar à mislocalization dos complexos PPI. Um fator adicional a considerar ao projetar experimentos BiFC-palma é o atraso na maturação cromóforo que é inerente a proteínas fluorescentes. Uma vez que duas proteínas interagem e os fragmentos de PF vêm juntos, eles tipicamente redobre na ordem de segundos (tempo de meia 60 seg para EYFP 3). No entanto, a maturação e posterior cromóforo sinal fluorescente desenvolver na ordem de minutos. Embora a fluorescência pode ser detectável dentro de 10 min após a reconstituição de split-Vénus, uma variante rápido dobrar-YFP, a meia-hora para a maturação, em geral, é muitas vezes cerca de 60 min 16. Split-PAmCherry1 foi observada a ter taxas similares. Assim, BiFC e BiFC-PALM são escolhas atualmente pobres para monitorar cinética PPI em tempo real; outro methods, tais como a dimerização de FRET e uma recentemente desenvolvido proteína fluorescente dependente 17, pode ser mais adequado para este fim.

<table><tbody><tr><td>Moldura de microscópio</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X objetiva TIRF de imersão em óleo com 1.49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD câmera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coerente</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm espelho</td> <td>dicróicoSemrock</td><td>&nbsp; Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 561 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de entalhe de 405/561 nm</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura e CO2 estágio controlado</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr> <tr><td>Phusion DNA Polimerase de alta fidelidade</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Cloning</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Embalagem</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE Reagente de Transfecção</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chapas</td> <td>de fundo de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td>#1.5</tr><tr><td>células U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>L-15 de Leibovit, sem vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Meio de soro reduzido</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato Salino</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Concentrador</td><td>lentiviral Millipore SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Concentrador retroviral Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>cultura de 10 cm prato</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de 6 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomicina</td></tr><tr><td>Doxicilina</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Base</td> <td>TrisFisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de ouro de 100 nm</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Midiprep</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de polipropileno de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de polipropileno de 14 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC médio</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotoactivado localization microscopy com bimolecular fluorescência de complementação (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

As interações proteína-proteína (PPIs) são eventos moleculares importantes para a biologia. No entanto, continua sendo um desafio visualizar PPIs com resolução e sensibilidade suficientes nas células porque a resolução da microscopia de luz convencional é limitada por difração a ~ 250 nm. Ao combinar a complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com a microscopia de localização fotoativada (PALM), os PPIs podem ser visualizados em células com sensibilidade de molécula única e resolução espacial nanométrica. BiFC é uma técnica comumente usada para visualizar IBPs com contraste de fluorescência, que envolve a divisão de uma proteína fluorescente em dois fragmentos não fluorescentes. PALM é uma técnica recente de microscopia de superresolução para imagens de amostras biológicas em escalas nanométricas e de molécula única, que usa sondas fluorescentes fototransformáveis, como proteínas fluorescentes fotoativáveis (PA-FPs). O BiFC-PALM foi demonstrado dividindo o PAmCherry1, um PA-FP compatível com o PALM, por sua natureza monomérica, bom brilho de molécula única, alta taxa de contraste e utilidade para medições de estequiometria. Quando dividido entre os aminoácidos 159 e 160, o PAmCherry1 pode ser transformado em uma sonda BiFC que se reconstitui eficientemente a 37 °C com alta especificidade aos IBPs e baixa reconstituição não específica. A interação Ras-Raf é usada como exemplo para mostrar como o BiFC-PALM ajuda a sondar as interações em escala nanométrica e com resolução de molécula única. Sua difusão também pode ser rastreada em células vivas usando o rastreamento de molécula única (smt-) PALM. Neste protocolo, os fatores a serem considerados ao projetar as proteínas de fusão para BiFC-PALM são discutidos, as etapas de preparação de amostras, aquisição de imagens e análise de dados são explicadas e alguns resultados exemplares são apresentados. Fornecendo alta resolução espacial, especificidade e sensibilidade, o BiFC-PALM é uma ferramenta útil para estudar IBPs em amostras biológicas intactas.

O exemplo BiFC-PALM mostrado é KRAS mutante G12D interagindo com os Ras domínio de ligação (RBD) de Craf (Figura 1A). Como discutido, a RN ou fragmentos RC não foram etiquetadas para o C-terminal de Ras porque iria perturbar a localização da membrana e, portanto, a actividade biológica de Ras. Isto reduziu as combinações possíveis de oito para quatro (Figura 1B). Cada um destes quatro combinações foi introduzido em células U2OS utilizando infecção lentiviral. As células foram fixadas co...

As interações proteína-proteína são visualizadas em células com resolução espacial nanométrica combinando complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com microscopia de localização fotoativada (PALM). Descrito aqui é o uso de BiFC-PALM para interações Ras-Raf de imagem em células U2OS para visualizar o agrupamento em nanoescala e difusão de complexos Ras-Raf individuais.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

O objetivo geral dessa técnica de microscopia é visualizar proteínas e interações proteicas em escala de molécula única e nanométrica. Assim, este método pode nos ajudar a responder algumas questões fundamentais na área da biologia, como interações moleculares em processos de sinalização oncogênica. A principal vantagem dessa técnica é que ela é sensível, específica e oferece resoluções em escala de molécula única e nanométrica.O procedimento será demonstrado pelo Dr. Tahan, pesquisador sênior associado ao meu laboratório. Após clonar os fragmentos RAs e RAF R-B-D-P-A-M Cherry um, empacotá-los em partículas virais e infectar células U2 OS de acordo com o protocolo descrito no texto. Para preparar uma amostra para a placa de imagem, coloque cerca de 5,5 vezes 10 à quarta potência de células com expressão estável por poço em uma lâmina de câmara de oito poços com fundo de vidro, em 350 microlitros de DMEM sem vermelho de fenol. Use paraformaldeído fresco com glutaraldeído para fixar as células e, após substituir o fixador por PBS ou tampão de imagem, vortexe partículas de ouro de 100 nanômetros e adicione 35 microlitros por poço para rastrear a deriva da platina durante a aquisição de imagens.Aproxime-se do microscópio e ligue os lasers de 405 e 561 nanômetros, mantendo as obturadores fechadas neste momento; certifique-se de que o espelho dicromático e o filtro rejeita-faixa de 561 nanômetros estejam posicionados. Abra o software de aquisição de imagens. Ligue a câmera E-M-C-C-D e permita que ela esfrie, ajustando o tempo de exposição para 100 milissegundos e o ganho da E-M-C-C-D a um valor apropriado.Adicione óleo de imersão à objetiva e fixe a amostra na platina do microscópio. Em seguida, utilizando campo claro ou o laser de 561 nanômetros, coloque a amostra em foco para a obtenção de imagens de RAs e outras proteínas de membrana. Utilize uma objetiva APO de 60 x com abertura numérica de 1,49 e configure o microscópio na configuração turf.Ajuste o laser de excitação para que ele atinja fora do centro a abertura traseira do objetivo turf, o que fará com que o laser seja desviado ao alcançar a interface entre a lamínula e o tampão. Continue ajustando a posição de incidência do laser até que o ângulo crítico seja atingido e o laser seja refletido de volta. Procure uma célula para imagem que tenha várias partículas de ouro visíveis.Em seguida, defina uma região de interesse que envolva a célula ou uma região dela e as partículas de ouro, caso já esteja ocorrendo ativação suficiente devido a altos níveis de expressão. Inicie a aquisição com o laser de 405 nanômetros desligado e o laser de 561 ligado. Caso contrário, ligue o laser de 405 nanômetros na potência mínima de fábrica e aumente-a gradualmente até que haja dezenas de moléculas por quadro, ou de modo que as moléculas individuais fiquem bem separadas.À medida que a aquisição de dados prossegue, aumente gradualmente a potência do laser de 405 nanômetros para manter a densidade de pontos aproximadamente constante. Continue a aquisição de imagens até que a alta potência de 405 não inicie mais.Os eventos de ativação terminam o processamento de imagens. Baixe o software de processamento de imagens. Abra o MATLAB e carregue o software de leitura WFI.Visualize a sequência de imagens brutas e determine a região de interesse ou ROI, selecionando a área da pilha a ser processada clicando com o botão esquerdo e arrastando uma caixa ao redor da área desejada. Se a região de interesse não foi reduzida durante a aquisição, selecione uma área menor para diminuir o tempo de processamento; para desmarcar uma área e processar todo o quadro, clique com o botão direito em qualquer lugar da imagem. Em seguida, defina um conjunto de marcadores fiduciais, como nanopartículas de ouro absorvidas na lamínula, que estejam bem isoladas, com forma uniforme e presentes no campo de visão ao longo de toda a pilha de imagens. Comece selecionando uma partícula de ouro candidata clicando com o botão esquerdo sobre sua imagem e arrastando uma caixa pequena ao redor dela.Em rastreamento de partículas, clique no botão de rastreamento. Um gráfico aparecerá mostrando a posição da partícula de ouro selecionada ao longo da pilha de imagens, representando a extensão da deriva. Repita este processo para rastrear o maior número possível de partículas de ouro e determine as partículas que se movem juntas. Idealmente.A deriva geral é da ordem de, no máximo, 0,1 pixel por vez. Selecione as partículas de ouro que foram rastreadas em conjunto e, no rastreamento de partículas, clique no botão adicionar marcador.Uma cruz verde aparecerá, indicando que a partícula foi adicionada como marcador e será usada para corrigir a deriva. Ajuste a faixa de suavização sigma e o limiar conforme necessário, alterando ligeiramente o valor. Clique no botão encontrar partícula para testar as configurações e inspecionar visualmente as partículas processadas; moléculas como as de PAM cherry que forem relativamente arredondadas e brilhantes serão destacadas com uma caixa, enquanto aquelas que não apresentarem essas características serão descartadas.Para iniciar o processamento das imagens, clique no botão criar arquivo de corda e salve o arquivo com um nome desejado para pós-processar as imagens e renderizar a imagem da palma. Inicie o pacote palm no MATLAB e carregue o arquivo de núcleo de pontos recém-criado. Uma imagem renderizada de forma aproximada aparecerá na caixa de imagem ao lado dos botões de controle.Classifique as coordenadas individuais utilizando os seguintes valores típicos. Para PAM Cherry um, o quadro de combinação é igual a oito. A distância de combinação em nanômetros é igual a 100 e o RMS mínimo é igual a quatro.O valor mínimo de qualidade de ajuste é igual a 0,25 e a excentricidade máxima é igual a 1,4. Clique no botão de classificação para gerar um novo conjunto de coordenadas curadas, prontas para renderizar imagens de alta resolução. Insira valores para a correta renderização da imagem final, como o tamanho do pixel bruto previamente determinado e o tamanho desejado da característica na imagem renderizada, que normalmente é definido em um valor ligeiramente superior à localização média e ao tamanho do pixel, como 10 nanômetros.Para a imagem renderizada, clique no botão de renderização para gerar a imagem da palma. Em seguida, use os ícones de ampliação com sinal de mais e menos na barra de ferramentas da janela da figura para aumentar e diminuir o zoom e acompanhar moléculas individuais em células vivas. Trate a superfície de cultura de tecidos e plaque as células conforme descrito anteriormente neste vídeo.Certifique-se de que a lamínula tenha a espessura apropriada para a configuração de microscopia após a transecção das células e a realização de quaisquer tratamentos e incubações necessários para o experimento; coloque o recipiente de cultura em um incubador acoplado ao microscópio. Deixe o recipiente acomodar-se na platina por alguns minutos até que a temperatura e a concentração de CO₂ se estabilizem neste passo. Bloqueie os lasers.Se o controle de CO2 não estiver disponível, mude para um meio independente de CO2 imediatamente antes da aquisição de imagens, como o meio Leibovitz L 15, para reduzir a fluorescência de fundo. Em seguida, adquira imagens conforme demonstrado anteriormente, ajustando um tempo de exposição apropriado para garantir uma boa relação sinal-ruído sem perder resolução temporal. O BFC palm nesta figura é o mutante KRAS G 12 D interagindo com o domínio de ligação à RAs, ou RBD, da CRAF. Cada uma das quatro combinações mostradas aqui foi introduzida em células U2 OS por meio de infecção lentiviral. Células com duas das configurações apresentaram sinais fortes e positivos de BFC, identificados pelo aumento abrupto da fluorescência quando o laser de 405 nanômetros foi ativado, devido à fotoativação do BFC reconstituído PAM Cherry um, conforme demonstrado aqui utilizando as mesmas condições experimentais do PAM Cherry um original.Um sinal BFC forte foi gerado após a infecção com RN R e RAF RBD RC. Aqui, RN e RC denotam os fragmentos N e C-terminal do PAM Cherry um, respectivamente, quando ampliados moléculas individuais e sua distribuição espacial em escala nanométrica pode ser claramente observada neste experimento onde o rastreamento individual de moléculas por palm foi realizado para obter trajetórias de difusão de RAs individuais. Complexos RAF RBD sob iluminação contínua com lasers de 561 nanômetros e 405 nanômetros. Moléculas individuais de PA m cherry um st.Ligue e permaneça ativo por algumas quadros antes de entrar em estados escuros, onde foram encontrados imóveis ou móveis. Este gráfico de gravações para múltiplas moléculas ilustra claramente ambos os tipos de trajetórias. A mesma distribuição heterogênea de estados de difusão pode ser inferida a partir do histograma do deslocamento molecular entre quadros sucessivos Mass mastered.Essa técnica pode ser realizada em uma a três semanas, dependendo se os construtos são transcendentemente, transfectados ou estavelmente reprimidos, caso seja realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar controles, como Putins mutantes que perdem a interação após este procedimento. Outros métodos, como uma análise de agrupamento, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, por exemplo, como as interações proteicas são organizadas espacialmente na célula?Para o rastreamento celular em laboratório, como base avaliativa, pode-se realizar o rastreamento de partículas individuais para determinar os estados de difusão e as probabilidades de transição após seu desenvolvimento. Esta técnica está sendo utilizada em nosso laboratório na área de biologia do câncer para explorar interações mediadas pelo ácido retinóico, bem como a homo e a oligomerização de receptores da família Her em células tumorais humanas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e implementar um ensaio de co-imunoprecipitação para investigar uma interação proteica de interesse.Não se esqueça de que trabalhar com antivirais e células tumorais pode ser extremamente perigoso, e precauções, como os protocolos-padrão de biossegurança, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A localização subcelular de proteínas é importante para determinar a regulação espaço-temporal de sinalização celular. Aqui, descrevemos complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) como um método simples para monitorar as interações espaciais de proteínas na célula.

Complementação de fluorescência bimolecular

Este vídeo descreve o BiFC-PALM ― uma combinação de microscopia de localização fotoativada e complementação de fluorescência bimolecular ― para avaliar as interações proteína-proteína. BiFC envolve a fusão de dois fragmentos de proteína fluorescente com duas proteínas de interesse que interagem. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos são aproximados, o que permite que as duas partes se juntem e reconstituam uma proteína fluorescente funcional. A fluorescência de um único fluoróforo é...

Microscopia de localização fotoativada acoplada à complementação de fluorescência bimolecular

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

PI (4,5) P 2 regula várias funções celulares, mas a sua organização em nanoescala na membrana plasmática da célula é mal compreendida. Por rotulagem PI (4,5) P 2 com uma sonda fluorescente de duas cores fundido com o domínio de homologia plecstrina, descrevemos uma nova abordagem para estudar o PI (4,5) P 2 em distribuição espacial da membrana plasmática em escala nanométrica .

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM), um método de microscopia de super-resolução 3-dimensional única molécula localização, à imagem do citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes. Esta abordagem permite a visualização à base de luz de características estruturais em nanoescala que, caso contrário permanecem sem solução por microscopia óptica limitado por difração convencional.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.

Analisando a rede de α-Actinin em Cardiomiócitos derivados do iPSC humano usando microscopia de localização de molécula única

Aprenda a técnica BiFC-PALM para visualizar interações proteína-proteína em células U2OS com resolução nanométrica. Este método sensível e específico permite estudar sinalização oncogênica em biologia celular.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

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