Utilizando Análise de confocal

O objetivo geral desta metodologia é visualizar a secreção e a difusão de ligantes marcados com fluorescência em um epitélio intacto, utilizando expressão em xip pos lavis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o estabelecimento de gradientes morfo que são conhecidos por serem essenciais na especificação de linhagens celulares durante o desenvolvimento embrionário inicial. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um método simples para visualizar a distribuição de ligantes em um epitélio intacto.

Uma parte essencial do protocolo é gerar ligantes biologicamente ativos que sejam normalmente processados e secretados e capazes de provocar uma resposta em células receptoras, apesar de terem uma marca fluorescente ligada. A microscopia confocal é uma maneira ideal para estudar a localização de proteínas marcadas com fluorescência em tecidos tridimensionais, pois o uso de lasers e detectores independentes permite uma análise limpa dentro desses tipos de tecidos complexos e possibilita a coleta de dados robustos. Após gerar o revestimento de mRNA para ligantes marcados com fluorescência e obter embriões XUS lavis de acordo com o protocolo descrito, injete o mRNA juntamente com um marcador de linhagem, como RFP de membrana, em uma única célula no estágio de 16 a 32 células; se desejado, um modulador pode ser injetado simultaneamente com um ligante fluorescente e o marcador de linhagem para analisar seus efeitos.

Às vezes, é útil também injetar uma célula vizinha. Aqui, uma segunda célula é injetada adjacente à célula previamente injetada. Uma célula é injetada com RNAm que codificam o ligante marcado com GFP e um marcador de linhagem, como RFP de membrana, enquanto a outra célula é injetada com RNAm que codificam o modulador e um marcador de linhagem diferente, como ceruleano de membrana. Transfira os embriões para uma incubadora a 12,5 graus Celsius e cultive-os até o novo cocho. No estágio Faber oito, no dia seguinte, quando os embriões tiverem atingido o estágio oito, encha as placas revestidas com 1% de aros com NAM dois e transfira os embriões usando uma pipeta de vidro com a ponta cortada, com auxílio de agulhas de tungstênio.

Disseque o explante circular do polo animal de embriões injetados e controles, tomando cuidado para não incluir nenhum mesoderma; transfira o explante animal para placas de Petri de 55 milímetros, revestidas com 1% de agarose, e cultive os embriões por quatro horas. Incube para permitir que as proteínas fluorescentes amadureçam, gerando contraste. Para os lâminas, aplique duas camadas de fita isolante de PVC sobre lâminas de microscópio, achatando-as completamente.

Corte um retângulo de 14 por 10 milímetros da fita para montar as tampas dos animais. Em seguida, pipete duas gotas separadas de NM dois no lâmina de relevo. Depois, usando uma ponteira P 20 cortada, transfira até 15 explantes animais para cada lâmina e, com pinça, posicione os explantes X de modo que o lado apical fique voltado para cima.

Usando uma caneta de diamante, risque um lamínula de vidro e quebre-o para criar um lamínula menor. Para ajustar ao lâmina de relevo, abaixe suavemente um lamínula de vidro sobre a lâmina de relevo utilizando uma agulha curvada de calibre 19, comprimindo a camada apical de células do chapéu animal.

Use verniz para unhas para selar a lâmina e deixe secar no escuro por 20 minutos; realize a análise de imagem entre quatro e seis horas após. Para garantir tampas animais saudáveis, as tampas animais devem ser corretamente orientadas nas lâminas personalizadas e depois cobertas com lamínulas. Carregue suavemente nas lâminas.

É fundamental não usar muito esmalte de unha para selar as lâminas, pois isso fará com que a fita enrugue e quebre o selo na lâmina posteriormente. Após dominar a técnica, será necessário injetar cerca de 25 embriões para obter cerca de 20 calotas animais boas por condição de interesse. Essas podem então ser analisadas por microscopia confocal no dia seguinte.

Para realizar a imagem, utilize uma objetiva de baixa ampliação para localizar X explan. Em seguida, mude para uma objetiva de 63 x 1,4 de óleo para obter imagens com maior resolução. Ligue os lasers necessários, incluindo 405 para MIAN, 488 para GFP e 561.

Para o MRFP, otimize as potências do laser para que todos os fluoróforos possam ser detectados. Utilizando o arranjo de 32 detectores, minimize ao máximo a quantidade de tensão e ganho necessárias, em seguida use o modo Lambda e selecione os lasers de 405 nanômetros, 488 e 561 nanômetros. Para permitir um campo de visão mais amplo, diminua o zoom da imagem para 0,6 x.

Em seguida, ajuste o tamanho do quadro para o tamanho de imagem desejado. Isso fornece resolução suficiente para a média do conjunto de análises, variando de quatro a oito, a fim de aumentar a relação sinal-ruído e otimizar o diafragma para este conjunto de dados. Uma unidade de área, de acordo com o laser de 561 nanômetros, foi utilizada usando 405 e 4 88 5 61.

Espelhos dicróicos coletam a luz emitida pelas membranas Saru, GFP e RFP. Neste experimento, a luz foi coletada aproximadamente a cada 10 nanômetros, de 415 a 720 nanômetros. Realize a análise de imagem de acordo com o protocolo descrito aqui: a distribuição de sonic hedgehog marcado com GFP em um explante de animal cab X sob condições controle mostra que o sonic hedgehog GFP é secretado e difunde-se para fora da região que expressa os mRNAs injetados.

No entanto, na presença do modulador, SULF um, Sonic Hedgehog GFP apresenta uma distribuição mais restrita. E nesta amostra, apenas alguns focos de Sonic Hedgehog GFP podem ser observados a uma curta distância do clone de células que o produz. Esta figura mostra a caracterização de dois ligantes marcados com fluoróforo injetados em células, conforme indicado aqui: tanto wind eight A quanto win 11 B-H-A-E-G-F-P se acumulam na membrana de células do chapéu animal, sendo que wind eight A-H-A-E-G-F-P se acumula de maneira mais eficiente do que wind 11 B. Esta figura mostra a distribuição de wind eight A-H-A-E-G-F-P expresso em um clone de células marcado com ceruleano ligado à membrana.

O ligante marcado com fluoróforo é observado difundindo-se a partir das células fonte e penetrando nas células circundantes do epitélio. Um software de análise de imagens é utilizado para extrair dados sobre a distribuição dos ligantes wind marcados com fluoróforo em múltiplas amostras experimentais, como mostrado aqui. A distância a partir do clone que expressa mem Saru e o nível de fluorescência de GFP são medidos para determinar o alcance da difusão do wind e a forma do gradiente.

Após medir a distribuição de um ligante, a atividade de uma via de sinalização também pode ser avaliada combinando este protocolo com outro ensaio para monitorar a resposta de células receptoras. Dessa forma, é possível tentar determinar a faixa limite de um morfógeno.