Name: の共焦点分析を用いましたアフリカツメガエル WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル胚におけるモルフォゲン勾配の共焦点顕微鏡解析法。蛍光標識リガンドの分泌と拡散を可視化し、WntやShhシグナリングの動態を調べる技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、MEP（BB / H010297 / 1）、SARにBBSRCクォータの学生の身分、およびSWFへのMRC学生の身分にBBSRCの助成金によって賄われていました。

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
<li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPownall%2C+ME+%22FGF+Signalling+in+Vertebrate+Development%22">FGF Signalling in Vertebrate Development</a>. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127 (3), 469-480 (2006).</li>
<li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+animal+development%3A+paradigms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li>
<li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+positional+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li>
<li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics%2C+spatial+range%2C+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li>
<li>Erickson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+morphogen+gradients%3A+an+essential+role+for+the+endomembrane+system+in+Drosophila+melanogaster+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development.</a> Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).</li>
<li>Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+signalling+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gradients of signalling in the developing limb.</a> Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).</li>
<li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube%3A+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li>
<li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li>
<li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li>
<li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li>
<li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
<li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics+%3A+A+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics : A biologist's guide</a>. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).</li>
<li>Fay, M. P., Proschan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilcoxon-Mann-Whitney+or+t-test%3F+On+assumptions+for+hypothesis+tests+and+multiple+interpretations+of+decision+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Surveys%22%5BJournal%5D)">Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules.</a> Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).</li>
<li>Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt-8%2C+a+Xenopus+Wnt-1+%2Fint-1-related+gene+responsive+to+mesoderm-inducing+growth+factors%2C+may+play+a+role+in+ventral+mesodermal+patterning+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis.</a> Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).</li>
<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
<li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury%3A+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled%2C+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li>
<li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li>
<li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li>
<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

このプロトコールの重要な部分は、通常、加工分泌され、結合した蛍光部分を有するにもかかわらず、受容細胞における応答を誘発することができる生物学的に活性なリガンドを生成しています。これは、蛍光タグを付けた遺伝子産物は、適切なアッセイを用いて生物学的に活性であることを確立することが重要です。 Shh-GFPについては、PTC1の発現を活性化する能力は、16を確認しました。 Wnt8a単一腹側割球20-21に発現された場合、二次軸を誘導する非常に強力な能力を有しており、Wnt8a-HA-EGFPは、この生物学的活性を保持することが示されました。 Wnt11bは収斂伸長21-22を受けてから、アクチビン処理した外胚葉外植片を阻害し、Wnt11b-HA-EGFPはまた、その生物学的活性を保持している17。タグなしのタンパク質と同等の応答を誘導するためにタグ付けされたリガンドの能力は、蛍光性リガンドを用いた実験に基づいて結論をbになりますことを示唆しています通常のタンパク質に関連する電子。リガンドと蛍光タンパク質との間のHAエピトープの追加は、W...

初期胚発生時には、細胞が徐々に分化の特定の系統に従うことを約束されています。これは、全能性（または多能性）の基を意味し、細胞が徐々に一つの細胞型を生じると判断前駆細胞の集団を確立するに限定となります。細胞間シグナル伝達は、胚発生時の系統仕様の規制の中心です。これらの信号の操作は、新規な治療法をサポートするために、特定の運命に向かって直接幹細胞に必要とされます。 シグナル伝達経路の比較的小さな数は、TGFスーパーファミリー（nodalsとのBMP）1-2、FGFの3、4のWnt、およびハリネズミ5への応答経路を含め、開発中に繰り返されます。これらの分泌されたタンパク質は、それによって遺伝子発現および/または細胞の挙動を変化させるシグナル伝達を活性化する細胞膜に存在する受容体に結合します。細胞標識の厳しい規制エイリングは、細胞系譜の仕様と正常な発達に不可欠です。これらの経路の間でのクロストークは、細胞の運命を決定するのに重要であるが、単一のリガンドは、それ自体、異なる濃度で異なる応答を誘発することができます。モルフォゲン勾配は細胞型はセル 6の分野から派生することができますどのように異なる説明する理論として100年以上前に説明しました。細胞の一つのグループによって生成シグナリング分子は、ソースからの長い距離と濃度の減少、一定の範囲で拡散することができます。信号に曝露された細胞は、異なる位置での細胞が信号の異なるレベルに対して異なる応答すると、電池の分野での位置で局所濃度に応答します。モルフォゲンの存在の証拠は、初期のショウジョウバエ胚7と翼のディスク 8と同様に、脊椎動物の四肢9と神経管10の研究から来ています。 方法は、中に必要とされています確立され、これらの勾配を調節する上で重要な他の分子を同定する方法をモルフォゲン勾配vestigate。異なる遺伝的背景との関連で、インビボで内因性タンパク質を可視化するために免疫組織化学を用いた上品な実験は、モルフォゲン勾配11-12を研究するために使用されています。しかし、優れた抗体および特定の変異体は、常に利用可能ではないので、我々は、代替、外因性遺伝子産物が細胞のフィールド全体でのリガンドの分布に影響を与えることができる方法を詳細に分析するための簡単​​な方法を提供することで、アフリカツメガエルにおける蛍光リガンドの過剰発現を使用して、ここでのプロトコルを記述します。 アフリカツメガエルは、彼らが最も初期の段階でアクセス可能であるので、その胚は、外部開発する実験のこれらのタイプに着手するための優れたシステムを提供します。サイズが大きい（直径1〜1.5ミリメートル）は、マイクロインジェクションおよび外科操作を簡素化し、胞胚によって、彼らはまだ約20（比較的大きいですように、細胞は、画像に簡単ですステージ81;）全体でmは。アフリカツメガエルにおける過剰発現の研究​​を行うのは簡単である：mRNAは、初期胚に注入し、特定の細胞を標的とすることができ、効率的に翻訳されています。 蛍光タグ付けWnt8a / Wnt11b-HA-EGFP構築物は、PCS2 Wnt8a-HA 13、PCS2 Wnt11b-HA 14およびEGFPを用いて作製しました。 HAペプチドは、追加の分子タグを提供するだけでなく、含まれることが重要であるが、それは両方の遺伝子産物が機能することを可能にするのWntおよびEGFPタンパク質を分離するスペーサーとして作用すると考えられるからです。 Shhの可視化のために使用される構築物は、以前のShh-EGFP融合タンパク質15を発現するトランスジェニックマウスを生成しました。これは親切にアンディ・マクマホンによって提供されました。重要なことは、すべての構築物について、GFPタグは、それが処理した後に保持されるようなシグナル配列の3 &#39;側にクローニングされます。そのようなadditio、最終タンパク質は、修正するために必要な配列を含むことを確実にするためにも不可欠です脂質のnが合成mRNAのprodution用に最適化されPCS2 +発現ベクターにサブクローニングしたのShhおよびWnt ligands.TheのcDNAの場合です。それは、SP6プロモーターおよびポリアデニル化シグナル（http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors）を含みます。 ここで説明する作業は、分泌および蛍光の拡散を比較するための単純なプロトコルがWntとのShhは、リガンドをタグ付けタグ付けています。合成mRNAの規定量を注入することにより、プロトコルが異なるプロモーターを使用して、異なるベクターからの変数式に関連するすべての問題を一周します。これらのメソッドは、最近のShh-EGFPおよびWnt8a /アフリカツメガエル16-17でWnt11b-HA-EGFP分泌および拡散にヘパラン硫酸endosulfatase Sulf1の影響を調査するために適用されています。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>メルフォード</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>アンビオン</td><td>Megascript SP6 キット AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸塩</td><td>VWR インターナショナル</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>キャップ アナログ (m7G(5'))</td><td>アプライド バイオシステムズ</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン塩酸塩一水和物</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>無料ダウンロード</td></tr><tr><td>http://fiji.sc/Fiji ゲンタマイシン</td><td>メルフォード</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ No.1.5&nbsp;</td><td>科学実験室用品</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガラス針引き機</td><td>ナリシゲ</td><td>成茂 PC -10</td><td></td></tr><tr><td>ガラス引き針</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>ヒト慢性ゴナドトロピン (HCG)</td> <td>インターベット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム (LiCl)</td> <td>シグマ</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 およびZenソフトウェア(2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlabソフトウェア</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://uk.mathworks.com/ 分子グレードの水&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2819-10</td><td></td></tr><tr><td>ネイルワニス&nbsp;</td><td>ブーツ</td><td>バーコード3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Lab.tech 国際</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(55 mm)</td><td>VWR国際</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>フェノール-クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>フォトショップソフトウェア</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>高忠実度のDNAポリメラーゼとバッファ&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&nbsp;バッファー - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>PVC 絶縁テープ</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素バッファー</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT バッファーセット 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free DNAse</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>スチールバックシングルエッジブレード</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 転写キット</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>スライド サー</td><td>モフィッシャー</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>タングステン針</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>Zen lite ソフトウェア</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>無料ダウンロード&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; wntおよびshhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

このプロトコルは、電池の分野にわたって分散リガンドを可視化する方法を説明しています。一緒に初期胚での細胞のサイズが大きいと、外因性タンパク質を発現の容易さは、 アフリカツメガエルは 、GFPタグ付きリガンドを可視化するための有用なモデルを アフリカツメガエル 作ります。合成mRNAは効率的に早期 アフリカツメガエル胚に 注入した後に翻訳され、注射は、単一の細胞を標的とすることができます。このような膜つながRFPとして系統のトレーサーと組み合わせると、過剰発現されたタンパク質を産生している細胞注入（とその子孫）を容易に追跡することができます。このプロトコルは、注入されたmRNAからWntおよびShhのリガンドをタグ付けされた蛍光を製造するための方法を説明します。方法はマイルを伴います外胚葉外植（アニマルキャップ）と、複数のサンプル中のリガンド拡散の解析のCRO解剖。共焦点イメージングを用いて、細胞のフィールド上のリガンドの分泌および拡散についての情報を得ることができます。共焦点画像の統計分析は、リガンド勾配の形で定量的データを提供します。これらの方法は、モルフォゲン勾配の形状を調節することができる因子の効果を試験する研究に有用であり得ます。

蛍光タグ付きタンパク質を発現アニマルキャップの外植片の共焦点分析は、異なる実験条件の下でのリガンド分布を可視化するための効果的なシステムを提供します。一例では、GFPの分布のShhは、（ 図1）が示されているタグを付けました。 2細胞期では、 アフリカツメガエル胚は対照mRNAとまたはmRNAはSulf1、細胞表面ヘパラン硫酸を変更し、Shhのモルフォゲン勾配16に影響を与える酵素をコードするとのいずれかで、両方の細胞内に注入されます。これらの胚は32細胞期まで培養し、単一のセルが（系統のトレーサーとして）のShh-GFPとmemRFPをコードするmRNAとの同時注入です。これは、細胞膜つながRFPでマークされているのShh-GFPを発現する細胞のクローンを作成します。胞胚段階で、アニマルキャップの外植片を、共焦点顕微鏡による分析のために採取される。 図1は、制御条件下でのShh-GFPが分泌されることを示し、再外の拡散します祇園は、注入されたmRNAを発現しています。しかし、Sulf1の存在下では、Shhは、GFPは、このサンプ...

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

本手法の全体的な目的は、*Xenopus laevis*における発現を利用して、無傷の上皮における蛍光タグ付きリガンドの分泌と拡散を可視化することです。この手法は、初期胚発生における細胞系譜の決定に不可欠であることが知られているモルフォゲン勾配の形成に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、無傷の上皮におけるリガンド分布を可視化するための簡便な手法であることです。本プロトコルの重要な部分は、通常通りにプロセシングおよび分泌され、蛍光タグが付着しているにもかかわらず受容細胞において応答を誘発させることができる、生物学的に活性なリガンドを生成することです。共焦点顕微鏡は、独立したレーザーと検出器を用いて、三次元組織内における蛍光タグ付きタンパク質の局在を研究するのに最適な方法であり、これにより複雑な組織型においてもクリーンな解析が可能となり、堅牢なデータを収集することができます。記述されたプロトコルに従って、蛍光タグ付きリガンドのmRNAコーティングの作製およびXUS lavis胚の取得を行った後、必要に応じて膜RFPなどのリネージトレーサーとともに、16〜32細胞期の単一細胞にmRNAを注入します。また、その影響を解析するために、モジュレーターを蛍光リガンドおよびリネージマーカーと共に共注入することも可能です。隣接する細胞にも注入することが有用な場合があります。ここでは、以前に注入した細胞に隣接して、2番目の細胞に注入を行います。一方の細胞には、GFPタグ付きリガンドをコードするmRNAと、膜RFPなどのリネージトレーサーを注入し、もう一方の細胞には、モジュレーターをコードするmRNAと、膜ceruleanなどの別のリネージトレーサーを注入します。胚を12.5 °Cのインキュベーターに移し、new coopまで培養します。翌日、胚がステージ8に達した時点で、1%アガロースでコーティングされたディッシュにNAM 2を満たし、タングステン針を用いたカットガラスピペットを使用して胚を移します。注入胚および対照胚の動物極から、中胚葉が含まれないように注意して円形の外胚葉を切り出します。1%アガロースでコーティングした55 mmペトリ皿に動物外胚葉を移し、蛍光タンパク質を成熟させてレリーフを生成させるため、胚を4時間培養します。顕微鏡スライドグラスにPVC絶縁テープを2層にわたって貼り付け、完全に平坦にします。動物キャップを固定するためのテープを14 by 10 millimeterの長方形に切り出します。次に、リリーフスライドにNM twoを2滴分、別々にピペッティングします。その後、先端をカットしたP 20チップを用いて、各スライドに最大15個の動物外植片を移し、ピンセットで外植片の頂端側が上を向くように方向を調整します。ダイヤモンドペンでガラスカバースリップに傷をつけ、それを割って小さなカバースリップを作成します。レリーフスライドに適合させるため、曲げた19ゲージの針を使用して、ガラスカバースリップをレリーフスライド上にゆっくりと下ろします。これにより、動物極キャップ細胞の頂端層を圧縮します。ネイル varnish を用いてスライドを封印し、暗所で 20 分間乾燥させた後、4 ～ 6 時間以内に撮像します。健全な動物極キャップ（animal caps）を確保するため、カスタムスライドおよびカバーガラス内で animal caps が正しく方向付けられている必要があります。スライドへの載置は慎重に行ってください。スライドを密封する際にマニキュアを使いすぎないことが重要です。使いすぎるとテープにしわが寄り、後でスライドの密封状態が損なわれる原因となります。習熟すれば、関心のある条件ごとに20個の良好なアニマルキャップを採取するために、約25個の胚に注入を行う必要があります。これらは翌日に共焦点顕微鏡で解析することが可能です。イメージングを行うには、低倍率の対物レンズを使用してX explanを確認します。次に、より高解像度のイメージングを行うため、63 x 1.4のオイル浸漬対物レンズに切り替えます。MIAN用の405、GFP用の488、および561を含む必要なレーザーをオンにします。MRFPについては、すべての蛍光色素を検出できるようレーザー出力を最適化します。電圧とゲインを必要最小限に抑えながら32個の検出器アレイを使用し、Lambdaモードを選択して、405 nm、488 nm、および561 nmのレーザーを選択します。より広い視野を確保するため、画像のズームを0.6倍に設定してください。次に、フレームサイズを希望の画像サイズに設定します。これにより、解析に十分な解像度が確保され、S/N比を向上させるために平均化回数を4回から8回に設定し、このデータセットに合わせてピンホールを最適化します。561 nmレーザーに基づき、1エリアユニットを使用し、405、488、561を用いて測定しました。Diicミラーを用いて、膜結合型Saru、GFP、および膜結合型RFPから放出される光を収集します。本実験では、415から720 nmの範囲で、約10 nmごとに光を収集しました。ここに示すテキストプロトコルに従って画像解析を行います。これは、対照条件下での動物胚のX軸方向におけるGFPタグ付きsonic hedgehogの分布を示しています。sonic hedgehog GFPは分泌され、注入されたmRNAを発現している領域の外側へと拡散します。しかし、モジュレーターであるSULF1が存在すると、Sonic Hedgehog GFPの分布はより制限されます。そして、このサンプルでは、Sonic Hedgehog GFPを産生している細胞クローンのごく近傍にのみ、少数の焦点が観察されます。この図は、ここに示すように細胞に注入された、蛍光タグ付きの2種類のWntリガンドの特性解析を示しています。Wnt8aおよびWnt11b-HAE-GFPはいずれも動物極外胚葉細胞の膜に蓄積しますが、Wnt8a-HAE-GFPの方がWnt11bよりも効率的に蓄積します。この図は、膜結合型Ceruleanで標識された細胞クローンで発現させたWnt8a-HAE-GFPの分布を示しています。蛍光標識されたリガンドが、ソース細胞から拡散し、上皮の周囲の細胞へと移動していく様子が観察されます。ここに示すように、画像解析ソフトウェアを用いて、複数の実験サンプルにおける蛍光標識windリガンドの分布データを抽出します。mem Saru発現クローンからの距離とGFP蛍光レベルを測定し、windの拡散範囲と勾配の形状を決定します。リガンドの分布を測定した後、このプロトコルを別のアッセイと組み合わせることで、受容細胞の応答をモニタリングし、シグナル伝達経路の出力を評価することも可能です。このようにして、モルフォゲンの閾値範囲の決定を試みることができます。

using-confocal-analysis-xenopus-laevis-to-investigate-modulators-wnt

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。...

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

タイムラプス共焦点イメージングは​​、胚発生を特徴づけるための有用な強力な技術である。ここでは、方法論を記述し、野生型では頭蓋顔面形態形成を特徴づけるとともに、PDGFRA、Smad5を、そしてSMO変異胚。...

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論に簡単な詳細を示します。...

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus...

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

蛍光カルシウムイメージングとin...

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。...

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

ここでは、胚の固定、免疫染色、および切片化のために最適化された段階的なプロトコルが提供され、発達中のマウス組織におけるサイトネムと呼ばれる特殊なシグナル伝達糸状体を検出します。...

シトネム解析のための胚性マウス組織の固定

学ぶアフリカツメガエル胚におけるモルフォゲン勾配の共焦点顕微鏡解析法。蛍光標識リガンドの分泌と拡散を可視化し、WntやShhシグナリングの動態を調べる技術です。

の共焦点分析を用いました

さらに動画を探す