Rápido In Situ A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica
23 de setembro de 2015
Este protocolo descreve um método de hibridização in situ rápido e simplificado, ideal para cérebro com prefixo de paraformaldeído, reduzindo assim a necessidade de etapas complexas prolongadas ao usar tecidos frescos congelados. O método é validado usando a identificação do gene do receptor de serotonina 5-HT2A htr2a em ratos.
O objetivo geral deste procedimento é realizar uma rápida hibridização em C dois no tecido cerebral com prefixo de aldeído paraforma. Isso é feito primeiro desidratando seções de tecido cerebral e tratando as seções com pré-tratamento de um, dois e três reagentes. O segundo passo é hibridizar as seções com sondas de oligonucleotídeos primários e, em seguida, segunda, terceira e quarta sondas.
Em seguida, adicione substrato vermelho rápido para detectar o RNA alvo. A etapa final é quantificar o nível de sinais de mRNA com o software Image J. Em última análise, mudanças na expressão gênica do RNA podem ser obtidas comparando os grupos experimental e controle.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela é relativamente simples, barata, reproduzível e leva menos de dois dias para ser concluída. Este trabalho foi desenvolvido por mim e John Jay Lenan, da Ross University School of Veterinary Medicine, e Jean Soza e RU Tao, da Faculdade de Medicina da Flórida, Atlantic University. Neste procedimento, sua desidratação retira quatro lâminas de caixas de lâminas de microscópio armazenadas no freezer negativo de 80 graus Celsius.
Atribua as seções aos testes de P-P-I-B-D-A-P-B e HT, dois genes A marque-os e rotule-os com uma caneta esferográfica. Em seguida, mergulhe as lâminas em álcool 100% em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, seque as lâminas por cinco minutos na hotte para pré-tratamento pipetar 20 microlitros do pré-tratamento um reagente para cada seção, coloque as lâminas em um trilho de rack em uma bandeja de umidade.
Agite suavemente a bandeja de umidade em um agitador horizontal em velocidade baixa por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos. Mergulhe as lâminas em um béquer de 1000 mililitros contendo 450 mililitros do reagente de pré-tratamento.
Em seguida, ferva as lâminas por um total de cinco minutos a 100 graus Celsius para restaurar a estrutura do RNA. Depois disso, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos de cada vez. Coloque as lâminas em álcool 100% por cinco minutos.
Em seguida, seque as lâminas por cinco minutos. Na hotte, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da área selecionada na seção de tecido. Em seguida, pipete 10 microlitros do pré-tratamento de três reagentes para cada área selecionada para aumentar a penetração da sonda e cobrir a bandeja de umidade com uma tampa.
Em seguida, coloque a bandeja no forno de hibridização equipado com uma coqueteleira horizontal. Defina a temperatura do forno para 40 graus Celsius e agite suavemente a bandeja por 30 minutos Depois, lave as lâminas duas vezes com água destilada duas vezes por dois minutos de cada vez. Nesta etapa, pipete 10 microlitros de P-P-I-B-D-A-P-B ou HTR duas sondas A nas áreas selecionadas.
Em seguida, cubra a bandeja de umidade com uma tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite suavemente as lâminas do shaker horizontal em baixa velocidade enquanto as incuba a 40 graus Celsius no forno por duas horas. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez, pipete 10 microlitros do reagente de amplificação em cada área selecionada.
Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez, pipete 10 microlitros do reagente de amplificação dois em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos.
Depois disso, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos. A cada vez, pipete 10 microlitros do reagente de amplificação três em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos. Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação quatro em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos.
Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos. Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação cinco em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos. Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação seis em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas em temperatura ambiente por 15 minutos.
Em seguida, lave as lâminas novamente duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez. Agora pipete 10 microlitros do reagente vermelho para cada área selecionada, coloque as lâminas na bandeja de umidade do agitador horizontal em temperatura ambiente e agite suavemente em velocidade baixa por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por 10 minutos.
A cada vez, seque as lâminas a 60 graus Celsius no forno por 15 minutos. Em seguida, colocar as lâminas em xileno na hotte durante cinco minutos. Em seguida, pipete 20 microlitros de mídia de montagem à base de xileno em cada área selecionada e cubra com uma lamínula.
Nesta etapa, arraste e solte o arquivo de imagem na janela J da imagem principal. Vá para a barra de menus e selecione a imagem. Em seguida, selecione o tipo no menu suspenso e selecione oito bits.
Em seguida, selecione ajustar e, em seguida, selecione limite para abrir a caixa de diálogo. Ajuste o valor da barra inferior na caixa de diálogo para que o fundo indesejado seja removido. Vá para a barra de menus e selecione Analisar e, em seguida, selecione analisar partículas para abrir uma segunda caixa de diálogo.
Defina o tamanho da partícula para 10. Em seguida, selecione mostrar contornos e selecione exibir resultados e caixas de resumo. Por fim, clique em OK para visualizar os dados de partículas nas caixas de diálogo.
Para o cálculo da planilha, insira os dados na planilha do Excel e calcule a média do número de partículas no grupo de solução salina como linha de base. Em seguida, calcule o nível percentual de cada seção e faça um gráfico de acordo. Aqui estão as visualizações microscópicas de luz dos sinais de hibridização indicados pelos pontos vermelhos.
Os tecidos foram prefixados com aldeído paraforme em ratos profundamente anestesiados previamente tratados com solução salina e MDMA. As sondas de oligonucleotídeos utilizadas são D-A-P-B-P-P-I-B e HT dois A. Esta figura mostra o efeito na expressão do gene hipotalâmico HT dois A em ratos previamente tratados com MDMA e uma redução de 20% no HT dois, uma expressão foi observada. Essa técnica torna mais fácil para os pesquisadores do campo da neurociência medir a expressão gênica do mensageiro RA, usando in situ na paraforma, o tecido cerebral prefixado em altura.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método rápido e simplificado de hibridização in situ ideal para tecido cerebral previamente fixado com paraformaldeído. O método reduz a necessidade de etapas complexas prolongadas ao utilizar tecidos frescos congelados e é validado pela identificação do gene do receptor de serotonina 5-HT 2A, htr2a, em ratos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Expressão Gênica
- Hibridização In Situ
Contexto
- A hibridização in situ é uma técnica utilizada para detectar sequências específicas de RNA em cortes de tecidos.
- Os métodos tradicionais podem ser demorados e complexos, exigindo processamento extensivo das amostras.
- Este estudo tem como objetivo simplificar o processo para obter maior eficiência.
- O receptor de serotonina 5-HT 2A é importante para a compreensão de diversas funções neurológicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo rápido de hibridização in situ para tecido cerebral.
- Simplificar o procedimento mantendo a precisão na detecção da expressão gênica.
- Validar o método utilizando o gene htr2a como alvo.
Métodos Utilizados
- Desidratação de cortes de tecido cerebral.
- Tratamento com reagentes de pré-tratamento.
- Hibridização com sondas oligonucleotídicas primárias e secundárias.
- Detecção do RNA alvo utilizando o substrato vermelho rápido e quantificação com o software Image J.
Resultados Principais
- O protocolo identifica com sucesso o gene htr2a em tecido cerebral de rato.
- Ele demonstra uma redução significativa no tempo de processamento em comparação com métodos tradicionais.
- A análise quantitativa mostra níveis confiáveis de sinal de mRNA.
- As comparações entre grupos experimentais e de controle revelam alterações na expressão gênica de RNA.
Conclusões
- O método rápido de hibridização in situ é eficaz para tecido cerebral previamente fixado com paraformaldeído.
- Essa abordagem pode facilitar estudos posteriores sobre expressão gênica em neurociência.
- Aplicações futuras podem incluir investigações mais amplas sobre diversas condições neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A hibridização in situ rápida utilizando sondas de oligonucleotídeos em tecido cerebral previamente fixado com paraformaldeído permite uma avaliação eficiente e quantitativa das alterações na expressão gênica em modelos relevantes para doenças. Este protocolo simplificado reduz a complexidade do fluxo de trabalho e o tempo de análise, apoiando a validação confiável de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de neurofarmacologia. A abordagem aprimora a tomada de decisões em portfólios ao permitir a quantificação reprodutível e escalonável de mRNA em estudos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de alterações na expressão gênica em resposta a intervenções farmacológicas.
- Apóia a validação funcional de alvos, como os receptores 5-HT2A, em regiões cerebrais relevantes para doenças.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao quantificar a modulação de mRNA após exposição ao composto.
- Melhora a confiança preditiva para o avanço de alvos neuropsiquiátricos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma leitura quantitativa e reprodutível da expressão de mRNA em cortes de tecido previamente fixados.
- Reduz o tempo de desenvolvimento do ensaio ao eliminar a necessidade de amostras frescas congeladas e sondas radioativas.
- Permite a padronização e ampliação para triagem dos efeitos de compostos na expressão gênica.
- Apóia a comparação confiável entre grupos experimentais e controles para validação de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos relevantes para doenças ao quantificar a expressão do gene-alvo em tecido cerebral após desafio com fármaco.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, utilizando amostras prefixadas amplamente disponíveis.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em desfechos moleculares quantitativos.
- Fornece dados de biomarcadores translacionais para modulação da via serotoninérgica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir análise rápida e quantitativa da expressão gênica em tecidos prefixados com paraformaldeído, apoiando tanto a validação de alvos quanto estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias ao medir alterações no mRNA após intervenção farmacológica.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas padronizadas e reprodutíveis, adequadas para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece quantificação digital de sinais de mRNA utilizando o ImageJ, apoiando comparações estatísticas robustas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações moleculares a fenótipos relevantes para doenças em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo amplamente aplicável para análise de expressão gênica em programas de P&D em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho com sondas não radioativas e compatibilidade com tecidos pré-fixados.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de avançar ou interromper projetos e uma gestão de portfólio eficiente em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em neurofarmacologia.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de tecidos, no design de sondas e na análise digital de imagens.
- Requer acesso a estufas de hibridização, sistemas de imagem e software analítico, como o Image J.
- Exige padronização entre equipes para quantificação e interpretação de dados reprodutíveis.
- Adaptável a diversos alvos gênicos e regiões cerebrais utilizando sondas oligonucleotídicas validadas.
- Limitado a tecidos previamente fixados com paraformaldeído; não adequado para todos os métodos de preservação de tecidos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Dehydration and Pretreatment
3:32
Hybridization and Amplification
5:35
Signal Detection
6:20
Image Particle Analysis
7:31
Results: A Light Microscopic View of Hybridization Signals and the Effect on Hypothalamic htr2a Expression in Rats Treated with MDMA
8:16
Conclusion
