Name: Rápido In Situ A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a hibridização in situ rápida em tecido cerebral prefixado com paraformaldeído usando sondas oligonucleotídeas. Este método simplificado detecta o gene htr2a em ratos, reduzindo o tempo de processamento para menos de dois dias.

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Este estudo foi apoiado pela concessão NIH (R15DA029863), a concessão Florida Atlantic University iniciação científica (M30014) e da Escola de Medicina Veterinária bolsa de investigação da Universidade Ross. Gostaríamos de agradecer ao Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (Rockville, MD) para fornecer (±) 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabalho.

Procedimentos de uso de animais descritos abaixo foram aprovados pelo o cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Ross e Florida Atlantic University. Embora são necessárias técnicas e luvas estéreis, o ambiente livre de RNase não é necessário ao usar este protocolo. 1. Preparação <ol><li> Preparação de tecidos e de seccionamento <ol><li> Atribuir ratos aleatoriamente em três grupos: fresca / salina (SAL; 0,9% NaCl), prefixados / SAL e prefixados / 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA; veja detalhes na Tabela 1). </li><li> Administrar três doses de 1 ml / kg de Sal e de 10 mg / kg por via intraperitoneal MDMA, respectivamente, para os grupos SAL e MDMA no intervalo de 2 h. Permitir que os animais sobrevivem ao tratamento durante 6 dias. </li><li> No dia 7, administrar 100 mg / kg de cetamina em combinação de 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente aos ratos para uma anestesia profunda (ou seja, perda de piscar da córnea e TAil beliscar reflexos). </li><li> Para o grupo fresco / SAL, decapitar ratos e remover rapidamente o cérebro para o teste de cérebro fresco (ver detalhes na referência 5). </li><li> Para os grupos / MDMA prefixados / SAL e prefixadas, faça um corte ao longo do esterno de cerca de 10 -12 cm e, em seguida, expor a extremidade do esterno. </li><li> Segurar o final do esterno com uma pinça hemostática e cortar o diafragma lateralmente em ambos os lados com uma tesoura afiada e em seguida cortado para cima entre as nervuras e paralelo para os pulmões. </li><li> Com uma mão, segure a ponta ventral do coração com pequenas pinças. Com a outra mão, perfurar o ventrículo esquerdo com 18 G agulha de seringa (observe o lado do adaptador da agulha está conectada com uma mangueira de silicone em forma de Y para o Sal e paraformaldeído recipientes geladas e bombas peristálticas, ver a referência 9). </li><li> Ligar a bomba de SAL ao nível médio do caudal (~ 5 ml / min) e punção do átrio direito com a pinça para permitir o escape de retorno circlação. Manter SAL perfusão durante 30 minutos. </li><li> Ligar a bomba de paraformaldeído a nível médio e permitir que o paraformaldeído a 4% em gelo para perfundir o animal durante 30 min. </li><li> Remover instrumento perfusão e decapitar o animal. Adicione uma póstero corte através da linha média do crânio, e, em seguida, a aba do crânio para expor a cavidade do crânio 10. </li><li> Remover o cérebro com uma espátula a partir da cavidade do crânio e colocar o cérebro em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de paraformaldeído a 4%. Mantenha o cérebro dentro do tubo contendo paraformaldeído a 4 ºC geladeira por 24 horas. </li><li> Mover o cérebro para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de solução de sacarose a 30% a 4 ° C durante 3 dias. Finalmente, armazenar o cérebro dentro de sacos de plástico a -80 ° C até utilização. </li><li> Monte o cérebro em um mandril com a mídia de incorporação e congelar os meios de comunicação incorporação contendo cérebro em um criostato à temperatura de -26 ºC. Corte o congelou frescoN cérebro em 20 um secções do cérebro e paraformaldeído prefixado em secções de 10 um. Transfira a seção para uma lâmina de microscópio RT tocando o slide para a seção. </li><li> Ar seco à TA durante 4 h. Armazenar as lâminas secção de um saco estanque selado a -80 ° C até utilização. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Tome slides da freezer -80 ° C e atribuir seções em um dos três testes: HT2A, PPIB (controle positivo) ou dapB (controle negativo); marca e seções de etiqueta com uma caneta esferográfica (não use um lápis). Submerge lâminas em 100% de álcool à temperatura ambiente durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 5 min numa hotte. </li></ol></li><li> Pré-tratamento <ol><li> Pipetar 20 ul de reagente de Pré-tratamento (1-inactivação de fosfatase alcalina) para as secções em lâminas. Colocar as lâminas em um trilho da cremalheira num tabuleiro de humidade (note que o tabuleiro é coberto com uma tampa para manter uma elevada humidade para evitar a evaporação a partir da reacção solution). </li><li> Agite suavemente a bandeja de umidade num agitador horizontal a uma velocidade baixa para 10 min. Lavar as lâminas duas vezes com água bidestilada (ddH2O) durante 2 min. Mergulhe o slide em uma proveta de 200 ml contendo 150 ml da pré-tratamento-2 reagente (quebra das ligações cruzadas induzidas pela fixação paraformaldeído). Ferver as lâminas por um total de 5 min a 100 ° C (restauração induzida pelo calor da estrutura de ARN 11). </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min. Colocar as lâminas em álcool a 100% durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 5 min no exaustor de fumos. Utilize uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em torno da área seleccionada na secção de tecido (por exemplo, estruturas não-corticais, incluindo tálamo e hipotálamo, conforme descrito na Figura 2). </li><li> Pipeta 10 ml de reagente pré-tratamento-3 (aumentos na penetração de sonda) para cada área selecionada, e cobrir a bandeja de umidade com a tampa. Coloque a bandeja no forno de hibridaçãoequipado com o agitador horizontal e ajustar a temperatura do forno a 40 ° C; agitar suavemente a bandeja para 30 min. Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min. </li></ol></li></ol> 2. A hibridação e amplificação <ol><li> Pipeta 10 ml de HTR2A, PPIB e dapB reagentes de sonda, respectivamente, nas áreas selecionadas. Cobrir a bandeja de humidade com a tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite no agitador horizontal definida em uma velocidade baixa. Incubar as lâminas a 40 ° C no forno durante 2 horas. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul do reagente de amplificação-1 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-2 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes wom um tampão de lavagem por 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-3 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul da amplificação 4-reagente sobre cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul da amplificação 5-reagente sobre cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-6 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 15 min. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. </li></ol> 3. Detecção de Sinais <ol><li> Pipetar 10 ul do reagente Vermelho para cada área seleccionada (Note-se que o reagente é uma mistura de vermelho e vermelho-B-A com uma proporção de 1:60 e deve ser utilizado immediately). Coloque o slide na bandeja de umidade no agitador horizontal à TA e agitar suavemente a uma velocidade baixa para 10 min. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com (ddH2O), durante 10 min. Seque as lâminas a 60 ºC no forno por 15 min. Colocar as lâminas em xileno sob o exaustor durante 5 min. Pipetar 20 ul de meio de montagem à base de xileno em cada área seleccionada e cobrir com uma lamela. </li></ol> Captura 4. Imagem <ol><li> Tome microfotografias digitais das áreas selecionadas (por exemplo, o hipotálamo, Figuras 1 e 3) com uma ampliação de 4 × e 20 × lentes objetivas. Salve o arquivo de imagem. </li></ol> Análise de Partículas 5. Imagem <ol><li> Arraste e solte o arquivo de imagem para a janela ImageJ principal. Vá para a barra de menu e selecione &#39;Imagem&#39;, próxima escolha &#39;Tipo&#39; a partir do menu drop-down e selecione &#39;8-bit&#39;. </li><li> Selecione &#39;Ajustar&#39;, em seguida, selecione &#39;Threshold &#39;para abrir a caixa de diálogo. Ajuste o valor da barra inferior da caixa de diálogo para que o fundo não desejado é removido. Vá para a barra de menu e selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, selecione &quot;Analisar Partículas &#39;para abrir uma segunda caixa de diálogo. </li><li> Defina o tamanho de partícula de 10, ao lado selecione &quot;Show apresenta &#39;e selecione&#39; Mostrar resultados&quot; e &quot;caixas Resumir&quot;. Por fim, clique em &#39;OK&#39; para ver os dados de partículas nas caixas de diálogo. </li></ol> 6. Planilha de Cálculo <ol><li> Entre os dados para a folha de Excel e calcular a média dos números de partículas no grupo SAL como uma linha de base. Calcula-se a percentagem do nível de cada secção e fazer um gráfico em conformidade (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
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<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma das principais preocupações do teste de hibridização in situ é escolher técnicas apropriadas usadas para preservação de RNA por causa das enzimas RNase. É bem sabido que essas enzimas estão amplamente presentes nas células e no ambiente, o que pode afetar os resultados. No entanto, a atividade enzimática pode ser rapidamente distinguida pela colocação do tecido na solução de gelo seco/álcool5,12. Embora a preservação rápida seja crítica para a hibridização usando uma ribossonda13, pouco...

A síndrome da serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) é um distúrbio neurológico agudo causado por drogas promotoras de 5-HT, como antidepressivos1, enquanto também ocorre em situações de uso de MDMA para fins recreativos2. Os mecanismos moleculares responsáveis por alterações de humor, déficits de aprendizagem e memória que ocorrem em associação com a síndrome aguda não são bem compreendidos3,4. A hibridização in situ é uma poderosa ferramenta de pesquisa que permite a detecção e quantificação de mRNAs específicos expressos potencialmente em um único nível de célula. A maneira convencional de realizar a hibridização in situ é utilizar uma ribossonda marcada com radioatividade que hibridiza especificamente o gene de interesse. No entanto, uma grande desvantagem é que o método requer etapas complicadas e demoradas de preparação e hibridização da sonda, bem como acesso a tecidos frescos congelados mantidos em um ambiente livre de RNase5,6. 
As sondas de oligonucleotídeos foram recentemente desenvolvidas para hibridizar fragmentos de RNA mais curtos do que os necessários para ribofróides7. Além disso, as sondas produzem um sinal de fundo baixo sem sacrificar a especificidade8. Esta tecnologia de sonda recém-desenvolvida pode ser usada em hibridização in situ em tecidos cerebrais prefixados com paraformaldeído, comumente disponíveis em laboratórios imunocitoquímicos.
Aqui, descrevemos um protocolo para hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos em cérebro de rato com prefixo de paraformaldeído e comparamos os achados com os observados em um cérebro fresco congelado5,6. Este protocolo é usado para testar a hipótese de que o abuso de substâncias MDMA causa alterações no gene do receptor 5-HT2A htr2a mRNA no cérebro. Iniciou-se o procedimento com tratamento com MDMA seguido de perfusão tecidual com paraformaldeído do animal, hibridização in situ da sonda thr2a e análise dos dados. Observe que dapB (o gene bacteriano que codifica a dihidrodipicolinato redutase) é usado como controle negativo e o ppiB (gene de manutenção que codifica a peptidilprolil isomerase B) como controle positivo.

<table><tbody><tr><td>Sonda de controle negativo RNAscope-DapB</td><td>Diagnóstico celular avançado, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pré-tratamento 4</td><td>Diagnóstico celular avançado, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Kit de reagentes - Vermelho</td><td>Diagnóstico avançado de células, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope - Rn-Ppib</td><td>Diagnóstico celular avançado, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rat Htr2a</td><td>Diagnóstico celular avançado, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Agitador horizontal</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus lâmina de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido<em&gt; in situ</em&gt; a hibridação usando sondas oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Metilenodioximetanfetamina (MDMA; ecstasy) a toxicidade pode causar alterações específicas da região na expressão do mRNA serotoninérgico devido à síndrome aguda da serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT). Essa hipótese pode ser testada usando hibridização in situ para detectar o gene do receptor de serotonina 5-HT2A htr2a. No passado, esses procedimentos, utilizando ribossonda radioativa, eram difíceis devido ao fluxo de trabalho complicado que precisa de vários dias para ser executado e à dificuldade adicional de que a técnica exigia o uso de tecidos frescos congelados mantidos em um ambiente livre de RNase. Recentemente, o desenvolvimento de sondas curtas de oligonucleotídeos simplificou os procedimentos de hibridização in situ e permitiu o uso de seções cerebrais prefixadas com paraformaldeído, que estão mais amplamente disponíveis em laboratórios. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado usando sondas de oligonucleotídeos não radioativos nos tecidos cerebrais prefixados. As sondas de hibridização usadas para este estudo incluem dapB (um gene bacteriano que codifica a dihidrodipicolinato redutase), ppiB (um gene de manutenção que codifica a peptidilprolil isomerase B) e htr2a (um gene de serotonina que codifica os receptores 5-HT2A). Este método é relativamente simples, barato, reproduzível e requer menos de dois dias para ser concluído.

Utilizando as sondas de ARN de oligonucleótidos (&lt;25 NT), a hibridação pode ser detectada como pontos vermelhos em células hipotalâmicas preparados a partir dos cérebros congelados prefixado-paraformaldeído e frescas. As moléculas de mRNA HTR2A estão presentes em algumas células (indicadas pelas setas sólidas), mas não outros (setas abertas). Observou-se que não existe qualquer diferença entre o os tecidos congelados frescos-prefixo e paraformaldeído (Figura 1). Uma hibridização bem sucedida...

Este protocolo descreve um método de hibridização in situ rápido e simplificado, ideal para cérebro com prefixo de paraformaldeído, reduzindo assim a necessidade de etapas complexas prolongadas ao usar tecidos frescos congelados. O método é validado usando a identificação do gene do receptor de serotonina 5-HT2A htr2a em ratos.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma hibridização in situ rápida em tecido cerebral previamente fixado com paraformaldeído. Isso é realizado primeiramente desidratando cortes de tecido cerebral e tratando os cortes com os reagentes de pré-tratamento um, dois e três. O segundo passo é hibridizar os cortes com sondas oligonucleotídicas primárias e, em seguida, com as sondas segunda, terceira e quarta.Em seguida, adicione o substrato vermelho rápido para detectar o RNA alvo. O passo final é quantificar o nível de sinais de mRNA com o software Image J. Por fim, as alterações na expressão gênica de RNA podem ser obtidas comparando os grupos experimental e controle.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela é relativamente simples, barata, reprodutível e leva menos de dois dias para ser concluída. Este trabalho foi desenvolvido por mim e por John Jay Lenan da Escola de Medicina Veterinária da Ross University e por Jean Soza e RU Tao do Colégio de Medicina da Florida Atlantic University. Neste procedimento, retire quatro lâminas de caixas de lâminas de microscópio armazenadas no congelador a menos 80 graus Celsius.Atribua as seções aos testes de P-P-I-B-D-A-P-B e HT dois genes A marcados e rotule-os com uma caneta esferográfica. Em seguida, mergulhe as lâminas em álcool a 100% à temperatura ambiente por cinco minutos. Depois, seque as lâminas por cinco minutos na cabine de exaustão; pipete 20 microlitros do reagente de pré-tratamento um para cada seção e coloque as lâminas sobre um suporte em uma bandeja úmida.Agite suavemente a bandeja de umidade em um agitador horizontal em baixa velocidade por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com água destilada duplamente por dois minutos. Mergulhe as lâminas em um béquer de 1000 mililitros contendo 450 mililitros do reagente de pré-tratamento dois.Em seguida, aqueça as lâminas por um total de cinco minutos a 100 °C para restaurar a estrutura do RNA. Depois disso, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos cada vez. Coloque as lâminas em álcool a 100% por cinco minutos.Em seguida, seque as lâminas por cinco minutos. Na câmara de exaustão, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da área selecionada na seção do tecido. Posteriormente, pipete 10 microlitros do reagente de pré-tratamento três para cada área selecionada para aumentar a penetração da sonda e cubra a bandeja de umidade com uma tampa.Em seguida, coloque a bandeja no forno de hibridização equipado com agitador horizontal. Ajuste a temperatura do forno para 40 graus Celsius e agite suavemente a bandeja por 30 minutos. Posteriormente, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos cada vez. Nesta etapa, pipete 10 microlitros da sonda P-P-I-B-D-A-P-B ou HTR dois A nas áreas selecionadas.Em seguida, cubra a bandeja de umidade com uma tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite suavemente as lâminas no agitador horizontal em baixa velocidade, incubando-as a 40 graus Celsius no forno durante duas horas. A seguir, lave as lâminas duas vezes com o tampão de lavagem por dois minutos cada vez, pipetando 10 microlitros do reagente de amplificação um em cada área selecionada.Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem durante dois minutos cada vez, pipete 10 microlitros do reagente de amplificação dois em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, lave as lâminas duas vezes com o tampão de lavagem durante dois minutos. A cada vez, pipete 10 microlitros do reagente de amplificação três em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, lave as lâminas duas vezes com o tampão de lavagem durante dois minutos. Pipete 10 microlitros do reagente de amplificação quatro em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, lave as lâminas duas vezes com o tampão de lavagem por dois minutos. Pipete 10 microlitros do reagente de amplificação cinco em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas à temperatura ambiente por 30 minutos.Posteriormente, lave as lâminas duas vezes com o tampão de lavagem durante dois minutos. Pipete 10 microlitros do reagente de amplificação seis em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas à temperatura ambiente por 15 minutos.Em seguida, lave as lâminas novamente duas vezes com o tampão de lavagem por dois minutos cada vez. Agora, pipete 10 microlitros do reagente vermelho para cada área selecionada, coloque as lâminas na bandeja umedecida sobre o agitador horizontal à temperatura ambiente e agite suavemente em baixa velocidade por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com água destilada duplamente por 10 minutos.A cada vez, seque as lâminas a 60 graus Celsius em estufa por 15 minutos. Em seguida, coloque as lâminas em xilol na capela por cinco minutos. Depois, pipete 20 microlitros de meio de montagem à base de xilol em cada área selecionada e cubra com uma lamínula.Nesta etapa, arraste e solte o arquivo de imagem na janela principal da imagem J. Vá até a barra de menu e selecione imagem. Em seguida, selecione tipo no menu suspenso e escolha oito bits.Em seguida, selecione ajustar e depois selecione limite para abrir a caixa de diálogo. Ajuste o valor da barra inferior na caixa de diálogo para que o fundo indesejado seja removido. Vá até a barra de menu e selecione Analisar, depois selecione analisar partículas para abrir uma segunda caixa de diálogo.Defina o tamanho da partícula para 10. Em seguida, selecione mostrar contornos e selecione exibir resultados e resumir caixas. Por fim, clique em ok para visualizar os dados das partículas nas caixas de diálogo.Para o cálculo em planilha, insira os dados na planilha do Excel e calcule a média do número de partículas no grupo salino como linha de base. Em seguida, calcule o nível percentual de cada seção e crie um gráfico conforme apropriado. Abaixo estão as vistas ao microscópio óptico dos sinais de hibridização indicados pelos pontos vermelhos.Os tecidos foram previamente fixados com paraformaldeído em ratos profundamente anestesiados, previamente tratados com solução salina e MDMA. As sondas de oligonucleotídeos utilizadas são D-A-P-B-P-P-I-B e HT dois A. Esta figura mostra o efeito sobre a expressão gênica hipotalâmica de HT dois A em ratos previamente tratados com MDMA, sendo observada uma redução de 20% na expressão de HT dois A. Esta técnica facilita para pesquisadores da área de neurociência a medição da expressão gênica de mensageiros de R a, utilizando a hibridização in situ em tecido cerebral previamente fixado com paraformaldeído.

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Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Este vídeo demonstra a detecção da síntese de RNA do receptor de serotonina usando sondas de oligonucleotídeos no tecido cerebral de ratos afetado pela síndrome da serotonina. O protocolo inclui pré-tratamento de tecido, hibridização por sonda e detecção enzimática para visualizar e quantificar a expressão do RNA do receptor de serotonina ao microscópio.

Hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos para estudar a expressão de RNA em seções cerebrais de ratos

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinando hibridização de fluorescência dupla  in situ com imunomarcação para detecção da expressão de três genes em seções cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra o uso de hibridização in situ de fluorescência dupla para visualizar a expressão de dois alvos de RNA em seções cerebrais de camundongos. O protocolo envolve a detecção sequencial de RNA usando sondas marcadas com isotiocianato de fluoresceína e digoxigenina, seguida de...

 Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Aplicamos estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr) no hemisfério unilateral do cérebro de ratos, colocando uma bobina de 25 mm em forma de 8 1 cm lateral ao vértice da linha biauricular e angulando a bobina em 45°. Um sistema interno de resfriamento de água foi usado para rTMS por mais de 20 min.

Estimulação Magnética Transcraniana repetitiva para o Hemisfério unilateral do cérebro de rato

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Estabelecemos um ensaio de hibridização in situ Duplex para mapear as isoformas do receptor de insulina IR-A e IR-B no plexo coróide murino, superando as limitações dos métodos tradicionais. Essa abordagem de alta resolução revela a expressão específica da isoforma, oferecendo novos insights sobre a sinalização da insulina cerebral e possíveis terapias direcionadas à isoforma para distúrbios neurológicos.

Visualização precisa dos receptores de insulina A e B no cérebro murino com um ensaio de hibridização in situ de RNA

Aprenda a hibridização in situ rápida em tecido cerebral prefixado com paraformaldeído usando sondas oligonucleotídeas. Este método simplificado detecta o gene htr2a em ratos, reduzindo o tempo de processamento para menos de dois dias.

Rápido In Situ A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica (Vídeo) | JoVE Journal

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