Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca 2+ E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos
10 de setembro de 2015
Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.
O objetivo geral deste procedimento é mapear simultaneamente opticamente o retículo intrasarcoplasmático livre, o cálcio e o potencial transmembrana no coração de coelho perfundido com LOR isolado intacto. Isso é feito primeiro excisando o coração do coelho e canulando a aorta para perfusão retrógrada do lanor. O segundo passo é eliminar a contração adicionando um desacoplamento da contração de excitação ao perfu oito.
Em seguida, a perfusão é comutada para uma alça de recirculação de pequeno volume e um indicador de cálcio de baixa afinidade é adicionado à temperatura ambiente. As etapas finais são aquecer o coração a 37 graus Celsius usando o loop de profusão de grande volume e adicionar o corante sensível à voltagem. Assim, durante o experimento, as mudanças no cálcio e no potencial transmembrana são medidas excitando o coração com luz azul e medindo a luz emitida com câmeras CM OS de alta velocidade.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela permite que os investigadores sondem diretamente o retículo sarcoplasmático ou SR para dinâmica curta de cálcio sem interferência de sinais de cálcio transmembrana. Este método também pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas ao papel do manuseio de cálcio SR na contribuição para arritmias, porque o potencial transmembrana é registrado simultaneamente com o cálcio SR, geralmente os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os sinais ópticos de cálcio SR são de amplitude muito baixa. Portanto, o carregamento adequado do indicador de cálcio é essencial Para este protocolo, é necessário ter à mão uma solução tyro recém-feita.
Quatro litros serão suficientes. Não misture as soluções-mãe concentradas sem diluição. Além disso, prepare as outras soluções com antecedência, conforme indicado no protocolo de texto, borbulhe o suprimento de tyros com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e ajuste o fluxo de gás para definir o pH da solução muito próximo a 7,4.
A solução deve estar à temperatura ambiente. Prepare o sistema de perfusão L andorf recirculante colocando um filtro de nylon em linha com poros de 11 mícrons para filtrar o estado de perfusão. Agora prepare o sistema de profusão principal com cerca de dois litros de tyros oxigenados.
O volume total de dois litros inclui a solução no reservatório. Em seguida, prepare e prepare uma linha de profusão curta que contorne o reservatório da solução para criar um pequeno volume de recirculação de profusão para a gripe às cinco da manhã. O download do volume total no sistema de recirculação menor deve ser de cerca de 150 mililitros.
Para preparar o sistema de monitoramento de pressão, conecte um transdutor de pressão à linha de profusão e conecte a saída do transdutor a um amplificador de ponte de transmissão. Agora ligue o sistema de aquisição de dados. Configure-o para monitorar continuamente o ECG e a pressão de profusão.
Em seguida, ajuste a pressão de perfusão da linha de base para zero milímetros de mercúrio. Por fim, alinhe a câmera de mapeamento óptico conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, prenda o coelho e anestesiá-lo com pentobarbital, juntamente com um bolus de 1000 unidades de heparina.
Cubra os olhos para acalmar o coelho. Comece com uma incisão na linha média para expor o esterno e as costelas usando uma tesoura de ponta romba. Corte o esterno entre o xifóide e o meibum.
Em seguida, abra cuidadosamente o esterno sem danificar o coração e abra as costelas para expor o coração. Em seguida, remova rapidamente todo o bloqueio coração-pulmão, cortando todos os vasos e tecidos circundantes. Transfira o bloco coração-pulmão para cerca de 100 mililitros de solução de tirano gelada.
No bloco de tecido excisado, localize a aorta e corte a aorta ascendente logo proximal aos três ramos do arco aórtico. Em seguida, canule a aorta com a cânula de oito calibres conectada ao sistema de profusão. Prenda a aorta à cânula com um pedaço de sutura de seda zero USP.
Depois de prender a cânula, disseque cuidadosamente a traqueia, os pulmões e a gordura epicárdica. Em seguida, identifique a válvula mitral e use cuidadosamente pinças afiadas e tesouras para danificar ou remover um folheto. Assim, a congestão da solução no ventrículo esquerdo não pode ocorrer.
Continue submergindo o coração na câmara de perfusão horizontalmente com o lado anterior para cima. Coloque a cânula em um pedaço de sardinha. Prenda a cânula com pinos em forma de U inseridos através do pedaço de sardinha e no fundo de silicone da placa de perfusão.
Isso impedirá que o coração se mova. Durante a imagem, um pequeno pino de inseto pode ser usado para estabilizar o ápice, se necessário, medir a quantidade de solução de tirano usada durante a canulação e substituí-la por uma solução nova para manter a solução circulante total em dois litros. Agora mergulhe totalmente os eletrodos de ECG no banho em ambos os lados do coração, mas não em contato com o coração.
Em seguida, verifique se isso torna uma morfologia normal de ECG de uma derivação. Enquanto isso, mantenha a pressão aórtica em 60 a 70 milímetros de mercúrio, ajustando o fluxo de perfusíveis entre 25 e 35 mililitros por minuto. Agora, desligue as luzes da sala e adicione 0,3 a 0,6 mililitros de solução estoque de estatina BLEs ao PERFU oito para uma concentração final de 10 a 20 micromolares.
Após 10 a 15 minutos, as contrações cardíacas devem parar. Em seguida, mude para o sistema de profusão de pequeno volume. Uma das chaves para o sucesso da imagem de cálcio SR é o carregamento adequado do corante de fluxo de cinco N am.
Isso requer uma perfusão de pequeno volume para atingir alta concentração de corante e condições de temperatura ambiente. Para evitar a esterificação D do D no citosol, Agora prepare 500 microlitros de solução de carga flu O five N am e misture-a com 500 microlitros de solução rodoviária. Em seguida, adicione-o ao PERFU oito.
Deixe o download prosseguir por 45 minutos e, em seguida, ligue o banho-maria circulante para aquecer o sistema a 37 graus Celsius. Após uma hora de download, volte para o volume maior do Perfu oito. Em seguida, misture 50 microlitros do corante sensível à voltagem RH 2 37 em um mililitro de tiros quentes.
Injete lentamente no sistema por cerca de cinco minutos e prossiga com o mapeamento óptico do coração. Para começar, focalize as câmeras de mapeamento óptico no campo apropriado para reduzir o movimento na superfície PERFU oito. Flutue uma lamínula sobre a solução.
Agora ajuste o feixe de luz LED para fornecer iluminação uniforme ao coração. Para cada gravação óptica, defina o protocolo de estimulação desejado. Acenda a luz de excitação e colete de um a quatro segundos de dados dentro de uma a duas horas.
O ruído do corante vazado colocará um fim ao experimento. Em seguida, lave o sistema com água deionizada. Em seguida, etanol 70% e finalize com outro enxágue de água deionizada.
Usando o protocolo descrito, a separação espectral do sinal do potencial transmembrana e do retículo sarcoplasmático ou sinal de cálcio SR pode ser separada. Traços ópticos durante a estimulação contínua também foram registrados. Os mapas de ativação foram então construídos a partir dos dados, traçando o tempo de ativação de cada pixel.
Em um gráfico isócrono, há um atraso típico de oito a 10 milissegundos entre os dois sinais. Foi possível quantificar a mudança relativa na RS diastólica. Carga de cálcio e amplitudes de liberação de cálcio SR sistólica em vários ciclos de estimulação. O manuseio patológico do cálcio SR foi observado após a aplicação do agonista do receptor beta adrenérgico isoproterenol.
As setas vermelhas apontam para um vazamento claro de cálcio do sr. Nessas condições, pode ocorrer o desencadeamento de potenciais de ação mediado por cálcio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como realizar o mapeamento óptico simultâneo do potencial transmembrana e dos sinais de cálcio SR no coração de coelho Lang Endorf Perfused intacto.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para o mapeamento óptico duplo do potencial transmembranar e do cálcio livre no retículo sarcoplasmático intracelular no coração de coelho perfundido por Langendorff. Este método permite a observação direta e a quantificação dessas dinâmicas no coração intacto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia Cardiovascular
- Técnicas de Imagem Óptica
Fundamentos
- Entender a dinâmica cardíaca é crucial para estudar a função do coração.
- O potencial transmembranar e os níveis de cálcio são indicadores-chave da saúde cardíaca.
- O mapeamento óptico fornece um método não invasivo para estudar esses parâmetros.
- A técnica de perfusão de Langendorff permite estudos de coração isolado.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método para o mapeamento óptico simultâneo de V m e SR Ca 2+.
- Aprimorar a compreensão da eletrofisiologia cardíaca.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores na área.
Métodos Utilizados
- Excisionar o coração de coelho e canular a aorta para perfusão retrógrada.
- Usar um desacoplador de excitação-contração para eliminar a contração.
- Mudar para um loop de perfusão recirculante com um indicador de cálcio de baixa afinidade.
- Aquecer o coração e adicionar um corante sensível a voltagem para mapeamento óptico.
Principais Resultados
- Medição simultânea bem-sucedida da dinâmica de V m e SR Ca 2+.
- Demonstrou a eficácia da técnica de mapeamento óptico.
- Forneceu insights sobre a relação entre cálcio e potencial transmembranar.
- Estabeleceu um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- A técnica de mapeamento óptico duplo é eficaz para estudar a dinâmica cardíaca.
- Este método pode avançar a pesquisa em fisiologia cardíaca.
- Aplicações futuras podem incluir estudos sobre doenças cardíacas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables direct, simultaneous measurement of intra-sarcoplasmic reticulum calcium and transmembrane potential in intact cardiac tissue, providing mechanistic insight into excitation-contraction coupling and arrhythmogenic substrates. By resolving spatial and temporal dynamics of SR Ca2+ handling in a physiologically relevant model, it supports target validation and de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges molecular mechanisms with tissue-level phenotypes, enhancing predictive confidence in preclinical safety and efficacy assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying SR Ca2+ load and release dynamics under pathophysiological stress, such as beta-adrenergic stimulation.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in calcium handling, reducing mechanistic ambiguity in early target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with dual-readout capability for assessing compound effects on both electrophysiology and calcium homeostasis.
- Operational Value: Supports assay standardization through simultaneous Vm and SR Ca2+ monitoring, improving reproducibility in ion channel and calcium modulator screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links molecular perturbations to tissue-level arrhythmogenic phenotypes, enabling disease-relevant system modeling for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying pro-arrhythmic signals early in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical safety profiling, particularly for compounds affecting cardiac ion channels or calcium regulatory proteins.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing bidirectional relationships between Vm and SR Ca2+ under pacing and pharmacological challenge.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs that allow comparison of test compounds against control conditions in a standardized format.
- Analytics: Provides high-resolution spatiotemporal measurements of calcium transients and action potential dynamics, enabling comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Connects findings to preclinical continuity by modeling arrhythmogenic substrates observed in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety pharmacology and mechanism-of-action studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of SR Ca2+ handling and its electrophysiological consequences.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via dual-parameter optical mapping in a controlled Langendorff-perfused system.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by detecting calcium-mediated arrhythmogenic triggers before costly late-stage failures.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on SR calcium stability and transmembrane stability.
Implementation Considerations
- Expertise in optical mapping, perfusion techniques, and fluorescent dye handling is required for successful signal acquisition.
- Instrumentation includes high-speed CMOS cameras, LED excitation systems, and perfusion setups capable of recirculating and large-volume modes.
- Cross-team standardization depends on consistent dye loading, temperature control, and pacing protocols across laboratories.
- Adaptation to other model systems (e.g., rat, human tissue) may require optimization of indicator concentration and perfusion parameters.
- Practical limitations include low signal amplitude of SR calcium indicators, necessitating careful dye loading and minimization of cytosolic interference.
