Name: Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 28 s
Description: Aprenda a quantificar o recrutamento de células tumorais nos pulmões em modelo animal de metástase. Este método permite investigar os mecanismos moleculares da progressão do câncer in vivo.

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Todos os procedimentos realizados com ratos foram aprovados pela Universidade de medicina Animal pesquisa Comitê de Tóquio feminino.
1. cauda veia injeção de células de Carcinoma (LLC) pulmão de Lewis
<ol><li>Manter as células LLC em DMEM suplementado com 10% de FCS, em um 5% umidificado incubadora de CO2 a 37 ° C. Células devem conter um sistema de expressão de proteína fluorescente (por exemplo, as boas práticas agrícolas).</li>
	<li>Remova células da placa de cultura, usando um reagente de dissociação de célula não enzimáticos. Siga o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Recolha pilhas em um tubo de 15 mL e centrifugar a 400 x g por 3 min. Ressuspender as células em 5 mL de PBS pipetando e centrifugar o tubo (400 x g, 3 min). Em seguida, remova o sobrenadante.<ol>
<li>Repita essa etapa de lavagem mais uma vez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a segunda lavagem, passar as células através de um filtro de célula (tamanho de poro de 40 µm) e ressuspender em PBS para dar uma densidade celular final de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Injete 0,1 mL da suspensão de células (1 x 105 células, agulha 29g) em cada rato C57BL/6 (machos de 8 a 10 semanas) através da veia da cauda.</li>
</ol>2. isolamento dos pulmões e contando as células sob um microscópio de fluorescência
<ol><li>Eutanásia por inalação de CO2 em ratos.</li>
	<li>Retire a pele na superfície ventral do peito com uma tesoura. Em seguida, corte as costelas e o diafragma para expor a cavidade torácica. Irrigue o PBS (100 cmH2O, total 15 mL) através do ventrículo direito com uma agulha de 25 G de infusão alado e tubulação.</li>
	<li>Corte o coração e o timo. Pega a traqueia com fórceps e puxe, dissecando os tecidos conectivos ao redor da traqueia com uma tesoura. Dissecar para fora dos pulmões e lavá-los em PBS.</li>
	<li>Separe cada lóbulo e observá-lo sob um microscópio de fluorescência.</li>
</ol>3. pulmão digestão
<ol><li>Dissolva 10 mg de colagenase, 10 mg de dispase e 10 µ g de DNase em 10 mL de DMEM isento de soro. Filtrar com um filtro de seringa de 0,22 µm para preparar a solução de digestão enzimática.</li>
	<li>Corte o lóbulo caudal isolado com uma tesoura. Coloque os pedaços de pulmão em uma seringa de 10 mL, seguida-se o êmbolo.</li>
	<li>Aspire a solução de digestão (5 mL) para a seringa puxando o êmbolo para trás. Opere o êmbolo subir e descer até o pulmão afunda-se na solução. Em seguida, coloque o buffer pulmão e digestão em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Agite o tubo durante 15 minutos a 37 ° C num agitador recíproco (150 rpm). Os pulmões podem tornar-se esfarrapado durante esta incubação.</li>
	<li>Pipete acima e para baixo até que as células do pulmão são completamente dispersos. Agite o tubo para adicional 30 min a 37 ° C num agitador recíproco (150 rpm).</li>
	<li>Passe as células de pulmão através de um filtro de célula 40 µm. Gire para baixo as células a 400 x g, durante 3 min.</li>
</ol>4. fluxo Cytometry de pulmão de células
<ol><li>Dissolva 100 mg de BSA em 10 mL de PBS e filtrar através de um filtro de seringa 0,22 µm para preparar PBS - 1% de BSA.</li>
	<li>Remover o sobrenadante da amostra obtida no passo 3.6 usando uma pipeta e adicionar 2 mL de solução de lise de células vermelhas do sangue. Em seguida, spin-down as células a 400 x g, durante 3 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de PBS - 1% de BSA pipetando e centrifugar o tubo (400 x g, 3 min). Desprezar o sobrenadante.<ol>
<li>Repita essa etapa de lavagem mais uma vez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspender as células em 1 mL de PBS - 1% de BSA e passar através de um novo filtro de célula de 40 µm.</li>
	<li>Analise as células com um citômetro de fluxo para contar as células de tumor (usando a configuração de filtro FL1 para GFP-LLC).</li>
</ol>

<ol><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li>
<li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-%CE%BAB+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li>
<li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li>
<li>Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-metastatic+niche%3A+finding+common+ground%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li>
<li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li>
<li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853(2013).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4%2FMD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li>
<li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Pré-tratamento de ratos com anticorpos, drogas, uma dieta high-fat ou tumor-condicionado médio antes da injeção de células de tumor é possível. O passo mais difícil neste ensaio é a injeção de veia de cauda. Injeção incompleta resulta em dados inconclusivos. A veia da cauda em C57BL/6 é particularmente difícil de identificar, resultando em falhadas injeções. Colocando o rato sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C) ajuda a dilata a veia da cauda para que a injeção se torna mais fácil.
Este e...

Metástase de tumor responsável por elevada mortalidade em doenças relacionadas ao câncer. Do ponto de vista das investigações a nível molecular, a metástase pode ser dividido em várias etapas: iniciação do tumor no local do tumor primário, o crescimento do tumor primário e invasão em vizinhas tecidos, intravasation, circulação através dos vasos sanguíneos , extravasamento em órgãos distantes e re-crescimento do tumor. Cada etapa envolve diferentes conjuntos de moléculas/sinais1.
Estudos até à data têm se preocupado com eventos que ocorrem em órgãos distantes, antes que as células do tumor começam circulando no sangue, o que também é conhecido como a fase pre-metastática2,3,4,5, 6. Nossos estudos de modelo de rato revelaram que a fase pré-metastática facilita a metástase do pulmão através da criação de longa duração e baixo nível de respostas inflamatórias nos pulmões. A fase pré-metastática é caracterizada por hyperpermeability de themicrovasculature, recrutamento de células derivada de medula óssea (BMDC) e upregulation das moléculas cytokine/chemokine-like, incluindo S100A8 e SAA33,4 . Tem sido relatado que lisil oxidase modifica a matriz extracelular nos pulmões para recrutar BMDCs7. Outro relatório revelou a importância da Angpt2, MMP3 e MMP10 na fase pre-metastática8. Em outras palavras, as intricadas interações entre tumores primários da medula óssea e órgãos remotos precisam ser entendido e corretamente modulada (por exemplo, usando drogas que proteínas envolvidas nessas interações de destino) para evitar futura metástase9 . Para regular a fase pré-metastática, deve primeiro ser visualizado e avaliado para intervenções de diagnósticos ou terapêuticas. Aqui, nós relatamos um ensaio de recrutamento de células do tumor pulmonar que permite o estudo da fase pré-metastático nos pulmões.
Células tumorais injetadas diretamente dentro do vaso sanguíneo do mouse são semelhantes aos circulam células tumorais em pacientes com câncer, embora possa haver diferenças entre culturas de células e células tumorais de circulação. Circulantes de células de tumor se se submeter a algumas mudanças características quando entram em circulação do tumor primário. No entanto, culturas de células podem formar tumores em camundongos imunodeficientes quando eles são injetados na veia da cauda. Além disso, no sistema modelo de rato, fluorescência rotulada células tumorais pode ser usada que permitem o acompanhamento destas células no corpo. O comportamento de células tumorais em circulação é fundamental ao determinar as consequências finais em pacientes de câncer10. Sangue não é um bom lugar para a sobrevivência de células de tumor2. Eles precisam escapar do ataque, o sistema imunológico do hospedeiro e precisar de anti-apoptotic sinais para prevenir apoptose devido a falta de suporte físico. Células tumorais com habilidades superiores de iniciação de tumor metastático locais geram mais nódulos de tumor. Se as células do tumor mostram tropismo de órgão específico, metástase deve ser observada nesses órgãos particulares. Neste ensaio, os passos iniciais da cascata metastática (invasão e crescimento do tumor primário) não estão incluídos e, portanto o foco na interação entre circulantes de células tumorais e as células do estroma (células endoteliais, células epiteliais e células do sangue). Em ensaios de injeção convencional tumor celular, pesquisadores precisa esperar até nódulos de tumor crescem para um tamanho de tangível para detectar metástase. Neste caso, não é possível quantificar o número exato de células tumorais no vaso sanguíneo. Além disso, este processo inclui uma fase de rebrota de tumor, indicando que outros fatores nas células de tumor podem afetar o resultado.
Contando rotulado células tumorais sob um microscópio de fluorescência é um processo simples. O microscópio estereoscópico fornece um amplo campo de visão, para que o pulmão inteiro pode ser digitalizado. Citometria de fluxo é também uma ferramenta útil que instantaneamente dá um número exato de células tumorais no tecido. Contar as células fluorescentes no tecido com um microscópio confocal é igualmente possível e exibe as imagens mais precisas das células do tumor metastático, mas é demorado e pode dar resultados tendenciosos se apenas uma área selecionada é contabilizada. O objetivo deste teste é observar como facilmente as células do tumor se acumular nos pulmões. Como relatado anteriormente3,4, se os pulmões estão em fase pré-metastático devido a sinalização inflamatória do tumor primário, as células do tumor injetado são propensas a se acumular nos pulmões, implicando, portanto, maiores chances de metástase pulmonar. Outras doenças (artrite reumatoide, asma, etc.) e o seu tratamento com agentes anti-inflamatórios (como o anti-TNFa) podem atenuar metástase pulmonar. Assim, podemos concluir que este ensaio é uma ferramenta poderosa para avaliar a possibilidade de metástase pulmonar.

<table><tbody><tr><td>Albumina bovina</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DPBS</td> Gibco <td>14190-144</td> do soro bovino do <td>Dispase</td>Gibco 17105-041</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> da <tr><td>colagenase</td><td></td><td></td> nenhum cálcio, nenhum tampão Sigma R7757 da lise da quantidade de traços do magnésio Deoxyribonuclease mim Sigma DN-25 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula</td><td>BD</td><td>352340</td> Kit de rotulagem de fluorescência <td>de malha de 40 micrômetros</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>MIN26-KIT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; M Filtro de Seringa</td><td>Sartorius</td><td>17597K</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>4% Solução Tampão de Fosfato de Paraformaldeído</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de recrutamento de células de tumor de pulmão

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Para investigar os mecanismos moleculares que regem a metástase do tumor, foram propostos vários ensaios usando o mouse como um animal de modelo. Aqui, demonstramos um ensaio simples para avaliar o extravasamento de células de tumor ou micrometastasis. Neste ensaio, células tumorais foram injetadas na veia da cauda, e após um curto período, os pulmões foram dissecados e digeridos para contar as células de tumor rotulado acumulada. Este ensaio ignora o passo inicial da invasão do tumor primário para os vasos sanguíneos e facilita o estudo dos acontecimentos no órgão distante, onde ocorre a metástase do tumor. O número de células injetadas dentro do vaso sanguíneo pode ser otimizado para observar um número limitado de metástases. Relatou-se que as células do estroma no órgão distante contribuem para metástase. Assim, este ensaio poderia ser uma ferramenta útil para explorar o potenciais terapêuticas drogas ou dispositivos para prevenção de metástases de tumor.

Os pulmões apresentam muitas células GFP-LLC 2 h após a injeção (figura 1A). Note-se que as manchas fluorescentes também detectadas no filtro vermelho devem ser excluídas a contagem do número de células. A grande maioria das células LLC desaparece dos pulmões 24 h após a injeção (Figura 1).
Para confirmar o número do GFP-LLC nos pulmões, um dos lóbulos pode ser usado pa...

Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia tumoral sobre os mecanismos moleculares da metástase. A principal vantagem dessa técnica é que o recrutamento de células tumorais dentro de um órgão remoto pode ser quantitado. Comece usando um reagente de dissociação celular não enzimática para remover o carcinoma pulmonar de Lewis, ou LLC, de acordo com os protocolos padrão.Transfira a solução celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros antes da centrifugação, e a centrífuga lave as pelotas duas vezes em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, filtre as células através de um coador de células poros de 40 micrômetros e dilua a suspensão para uma única vezes 10 para as seis células por concentração mililitro. Em seguida, carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha calibre 29, e injete 100 microliters de células na veia traseira de cada 8 a 10 semanas de idade, C57-Black-6, rato masculino.No ponto final experimental apropriado, use uma tesoura para remover a pele da superfície ventral de cada rato, e corte as costelas e o diafragma para expor a cavidade torácica. Use uma agulha de infusão e tubos alados de calibre 25 para lavar 15 mililitros de PBS através do ventrículo direito, e remover o coração e o timo. Agarrando a traqueia com fórceps, puxe para cima, dissecando os tecidos conjuntivos ao redor da traqueia, para colher os pulmões.Em seguida, lave os pulmões em PBS, e desprende um lobo para visualização das células fluorescentes in situ sob um microscópio de fluorescência. Para digerir o tecido pulmonar, primeiro pique o lobo caudal com uma tesoura, e coloque os pedaços de pulmão em uma seringa de 10 mililitros. Feche a seringa com o êmbolo, e aspire cinco mililitros de solução de digestão na seringa, movendo o êmbolo para dentro e para fora do eixo da seringa até que o tecido pulmonar seja disseminado em toda a solução.Distribua o chorume pulmonar em um tubo de 50 mililitros, e digerir o tecido em um agitador recíproco por 15 minutos a 37 graus Celsius e 150 rpm. No final da incubação, triturar o tecido restante até que as células pulmonares estejam completamente dispersas, e devolva o tubo ao agitador por mais 30 minutos. Em seguida, filtrar as células através de um filtro de poros de 40 micrômetros, e coletar as células por centrifugação.Para analisar as células pulmonares isoladas por citometria de fluxo, resuspensar a pelota em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por um minuto à temperatura ambiente, e coletar as células por centrifugação. Em seguida, centrifugar a pelota duas vezes em cinco mililitros de PBS fresco suplementado com 1% de gêrio bovino por lavagem. Após a segunda centrifugação, resuspenque a pelota em um mililitro de PBS fresco mais BSA, e filtre as células através de um novo filtro de poros de 40 micrômetros para quantificação das células tumorais por citometria de fluxo.Os pulmões apresentam muitas células GFP-LLC duas horas após a injeção, com a grande maioria das células desaparecendo dos pulmões dentro de 24 horas. Observe que quaisquer manchas fluorescentes detectadas dentro do filtro vermelho devem ser excluídas da contagem celular. Para confirmar o número de GFP-LLC nos pulmões, um dos lóbulos pode ser usado para análise citométrica de fluxo como demonstrado.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um procedimento de seção congelada é um método mais preciso para observar a localização exata das células tumorais.

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A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

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