Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão
26 de fevereiro de 2019
Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.
Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia tumoral sobre os mecanismos moleculares da metástase. A principal vantagem dessa técnica é que o recrutamento de células tumorais dentro de um órgão remoto pode ser quantitado. Comece usando um reagente de dissociação celular não enzimática para remover o carcinoma pulmonar de Lewis, ou LLC, de acordo com os protocolos padrão.
Transfira a solução celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros antes da centrifugação, e a centrífuga lave as pelotas duas vezes em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, filtre as células através de um coador de células poros de 40 micrômetros e dilua a suspensão para uma única vezes 10 para as seis células por concentração mililitro. Em seguida, carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha calibre 29, e injete 100 microliters de células na veia traseira de cada 8 a 10 semanas de idade, C57-Black-6, rato masculino.
No ponto final experimental apropriado, use uma tesoura para remover a pele da superfície ventral de cada rato, e corte as costelas e o diafragma para expor a cavidade torácica. Use uma agulha de infusão e tubos alados de calibre 25 para lavar 15 mililitros de PBS através do ventrículo direito, e remover o coração e o timo. Agarrando a traqueia com fórceps, puxe para cima, dissecando os tecidos conjuntivos ao redor da traqueia, para colher os pulmões.
Em seguida, lave os pulmões em PBS, e desprende um lobo para visualização das células fluorescentes in situ sob um microscópio de fluorescência. Para digerir o tecido pulmonar, primeiro pique o lobo caudal com uma tesoura, e coloque os pedaços de pulmão em uma seringa de 10 mililitros. Feche a seringa com o êmbolo, e aspire cinco mililitros de solução de digestão na seringa, movendo o êmbolo para dentro e para fora do eixo da seringa até que o tecido pulmonar seja disseminado em toda a solução.
Distribua o chorume pulmonar em um tubo de 50 mililitros, e digerir o tecido em um agitador recíproco por 15 minutos a 37 graus Celsius e 150 rpm. No final da incubação, triturar o tecido restante até que as células pulmonares estejam completamente dispersas, e devolva o tubo ao agitador por mais 30 minutos. Em seguida, filtrar as células através de um filtro de poros de 40 micrômetros, e coletar as células por centrifugação.
Para analisar as células pulmonares isoladas por citometria de fluxo, resuspensar a pelota em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por um minuto à temperatura ambiente, e coletar as células por centrifugação. Em seguida, centrifugar a pelota duas vezes em cinco mililitros de PBS fresco suplementado com 1% de gêrio bovino por lavagem. Após a segunda centrifugação, resuspenque a pelota em um mililitro de PBS fresco mais BSA, e filtre as células através de um novo filtro de poros de 40 micrômetros para quantificação das células tumorais por citometria de fluxo.
Os pulmões apresentam muitas células GFP-LLC duas horas após a injeção, com a grande maioria das células desaparecendo dos pulmões dentro de 24 horas. Observe que quaisquer manchas fluorescentes detectadas dentro do filtro vermelho devem ser excluídas da contagem celular. Para confirmar o número de GFP-LLC nos pulmões, um dos lóbulos pode ser usado para análise citométrica de fluxo como demonstrado.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um procedimento de seção congelada é um método mais preciso para observar a localização exata das células tumorais.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células tumorais nos pulmões em um modelo animal de metástase tumoral. Esta técnica permite a quantificação do recrutamento de células tumorais em um órgão distante, fornecendo insights sobre os mecanismos moleculares da metástase.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Compreender a metástase tumoral é fundamental para a pesquisa sobre câncer.
- A quantificação do acúmulo de células tumorais pode revelar informações biológicas importantes.
- O uso de modelos animais é comum no estudo da progressão do câncer.
- Células que expressam proteínas fluorescentes facilitam o rastreamento e a quantificação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para quantificar o acúmulo de células tumorais nos pulmões.
- Investigar o recrutamento de células tumorais em um modelo metastático.
- Ampliar a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à metástase.
Métodos Utilizados
- Utilização de um reagente de dissociação celular não enzimático.
- Centrifugação e lavagem dos pellets celulares em PBS.
- Filtração das células através de um filtro celular com poros de 40 micrômetros.
- Injeção da suspensão celular diluída na veia da cauda de camundongos.
Principais Resultados
- O método permite a quantificação eficaz do acúmulo de células tumorais.
- Demonstrou a viabilidade de rastrear células tumorais in vivo.
- Forneceu informações sobre a dinâmica do recrutamento de células tumorais.
- Contribuiu para a compreensão dos processos metastáticos.
Conclusões
- Este método é uma ferramenta valiosa para o estudo da biologia tumoral.
- Ele aumenta a capacidade de investigar metástase em modelos animais.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica para explorar alvos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio permite a avaliação quantitativa do recrutamento de células tumorais para órgãos distantes, auxiliando na redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos direcionados à metástase. Ao contornar as etapas de invasão do tumor primário, ele se concentra nas interações estromais e nos eventos de extravasamento essenciais para a validação pré-clínica de alvos. O método fornece uma leitura reprodutível e escalonável para avaliar compostos anti-metastáticos in vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas sobre as contribuições do estroma para a metástase em órgãos distantes.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos ao quantificar o acúmulo de células tumorais nos pulmões após injeção.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao medir os efeitos do composto sobre a dinâmica de recrutamento de células tumorais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Produz saídas padronizadas e quantitativas por citometria de fluxo para campanhas de triagem de compostos.
- Reprodutibilidade: Utiliza concentrações definidas de células e volumes de injeção para garantir modelagem consistente da metástase.
- Escalabilidade: Compatível com processamento em múltiplas poças e análise de alto conteúdo para desvio de risco de alvo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela micrometástases pulmonares para estudar mecanismos de colonização específicos de órgãos.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica de agentes anti-metastáticos.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de prosseguimento ou interrupção com base na redução da contagem de células tumorais marcadas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posições dentro do continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a otimização do composto líder, permitindo a avaliação quantitativa de compostos que modulam metástase.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação mecanicista das interações tumor-estroma em nichos metastáticos.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas baseadas em fluorescência para validação de alvos em ensaios de metástase.
- Análises: Gera dados quantificáveis de células tumorais por citometria de fluxo para análise de resposta à dose e análise estatística.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se a estratégias de biomarcadores por meio do rastreamento da disseminação de células marcadas in vivo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudos cruzados de mecanismos de metástase.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas vias de metástase por meio do recrutamento quantificável e específico por órgão.
- Valor Operacional: Padroniza a entrega de células tumorais e o processamento de tecidos para comparações reprodutíveis entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em terapêuticas direcionadas à metástase.
- Impacto no Portfólio: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados pré-clínicos de supressão de metástase.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em injeção na veia da cauda de camundongos e técnicas de dissociação de tecidos.
- Depende de instrumentação de citometria de fluxo e controles de compensação de fluorescência.
- Necessita de protocolos padronizados de preparação de células entre equipes de pesquisa.
- Envolve a otimização da dose celular para evitar sinais confundidores decorrentes do acúmulo excessivo no pulmão.
- Limita-se à quantificação do acúmulo pulmonar; não captura a invasão do tumor primário nem o crescimento metastático posterior.
