Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando queratinócitos derivados do cabelo. Isso é feito isolando primeiro os cabelos de um doador. O segundo passo é colocar placas nos pelos para facilitar o crescimento dos queratinócitos.

Em seguida, os queratinócitos são mantidos e expandidos in vitro. A etapa final é reprogramar os queratinócitos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um método de reprogramação episômica. Em última análise, as células IPS humanas podem ser isoladas e caracterizadas usando imuno-histoquímica para mostrar a expressão de marcadores pluripotentes.

A vantagem geral deste método sobre os métodos existentes, como o método retroviral ou lentiviral, é que, ao usar o fator epissómico, estamos evitando transgenes indesejáveis. A integração no genoma nas células-tronco que são geradas Comece descongelando um frasco de solução de matriz extracelular no gelo durante a noite. Na manhã seguinte, use ponteiras de pipeta pré-resfriadas para adicionar 200 microlitros da solução a 12 mililitros de meio DM F 12 resfriado.

Adicione um mililitro da solução diluída da matriz extracelular a cada poço de um 12. Poço e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius para revestir os poços com matriz. Em seguida, colete o cabelo humano primário da cabeça do doador, colocando os dedos perto da raiz do cabelo e arrancando o cabelo em um movimento rápido e suave.

Verifique se cada cabelo coletado contém um folículo piloso intacto. Coloque o folículo sob um microscópio de dissecação e determine a fase de crescimento de cada cabelo. Colete de cinco a 10 pêlos de antígeno de cada indivíduo para extrair gelo queratinoso.

A fase do antígeno, ao contrário da fase T, contém várias camadas de epitélio. Coloque as amostras de cabelo em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de uma mistura de antibióticos por cinco minutos e depois lave-as em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, segure o cabelo com uma pinça estéril e use uma tesoura estéril para cortar o excesso de haste capilar, deixando um fragmento de cabelo com um folículo piloso intacto e cerca de 0,5 a um centímetro de haste capilar

Transfira cuidadosamente um fragmento de cabelo para cada poço da placa revestida com matriz extracelular. Usando a pinça estéril, acariciei aproximadamente 100 a 200 microlitros de reposição de soro. Gota a gota média para cada poço contendo amostras de cabelo.

Em seguida, coloque a placa na incubadora e deixe os folículos se fixarem durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Adicione suavemente mais 100 a 200 microlitros de reposição de soro, gota a gota média para manter as amostras de cabelo úmidas. Verifique as amostras de cabelo diariamente para confirmar se os folículos capilares se fixaram com sucesso à placa.

Uma vez conectado, adicione suavemente mais 500 microlitros de meio ao poço. Mude de mídia a cada dois dias. Preco uma placa de seis paredes com colágeno.

Digite um usando um pré-tratamento, como um kit de matriz de revestimento a 680 microlitros do meio de diluição do kit para cada poço, seguido por 6,8 microlitros da solução de matriz de revestimento. Agite a placa suavemente para garantir um revestimento uniforme. Deixe a placa revestida incubar por 30 minutos em temperatura ambiente antes de plaquear os queratinócitos.

Remova a solução de revestimento, dissocie os queratinócitos em cultura em uma única suspensão celular adicionando 500 microlitros de 0,25% de tripsina por poço e incube as placas por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius. Assim que as células se soltarem da placa, inative a tripsina com 500 microlitros de soro contendo meio e colete as células em um tubo estéril de 15 mililitros. Remova o fragmento de cabelo usando uma pinça esterilizada, pelete as células e depois resus.

Suspenda-os em uma placa de meio de crescimento de queratinócitos frescos 40.000 queratinócitos em um poço da placa revestida de colágeno na presença de meio de queratinócitos. Troque o meio todos os dias e passe as células quando a cultura estiver cerca de 80% confluente V codifique uma placa de seis paredes com gelatina adicionando dois mililitros de uma solução de gelatina a 0,1% em cada uma, deixe a gelatina revestir por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, dissocie os queratinócitos que estão passando seis ou menos em uma única suspensão celular, adicionando um mililitro de 0,25% de tentina por poço e incubando as células por dois a cinco minutos.

A 37 graus Celsius, inative a tripsina com um mililitro de meio contendo soro e colete as células em um tubo de 15 mililitros. Pulverize as células e ressuspenda-as em meio de queratinócitos. Em seguida, coloque 100.000 a 150.000 queratinócitos por poço em uma placa gelatinizada de seis poços e incube-os durante a noite no dia seguinte, dia zero, verifique a placa para garantir que as células sejam 50 a 60% confluentes.

Realize uma transfecção dos vetores de reprogramação episômica nos queratinócitos usando uma proporção de oito microlitros de reagente de transfecção para dois microgramas de DNA plasmático total, conforme descrito no protocolo de texto anexo. No dia seguinte, primeiro dia, troque o meio de queratinócitos e verifique a eficiência da transfecção estimando a porcentagem de células positivas de proteína fluorescente verde sob um microscópio fluorescente. Uma eficiência de transfecção de 60 a 70% é esperada no segundo dia.

Repita a transfecção para aumentar a eficiência da transfecção para mais de 90% Em seguida, pré-codifique um prato de 10 centímetros com cinco mililitros de gelatina a 0,1% por pelo menos 20 minutos. Coloque 4 milhões de células alimentadoras mitoticamente inativadas por prato de 10 centímetros em meio FBS, conforme descrito em Conrad Al, e permita que as células se estabeleçam e se fixem durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no terceiro dia. Colha os queratinócitos transfectados como mostrado anteriormente e ressuspenda-os em placa média KSR.

90% dos queratinócitos de um dos poços em um prato de 10 centímetros preparado com células alimentadoras e cobri-los com KSR. Meio Isolar colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos por dissecção manual a partir do dia 21. Evite colônias que estão agrupadas e escolha apenas colônias que estejam claramente separadas das outras.

Para dissecção manual, use uma agulha de calibre 26 para cortar as colônias em pequenos pedaços de cerca de 300 a 600 micrômetros de comprimento sob um microscópio de dissecação. Transfira os pedaços de uma colônia para uma nova placa alimentadora de MEF para estabelecer uma linha clonal de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Uma vez que a cultura atinge 70 a 80% de fluência com colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de cerca de 1,5 milímetros de diâmetro, as células usam métodos de empacotamento enzimático padrão, como Accutane, sase ou colagenase.

Quatro, de acordo com as instruções do fabricante. Ao seguir este protocolo, as protuberâncias de reciclagem podem ser observadas três dias após a fixação do cabelo e continuarão a proliferar. Os queratinócitos mostrados aqui foram passados para uma nova placa e essas células podem ser mantidas por várias passagens.

Esta imagem mostra uma colônia típica de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivados de queratinócitos. Após 32 dias de reprogramação, alguma diferenciação pode ocorrer no centro da colônia de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Uma vez escolhidas manualmente, as células derivadas normalmente exibem alta proporção núcleo-citoplasma e um limite de colônia definido.

Eles também expressam uma série de marcadores pluripotentes, como OCT quatro nag e TRA um 60. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair queratinócitos do cabelo e reprogramá-los em células-tronco induzidas por humanos.