Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir macromoléculas em células vivas utilizando o dímero fluorescente tat ou df tat, um reagente que pode penetrar nas células de forma muito eficiente sem danificá-las. Isso é conseguido primeiramente gerando e purificando o agente de entrega. Dfta como segundo passo.

Dfta é incubado com as células por uma hora a 37 graus Celsius na presença da carga de macromoléculas de interesse; df tat induz a captação da carga no interior de vesículas endocíticas. As vesículas amadurecem formando endossomos iniciais, atingindo finalmente o estágio de endossomo tardio, no qual DF tat é capaz de liberar a carga no espaço citosólico das células. Em seguida, as células são analisadas por microscopia de fluorescência para avaliar a eficiência de entrega de detta e da carga de interesse.

Os resultados mostram que o TT DF pode entrar nas células com alta eficiência e sem citotoxicidade observável. O tat DF pode entregar macromoléculas de diferentes tamanhos para o espaço citosólico das células, como pode ser observado por microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação às abordagens de entrega sólida existentes é que o nosso agente de entrega possui alta eficiência de entrega sem impacto negativo observável na fisiologia celular. Além disso, é fácil de usar, pois requer apenas um simples passo de co-incubação.

Para começar, realize a síntese de FTA inchando 500 miligramas de R amida, resina MBHA e dimetilformamida ou DMF em um frasco padrão de SPPS de 50 mililitros por uma hora, conduzindo a reação à temperatura ambiente usando apenas a quantidade suficiente de gás nitrogênio para provocar a formação de bolhas na reação. Sintetize FTA na resina rink amida MBHA utilizando 1,2 milimol de cada aminoácido protegido com FM listado no protocolo do texto para cada reação de acoplamento de aminoácido. Adicione também 0,44 gramas de HBTU e 0,51 mililitros de DIEA dissolvidos em DMF, conduzindo cada reação de acoplamento de aminoácido por quatro horas; após os quatro horas de acoplamento.

Lave a resina com DMF e realize a etapa de proteção FD conforme descrito no protocolo textual. Repita até que a cadeia peptídica linear de FTA seja sintetizada. Em seguida, clive o grupo protetor MTT incubando a resina com 20 mililitros de uma solução composta por 1% de ácido trifluoroacético ou TFA e 2% de triisopropilsilano ou TIS em DCM por cinco minutos.

Como a remoção do grupo protetor MTT resultaria no aparecimento de uma coloração amarela. Repita isso até que nenhuma coloração amarela seja observada, lavando a resina com DCM e DMF entre as etapas. Adicione uma solução adicional contendo 1% de TFA em DCM à resina para garantir que nenhum MTT seja removido e que a solução permaneça límpida.

Em seguida, dissolva T-M-R-H-B-T-U e DIEA em DMF e adicione essa mistura à resina. Realize a reação durante a noite utilizando nitrogênio seco para promover agitação, após a proteção fm d e conjugação do aminoácido. Lave a resina com DCM e deixe secar para clivagem completa do peptídeo da resina.

Adicione uma solução contendo 92,5% TFA, 2,5% água, 2,5% TIS e 2,5% etano ditiol à resina peptídica durante três horas à temperatura ambiente para obter a desproteção global e clivagem da resina. Precipite os produtos peptídicos brutos usando éter etílico anidro frio, drenando a solução preparada em 40 mililitros de éter etílico. Centrifugue a 4 graus Celsius e 4.000 ×g durante 20 a 25 minutos.

Repita este passo para permitir a lavagem do precipitado com éter etílico anidro frio reus. Suspenda os precipitados em água e liofilize, depois reus suspenda novamente os produtos obtidos em TFA aquoso 0,1% ensaio ACEDONITE. Realize análise por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC com uma coluna analítica C 18.

Para analisar cada peptídeo, utilize uma vazão de um mililitro por minuto e detecção em 214 nanômetros e 550 nanômetros. Em seguida, realize a CLAE semipreparativa em uma coluna C 18 para purificação do peptídeo. Utilize uma vazão de quatro mililitros por minuto e detecção em 214 nanômetros e 550 nanômetros para todos os ensaios.

Utilize gradientes lineares antes de realizar a reação de oxidação. Confirme a identidade correta dos peptídeos por MALDI de acordo com o protocolo do fabricante. Dissolva FTA em solução salina tamponada com fosfato aerada.

Certifique-se de que o pH esteja entre 7,0 e 7,5. Após a adição do peptídeo, mantenha a reação durante a noite para permitir que ela prossiga até a conclusão. Purifique o produto utilizando CLAE em fase reversa e analise por espectrometria de massas; em seguida, liofilize o DF tat puro e ressuspenda em 200 microlitros de água para medir a concentração.

Primeiro, suspenda uma alíquota do DF tat purificado em 149 microlitros de solução de TCEP 50 milimolar e deixe a amostra reagir por aproximadamente 20 minutos. Nesta etapa, o DF tat é reduzido ao seu monômero correspondente, F tat, para eliminar o quenching da absorbância que ocorre devido à proximidade entre o corante TMR e o DF tat. Adicione todas as soluções a uma cubeta de quartzo e meça a absorbância em 556 nanômetros.

Utilizando a lei de Beer. Determine a concentração da solução. Isso corresponde à concentração de FTA.

Divida a concentração de FTA por dois para obter a concentração de dfta. Cresça as células em um meio apropriado até atingir 80 a 90% de confluência em uma atmosfera úmida a 37 graus Celsius contendo 5% de CO₂, lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS e uma vez com NRL 15. Incube as células com cinco micromolares de df tat com ou sem carga, como proteína verde fluorescente melhorada, e mantenha a 37 graus Celsius por uma hora para induzir vazamento endossomal após a incubação.

Lave as células três vezes com heparina em meio L-15 para remover o DF tat ligado à membrana plasmática das células. Como um passo final, visualize as células utilizando um microscópio de fluorescência para imagens do DF tat com um filtro de proteína fluorescente vermelha ou RFP, a fim de avaliar a diferença entre F TAT e D ftt. As células HeLa são incubadas com cada peptídeo para determinar a diferença em sua localização celular.

Como mostrado aqui, a FTA se localiza em uma distribuição pontuada. Essa distribuição é consistente com o peptídeo permanecendo aprisionado no interior dos endossomos. Em contraste, o sinal fluorescente da dfta exibe uma distribuição homogênea por todo o citosol e núcleo.

A distribuição citosólica do DF tat é observada em diversas linhagens celulares diferentes. As imagens em 20 x mostram que uma porcentagem muito elevada de células em uma placa exibe distribuição citosólica de DF tat, sem toxicidade celular, conforme indicado pela ausência de coloração nuclear com cit blue, para determinar se o vazamento endossomal mediado por dfta permite a entrega de proteínas grandes no citosol das células. A EGFP foi utilizada para detectar a entrega de proteína corretamente dobrada.

A EGFP exibiu uma distribuição fluorescente verde citoplasmática e nuclear, semelhante ao observado para df tat em mais de 90% das células, sem toxicidade observável. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as células não devem estar excessivamente confluentes. Além disso, as células devem ser lavadas cuidadosamente para remover o FPS antes da adição de df tap.