Name: Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a entregar proteínas e moléculas pequenas em células mamíferas vivas usando o reagente dfTAT. Este método de co-incubação oferece alta eficiência sem causar danos celulares, facilitando estudos em biologia celular.

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Este artigo foi apoiado pelo Prêmio Número R01GM087227 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, do Programa de Pesquisa Avançada Norman Ackerman e da Fundação Robert A. Welch (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntese Nota: dfTAT é produzida em duas etapas: a síntese do monómero fTAT por síntese de péptidos em fase sólida, seguido por dimerização de dissulfureto para formar dfTAT ligação. <ol><li> Ondas 500 mg de resina MBHA-Amida Rink em dimetilformamida (DMF) em 50 ml de uma embarcação SPPS padrão durante 1 h. </li><li> Realizar Fmoc desprotecção através da incubação da resina protegido com Fmoc numa solução de piperidina a 20% (20% de piperidina em DMF, 10 ml (0,30 mmol). Levar a cabo passos de desprotecção duas vezes (1 x 5 minutos e 1 x 15 min), com um passo de lavagem utilizando DMF (o passo de lavagem inclui a lavagem da resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF e a remoção do solvente por filtração sob vácuo) em entre reacções. </li><li> Sintetizar CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) na resina MBHA rink amida. Usar o seguinte aminoácidos protegidos com Fmoc: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (apenas no terminal N), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys e (Trt) -OH. Efectua-se a reacção utilizando N 2 (20 psi) a agitar a reacção. Executar todas as reacções no RT. <ol><li> Levar a cabo cada uma das reacções de acoplamento de aminoácidos, durante 4 h. Para cada acoplamento, utilizar o aminoácido protegido com Fmoc (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-il) urónio hexafluorofosfato (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), e diisopropiletilamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) dissolvido em DMF. A seguir ao acoplamento de 4 h, lavar a resina com DMF e realizar o passo de desprotecção de Fmoc como descrito no passo 1.2. </li><li> Repita até a cadeia peptídica linear de fTAT (cadeia peptídica linear: CKRKKRRQRRRG não TMR) foi sintetizado. </li><li> Em seguida, lave resina, cuidadosamente, com primeiro DMF e seguindo que com diclorometano (DCM). Lavar a resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF ou DCM e remover o solvente por filtração sob vácuo. </li><li> VCSE MALDI-TOF para confirmar que o péptido obtido tem o peso molecular correcto. <ol><li> Adicione uma mistura matriz por adição de 1 mg de matriz a uma solução composta por 50 ul de TFA a 0,01% em solução de água e 50 ul de acetonitrilo. </li><li> Para confirmar massa cadeia de péptido linear, utilizar ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. Executar uma HPLC analítica do péptido bruto e recolher 50 ul a partir do topo do pico puro. </li><li> Para preparar a amostra para a chapa na placa de MALDI: Adicionar 8 ul de péptido a 2 ul de solução de matriz e o lugar sobre a placa de MALDI para o ar seco ou numa coluna C de calor de placas 37 °. Nota: A arginina é conhecido por ser um ácido difícil par SPPS amino. Acoplamento bem sucedido é estabelecida através da realização de um teste de Kaiser 14 (por exemplo, teste, teste da ninidrina). Este ensaio permite a detecção de aminas livres que ainda possam estar desacoplado na resina. No caso de uma coloração azul detectado (indicativo da presença de aminas livres), de acoplamento sPTE são repetidos. </li></ol></li></ol></li><li> Para CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), clivar o grupo protector para o grupo Mtt -amino de Lys na CK (-NH-MTT) TATG com uma solução composta por 1% de ácido trifluoroacético (TFA) e triisopropilsilano 2% (TIS) em DCM. <ol><li> Como a remoção do grupo protector de MTT iria resultar no aparecimento de uma cor amarela, incubar a resina com 20 ml da solução acima durante 5 min, repetir este processo até não se observar a cor amarela. Lava-se a resina com DCM e DMF no meio. Além disso, uma vez TIS é um necrófago que limpam o MTT, uma vez que nenhuma cor amarela aparece na solução na presença de MTT. </li><li> Adicionar uma solução adicional com 1% de TFA em DCM (sem TIS) à resina para assegurar que nenhum mais MTT é removido e a solução permanece límpida. </li></ol></li><li> Dissolver as três componentes: carboxitetrametilrodamina (TMR), HBTU, e DIEA (4, 3,9 e 10 equivalência em relação à quantidade de resina (em mg)) em DMF e adicione essa misturapara a resina e realizar a reacção de O / N usando N2 seco para proporcionar agitação. </li><li> Após desprotecção de Fmoc-aminoácido e de conjugação, lavar a resina com DCM e deixar secar. Por clivagem completa do péptido da resina, adicionar uma solução contendo 92,5% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5%, TIS, e 2,5% de etanoditiol (EDT) (volume total = 4 ml) para a peptidil-resina durante 3 horas à temperatura ambiente para alcançar a desprotecção global e a clivagem a partir da resina. <ol><li> Precipitar o produto peptídeo bruto usando éter etílico anidro frio (Et2O) por drenagem da solução a partir do passo 1.6 em 40 mL de Et2O, esta rodada para baixo a 4 ° C e 4000 g durante 20 - 25 min. Repetir esta etapa para permitir a lavagem do precipitado com anidro frio Et2O </li><li> Ressuspender os precipitados em água (5 ml ou até precipitado é completamente dissolvido) e liofilizar. Em seguida ressuspender os produtos obtidos em 0,1% de TFA aquoso / acetonitrilo. </li></ol></li> &lt;li&gt; Realizar a análise por HPLC com uma coluna analítica C18 (5 uM, 4 x 150 mm) para analisar cada péptido. Usar uma taxa de fluxo de 1 mL / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. </li><li> Realizar HPLC semi-preparativa numa coluna C18 de 10 x 250 mm para a purificação de péptidos. Utilize uma taxa de fluxo de 4 ml / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. Para todas as corridas, utilizar gradientes lineares de 0,1% de TFA aquoso (solvente A) e 90% de acetonitrilo, 9,9% de água, e 0,1% de TFA (solvente B). </li><li> Confirmar a identidade correta dos peptídeos por MALDI-TOF de acordo com o protocolo do fabricante: fTAT, massa esperada: 2,041.17, massa observada: 2.040,66. DEAC-K9, massa esperada: 1,412.97, observou massa: 1,415.59. Usar uma matriz α- ácido ciano-4-hidroxicinâmico para a MALDI-TOF. </li></ol> 2. reacção de oxidação: Geração dfTAT <ol><li> Arejar salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4, durante 1 hora (a menos de 5 ml para a reacção abaixo). </li><li> Dissolver fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) em aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Certifique-se de que o pH é entre 7,0 - 7,5, após a adição do péptido. Se não adiciona-se hidróxido de sódio (1 M, em incrementos pequenos 1 - 5 ul) para levar o pH para trás até 7,4. </li><li> Nota: O oxigénio dissolvido em PBS age para oxidar os grupos tiol em fTAT e formar uma ligação dissulfureto. </li><li> Nutar a reacção S / N para permitir que ele reaja até à conclusão (rendimento 100% com base na análise por HPLC). Purifica-se o produto usando HPLC de fase reversa e análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF) tal como no passo 1.9. Massa esperada: 4,080.34, observou massa: 4,084.21. </li><li> Liofilizar puro dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) e ressuspender em 200 mL de água (concentração pura dfTAT = 356,3 M). </li></ol> 3. Medindo dfTAT Concentração <ol><li> Ressuspender numa alíquota da dfTAT purificada (tipicamente 1 ul, dependendo da quantidade de péptido purificado) em 149 ul de uma solução 50 mM de TCEP. </li><li> Nota: Nesta etapa dfTAT é reduzido ao seu monomer homólogo fTAT para eliminar a absorção de têmpera que ocorre devido à proximidade do fluoróforo TMR em dfTAT (ε o coeficiente de extinção de TMR em dfTAT é reduzido em comparação com o ε da TMR em redução fTAT). </li><li> Deixar a amostra reagir durante aproximadamente 20 min (HPLC analítica pode ser usado para confirmar a formação de fTAT). </li><li> Adicionar toda a solução para a cuvete de quartzo e medir a absorvância a 556 nm. </li><li> Usando a lei de Beer (A = εcl: ε = 91.500 M-1 cm-1) para calcular a concentração de fTAT, determinar a concentração de dfTAT, e dividir [fTAT] por dois. </li></ol> 4. Experimentos administração celular <ol><li> Semente as células (HeLa, HDF, etc.) Em um prato de cada confluência de 80 - 90% (por exemplo, de 8 poços ou 24 poços prato). Cultivar células em um meio apropriado (por exemplo, DMEM suplementado com FBS a 10% e Pen / Strep) até 80 - 90% de confluência em uma temperatura de 37 ° Catmosfera humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células três vezes (3x) com PBS (através da adição de 200 ul de PBS e, em seguida, removendo-o três vezes). </li><li> Adicione uma concentração de trabalho de 5 uM dfTAT por diluição de um stock de dfTAT (em água) em NRL-15 media (por um prato 8 bem o volume total deve ser de 200 uL). Uma concentração de 5 uM dfTAT leva a entrega eficaz (nível elevado de entrega citosólico em mais de 90% das células presentes num prato) na maioria dos tipos celulares testados até à data (Figura 3). No entanto, concentrações mais altas ou mais baixas podem ser mais adequadas para os tipos de células com uma propensão elevada ou baixa para a penetração. NOTA sobre Media: NRL-15 é usado para a entrega de dfTAT uma vez que não contêm cisteína que poderia reduzir a ligação di-sulfito em dfTAT. No entanto, os nossos dados indicam que tanto normal G-15 (com cisteína) e DMEM podem ser utilizados como os meios de entrega. G-15 contém o aminoácido cisteína mas reduzindo presumab cisteínaly oxida na mídia para formar cistina (DMEM é formulado com cistina). Por conseguinte, permanece intacta dfTAT nestes meios de entrega e funciona com a mesma eficiência que o obtido com nrL15. </li><li> Incubar as células com dfTAT (5 ^ M) com ou sem carga (por exemplo., EGFP (10 uM)) e manter a 37 ° C durante 1 h (tempo de incubação pode ser reduzido, mas dfTAT tipicamente requer cerca de 30 a 45 min para induzir fuga de endossomal ). </li><li> Lavar as células com heparina (1 mg / ml) em L-15 (3 lavagens são recomendados) para remover dfTAT ligado à membrana plasmática das células. </li><li> Incubar as células com células-impermeável corante nuclear, por exemplo., Sytox azul, Sytox verde (2 uM em NRL-15), para determinar se a membrana do plasma de células está comprometida (células mortas serão coradas enquanto que as células vivas não vai) de acordo com a o protocolo do fabricante. </li><li> Células de imagem utilizando um microscópio de fluorescência (imersão em óleo de 100X ou objetiva 20X). DfTAT imagem utilizando um filtro de RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Nota: a entrega bem sucedida leva a uma fluorescência difusa dfTAT de toda a célula (avaliação da entrega da proteína ou do péptido de interesse vai depender da aplicação). A coloração dos nucléolos por fTAT (o produto reduzido a partir da entrada de dfTAT citosólica) pode ser utilizada como uma indicação de que a fluorescência é detectada intracelular. fTAT irá degradar dentro de poucas horas. Neste ponto, a fluorescência dos fragmentos de degradação aparece como ponteada. Isso não deve ser confundido com a distribuição pontuada que também é visto se dfTAT permanece sem sucesso preso dentro endosomes (isso pode acontecer se dfTAT está presente em muito baixo de uma concentração). </li></ol> 5. Controling Concentração de MOI Proferido <ol><li> Identificar a concentração de &quot;entrega ideal&quot; necessária para conseguir uma libertação eficaz do citosólica dfTAT no tipo de células utilizado. Realizar a microscopia de fluorescência de células incubadas com increasinconcentrações g de dfTAT. A concentração óptima dfTAT é definida como a concentração mínima que leva para limpar citosólica &quot;difusa&quot; TMR fluorescência em aproximadamente 100% das células em cultura. </li><li> Variar a concentração de MOI utilizado no protocolo de co-incubação, mantendo constante a concentração de dfTAT (por exemplo, usando entrega concentração óptima de dfTAT). Alterando o tempo de incubação para menos do que 1 hora pode também ser uma opção para variar a quantidade de MOI entregue. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As células utilizadas para entrega dfTAT não deve ser excessivamente confluente (&gt; 90% de confluência) pois isso pode afetar a eficiência de entrega. As células devem também ser saudável: células mortas na cultura podem libertar fragmentos apoptóticos com as quais pode interagir dfTAT (por exemplo, ADN de núcleos degradados). Este por sua vez, pode interferir com a eficiência de entrega e a qualidade de imagem. As células devem ser lavadas cuidadosamente para remover FBS antes de adicionar dfTAT. BSA present...

A administração de proteínas, péptidos ou pequenas moléculas celulares impermeável em células vivas é muitas vezes desejável em muitas aplicações biológicas ou biotecnológicos (imagiologia celular, ensaios funcionais, de reprogramação celular, etc.) 1-4. Muitas abordagens de entrega já foram relatados, incluindo microinjecção, electroporação, ou a utilização de agentes veiculares (por exemplo., Péptidos de penetração de células, tais como tat, lípidos) 5-7. Cada técnica tipicamente tem prós e contras específicos que podem fazer essas abordagens adequadas para certas aplicações, mas não para outros. Problemas comuns envolvem a eficiência de entrega pobres e / ou falta de controle de quanto material é fornecido 8,9, toxicidade ou impacto fisiológico deletério 10,11, a falta de controle temporal, entrega em algumas células, mas não em toda a população (por exemplo., microinjecção) 12, e complexo de conjugação química ou formulação esquemas 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Recentemente, temos desenvolvido uma estratégia de entrega de romance que contorna essas limitações. Esta estratégia baseia-se em um peptídeo chamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) 13. dfTAT é derivado a partir do bem conhecido péptido célula-penetrante (CPP) TAT. dfTAT contém duas cópias dissulfureto ligado de TAT marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Apesar de suas semelhanças, TAT e dfTAT diferem significativamente em atividade. TAT é tipicamente internalizado nas células por endocitose. Este CPP permanece no entanto principalmente preso dentro endosomes (isto geralmente levam a uma distribuição pontuada do peptídeo no interior das células, quando examinado por microscopia de fluorescência). Como TAT, dfTAT é eficientemente endocitose pelas células. No entanto, dfTAT não fica preso dentro endosomes. Em vez disso, ela medeia endossomal vazamento de uma maneira que é extremamente eficiente. A actividade de dfTAT endosomolytic pode então ser explorada para entregar macromoléculas através de um ensaio de incubação simples. ntent &quot;&gt; O entendimento actual do processo de entrega é como se segue. dfTAT induz macropinocitose. Como resultado, as células incubadas com dfTAT tomar-se as proteínas solúveis, péptidos ou pequenas moléculas (moléculas de interesse, MOI) presentes nos meios de comunicação por fluido-fase endocitose (ver Figura 1). As interacções entre dfTAT e MOI não são necessários, desde que o tráfego de entidades, em conjunto dentro da via endocítica. Como dfTAT atinge um certo limite dentro do lúmen de organelos endocíticas, que expressa a sua actividade vazamento endossomal (os detalhes moleculares continuam a ser completamente caracterizados). O conteúdo do lúmen dos organelos gotejantes, e, por conseguinte, a MOI, é então libertado para dentro das células. Esta abordagem é, por conseguinte, muito conveniente como não há de conjugação ou formulação regimes com MOI são requeridas. Além disso, porque dfTAT é não modificar directamente uma MOI, que também não deve interferir com a função MOIs uma vez entrega intracelular é alcançada. Além disso, a concentração dedfTAT usados ​​entrega é independente da do MOI na mídia. Por exemplo, a concentração dfTAT pode ser mantida constante entre diferentes experiências para garantir a eficiência reprodutíveis no vazamento endossomal. Em contraste, a concentração de MOI em meios pode ser gradualmente mudada para atingir os níveis desejados de MOI entregue no citosol. A alta eficiência de fuga endossomal conseguido com dfTAT é notavelmente inócuo para muitas das células testados até à data. Esta é uma surpresa porque são organelos endocíticas componente importante das células e seria de esperar que o vazamento dramática mediada por dfTAT seria acompanhada por respostas celulares nocivos. No entanto, as células tratadas proliferam na mesma taxa como células não tratadas e não exibem qualquer alteração significativa no seu transcriptoma. Além disso, a entrega pode ser repetido dentro de minutos, com uma eficiência de entrega reprodutíveis, o que indica que as células podem tolerar ou recuperar do processo de entrega, sem perdera sua capacidade para a endocitose ou vazamento endossomal. Respostas celulares sutis, podem ocorrer durante o parto dfTAT e os detalhes moleculares de que essas respostas possam ser ainda precisam ser exploradas. No entanto, através da combinação de alta eficiência, conveniência de protocolos, e falta de toxicidade, esta abordagem de entrega deve provar imediatamente útil em muitas aplicações baseadas em células. Os protocolos aqui apresentadas visam tornar esta tecnologia acessível para a comunidade de pesquisa.

<table><tbody><tr><td>Heparina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&ndash;) cisteína</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Pedido especial</td></tr><tr><td>Aminoácidos protegidos por Fmoc</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>As amostras serão fornecidas mediante solicitação (contato: pellois@tamu.edu)</td></tr> <tr>Gabinete <td></td><td></td><td></td>de <td>Biossegurança</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência invertida</td><td>Olympus</td><td>modelo IXB1</td><td>equipado com um estágio de aquecimento mantido em 37 &deg; C e com uma câmera Rolera-MGI Plus retroiluminada com dispositivo de multiplicação de elétrons acoplado (EMCCD) (Qimaging).&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &graus; C umidificado, 5% CO2 incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sintetizador de peptídeos ou vaso para pré-formar a síntese</td><td></td><td></td><td></td> manual de peptídeos</tr></tbody></table>

entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável pequenas moléculas em células vivas por incubação com o endosomolytic reagente dftat

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Estratégias de entrega macromoleculares tipicamente utilizar a via endocítica como uma via de entrada celular. No entanto, endossomal aprisionamento limita severamente a eficiência com a qual macromoléculas penetrar no espaço citosólico de células. Recentemente, nós contornado este problema ao identificar o reagente dfTAT, um dímero de ligações dissulfureto da TAT péptido marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Geramos um dímero marcado por fluorescência do péptido TAT prototípico de penetração celular (CPP), dfTAT, que penetra as células vivas e atinge o espaço citosólico de células em particular com uma alta eficiência. Entrega citosólica de dfTAT é conseguida em várias linhas de células, incluindo células primárias. Além disso, a entrega não tem impacto sobre a viabilidade das células visivelmente, a proliferação ou a expressão do gene. dfTAT pode entregar pequenas moléculas, péptidos, anticorpos, enzimas biologicamente activas e um factor de transcrição. Neste relatório, nós descrevemos os protocolos envolvidos na dfTAT síntese e administração celular. O manuscrito descreve como controlar a quantidade da proteína entregue ao espaço citosólico de células, variando a quantidade de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, são discutidas as atuais limitações desta nova tecnologia e etapas envolvidas na validação de entrega. Os protocolos descritos devem ser extremamente útil para ensaios baseados em células bem como para a manipulação ex vivo e reprogramação das células.

Para avaliar a diferença entre fTAT e dfTAT, células HeLa são incubadas durante 1 hora com cada um dos péptidos para determinar a diferença na sua localização celular. A internalização dos dois CPP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência. A Figura 2 mostra que fTAT (20 uM) localiza em uma distribuição pontuada. Esta distribuição é consistente com o restante péptido retido no interior de endossomas. Em contraste, o sinal de fluorescência de dfTAT (5 uM) exibe uma distribuição homogénea em t...

Descrevemos como entregar proteínas e pequenas moléculas impermeáveis a células em células de mamíferos cultivadas por um protocolo simples de co-incubação com um reagente que faz com que as organelas endocíticas se tornem vazantes.

Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir macromoléculas em células vivas utilizando o dímero fluorescente tat ou df tat, um reagente que pode penetrar nas células de forma muito eficiente sem danificá-las. Isso é conseguido primeiramente gerando e purificando o agente de entrega. Dfta como segundo passo.Dfta é incubado com as células por uma hora a 37 graus Celsius na presença da carga de macromoléculas de interesse; df tat induz a captação da carga no interior de vesículas endocíticas. As vesículas amadurecem formando endossomos iniciais, atingindo finalmente o estágio de endossomo tardio, no qual DF tat é capaz de liberar a carga no espaço citosólico das células. Em seguida, as células são analisadas por microscopia de fluorescência para avaliar a eficiência de entrega de detta e da carga de interesse.Os resultados mostram que o TT DF pode entrar nas células com alta eficiência e sem citotoxicidade observável. O tat DF pode entregar macromoléculas de diferentes tamanhos para o espaço citosólico das células, como pode ser observado por microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação às abordagens de entrega sólida existentes é que o nosso agente de entrega possui alta eficiência de entrega sem impacto negativo observável na fisiologia celular. Além disso, é fácil de usar, pois requer apenas um simples passo de co-incubação.Para começar, realize a síntese de FTA inchando 500 miligramas de R amida, resina MBHA e dimetilformamida ou DMF em um frasco padrão de SPPS de 50 mililitros por uma hora, conduzindo a reação à temperatura ambiente usando apenas a quantidade suficiente de gás nitrogênio para provocar a formação de bolhas na reação. Sintetize FTA na resina rink amida MBHA utilizando 1,2 milimol de cada aminoácido protegido com FM listado no protocolo do texto para cada reação de acoplamento de aminoácido. Adicione também 0,44 gramas de HBTU e 0,51 mililitros de DIEA dissolvidos em DMF, conduzindo cada reação de acoplamento de aminoácido por quatro horas; após os quatro horas de acoplamento.Lave a resina com DMF e realize a etapa de proteção FD conforme descrito no protocolo textual. Repita até que a cadeia peptídica linear de FTA seja sintetizada. Em seguida, clive o grupo protetor MTT incubando a resina com 20 mililitros de uma solução composta por 1% de ácido trifluoroacético ou TFA e 2% de triisopropilsilano ou TIS em DCM por cinco minutos.Como a remoção do grupo protetor MTT resultaria no aparecimento de uma coloração amarela. Repita isso até que nenhuma coloração amarela seja observada, lavando a resina com DCM e DMF entre as etapas. Adicione uma solução adicional contendo 1% de TFA em DCM à resina para garantir que nenhum MTT seja removido e que a solução permaneça límpida.Em seguida, dissolva T-M-R-H-B-T-U e DIEA em DMF e adicione essa mistura à resina. Realize a reação durante a noite utilizando nitrogênio seco para promover agitação, após a proteção fm d e conjugação do aminoácido. Lave a resina com DCM e deixe secar para clivagem completa do peptídeo da resina.Adicione uma solução contendo 92,5% TFA, 2,5% água, 2,5% TIS e 2,5% etano ditiol à resina peptídica durante três horas à temperatura ambiente para obter a desproteção global e clivagem da resina. Precipite os produtos peptídicos brutos usando éter etílico anidro frio, drenando a solução preparada em 40 mililitros de éter etílico. Centrifugue a 4 graus Celsius e 4.000 ×g durante 20 a 25 minutos.Repita este passo para permitir a lavagem do precipitado com éter etílico anidro frio reus. Suspenda os precipitados em água e liofilize, depois reus suspenda novamente os produtos obtidos em TFA aquoso 0,1% ensaio ACEDONITE. Realize análise por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC com uma coluna analítica C 18.Para analisar cada peptídeo, utilize uma vazão de um mililitro por minuto e detecção em 214 nanômetros e 550 nanômetros. Em seguida, realize a CLAE semipreparativa em uma coluna C 18 para purificação do peptídeo. Utilize uma vazão de quatro mililitros por minuto e detecção em 214 nanômetros e 550 nanômetros para todos os ensaios.Utilize gradientes lineares antes de realizar a reação de oxidação. Confirme a identidade correta dos peptídeos por MALDI de acordo com o protocolo do fabricante. Dissolva FTA em solução salina tamponada com fosfato aerada.Certifique-se de que o pH esteja entre 7,0 e 7,5. Após a adição do peptídeo, mantenha a reação durante a noite para permitir que ela prossiga até a conclusão. Purifique o produto utilizando CLAE em fase reversa e analise por espectrometria de massas; em seguida, liofilize o DF tat puro e ressuspenda em 200 microlitros de água para medir a concentração.Primeiro, suspenda uma alíquota do DF tat purificado em 149 microlitros de solução de TCEP 50 milimolar e deixe a amostra reagir por aproximadamente 20 minutos. Nesta etapa, o DF tat é reduzido ao seu monômero correspondente, F tat, para eliminar o quenching da absorbância que ocorre devido à proximidade entre o corante TMR e o DF tat. Adicione todas as soluções a uma cubeta de quartzo e meça a absorbância em 556 nanômetros.Utilizando a lei de Beer. Determine a concentração da solução. Isso corresponde à concentração de FTA.Divida a concentração de FTA por dois para obter a concentração de dfta. Cresça as células em um meio apropriado até atingir 80 a 90% de confluência em uma atmosfera úmida a 37 graus Celsius contendo 5% de CO₂, lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS e uma vez com NRL 15. Incube as células com cinco micromolares de df tat com ou sem carga, como proteína verde fluorescente melhorada, e mantenha a 37 graus Celsius por uma hora para induzir vazamento endossomal após a incubação.Lave as células três vezes com heparina em meio L-15 para remover o DF tat ligado à membrana plasmática das células. Como um passo final, visualize as células utilizando um microscópio de fluorescência para imagens do DF tat com um filtro de proteína fluorescente vermelha ou RFP, a fim de avaliar a diferença entre F TAT e D ftt. As células HeLa são incubadas com cada peptídeo para determinar a diferença em sua localização celular.Como mostrado aqui, a FTA se localiza em uma distribuição pontuada. Essa distribuição é consistente com o peptídeo permanecendo aprisionado no interior dos endossomos. Em contraste, o sinal fluorescente da dfta exibe uma distribuição homogênea por todo o citosol e núcleo.A distribuição citosólica do DF tat é observada em diversas linhagens celulares diferentes. As imagens em 20 x mostram que uma porcentagem muito elevada de células em uma placa exibe distribuição citosólica de DF tat, sem toxicidade celular, conforme indicado pela ausência de coloração nuclear com cit blue, para determinar se o vazamento endossomal mediado por dfta permite a entrega de proteínas grandes no citosol das células. A EGFP foi utilizada para detectar a entrega de proteína corretamente dobrada.A EGFP exibiu uma distribuição fluorescente verde citoplasmática e nuclear, semelhante ao observado para df tat em mais de 90% das células, sem toxicidade observável. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as células não devem estar excessivamente confluentes. Além disso, as células devem ser lavadas cuidadosamente para remover o FPS antes da adição de df tap.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

Neste vídeo, demonstramos a introdução de proteínas efetoras bacterianas em células de mamíferos por eletroporação. A localização intracelular das proteínas efetoras bacterianas é detectada por microscopia confocal após coloração com anticorpos conjugados com fluoróforo específicos.

Introdução de proteínas efetoras bacterianas em células de mamíferos por eletroporação

Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Este protocolo fornece etapas detalhadas sobre como usar o sistema para uma ampla gama de aplicações.

Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Este é um protocolo para estudar as interações da proteína-proteína intracelular baseadas no sistema biotina-avidina suspenso com a novidade de combinar sequências de célula-penetrante. A principal vantagem é que a sequência de destino é incubada com células vivas em vez de lisados celulares e, portanto, as interações ocorrerá dentro do contexto celular.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

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Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

O carregamento de contas introduz proteínas, plasmídeos e partículas em células de mamíferos aderentes. Esta técnica de carregamento celular é barata, rápida e não afeta substancialmente a saúde celular. É mais adequado para imagens de células vivas.

Proteínas de carregamento de contas e ácidos nucleicos em células humanas aderentes

Aprenda a entregar proteínas e moléculas pequenas em células mamíferas vivas usando o reagente dfTAT. Este método de co-incubação oferece alta eficiência sem causar danos celulares, facilitando estudos em biologia celular.

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Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

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