Name: Produção de Double-stranded DNA Ministrings (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a produzir DNA ministrings de fita dupla usando um sistema simples de uma etapa com células W3NN PDMS. Este método eficiente melhora a entrega de genes em células eucarióticas em menos de oito horas.

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Os autores agradecem as Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) pelo financiamento deste trabalho.

1. Preparação de Mídia e Cultura <ol><li> Para LB + Amp: Preparar 500 ml de meio Luria-Bertani (LB) esterilizado utilizando um autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento com ampicilina para se obter uma concentração final de 100 ug / ml de ampicilina e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Para TB + Amp: Prepare-se para grandes (500 ml ou superior) volumes de ministring produção. Preparar 600 ml de solução estéril de Terrific Broth (TB) esterilizado utilizando um autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento com ampicilina para se obter uma concentração final de 100 ug / ml de ampicilina e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Para agar LB + Amp: Preparar placas de agar LB estéril através da preparação de LB + Amp suplementado com 15 g / L de agar. Alíquotas de aproximadamente 15 - 20 ml em placas de Petri estéreis e armazenamento de cabeça para baixo a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Prepare um prato raia de W3NN [PDMS], assepticamente, estrias W3NN [PDMS] células em LB agar + Amp. Incubar a placa overnight a 30 ° C, até que colónias individuais podem ser observadas. Não incube W3NN acima dessa temperatura para evitar derepressing expressão protelomerase. </li><li> Transfira assepticamente 5 ml de LB + Amp num tubo de ensaio estéril. Prepare uma cultura durante a noite de W3NN [PDMS] inoculando este volume com uma única colónia da placa de raia. Incubar durante a noite a cultura a 30 ° C num agitador a 230-250 rpm. </li></ol> 2. Fase de crescimento <ol><li> Transferir assepticamente 10 ml de LB + Amp num estéril de 125 ml e inocular balão de Erlenmeyer com 100 ul da cultura da noite W3NN [PDMS] no preparado de LB + Amp, fazendo uma diluição de 1: 100. <ol><li> Para volumes maiores, adicionar 500 mL de cultura durante a noite em 50 ml de TB + Amp num balão de Erlenmeyer de 250 ml, em vez de LB + Amp. </li><li> Em alternativa, utilizar como segunda cultura &quot;representante&quot; no passo 2.2. </li></ol></li><li> Incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C e 250 rpm até que a cultura atinge a fase mid log tardia, indicada por uma densidade óptica (OD) ou absorvância: A 600 = 0,8. Após 1-2 hr, a forma deve começar a aparecer turvação a olho nu. <ol><li> Transfira assepticamente 1 ml de cultura em uma tina espectrofotômetro limpo. </li><li> Medir a absorvância de luz, utilizando um espectrofotómetro de UV-vis com o comprimento de onda ajustado para 600 nm. Use 1 ml dos meios de comunicação no qual as células foram cultivadas para definir o espaço em branco (LB ou TB). Opcionalmente, utilizar a cultura representativa a partir do passo 2.1.3 para este passo em vez disso. </li><li> Se a cultura ainda não atingiu o OD apropriado, retornar ao agitador e verificar mais uma vez a cada meia hora. Verifique a OD com mais frequência como o A 600 se aproxima de 0,8. </li></ol></li><li> Uma vez que a cultura atingiu a fase logarítmica tardia, indicado por A 600 = 0,8, Transferir assepticamente a cultura em 50 ml estéreis, tubos de centrífuga. </li><li> Recolher as células por centrifugação da cultura a 10000 xg durante 10 min. Verifique se há um epllet na parte inferior do tubo. </li><li> Decantar o sobrenadante clarificado para um recipiente de resíduos de risco biológico apropriado. Não perturbe o pellet celular. </li><li> Repita os passos de 2,4-2,5 até que todas as células foram recolhidas. </li><li> Re-suspender o sedimento em 100 mL de LB + Amp. Aspirar utilizando uma micropipeta ou usar um misturador de vórtice. Para uma maior produção ministring, re-suspender o pellet a partir de uma TB 50 ml + cultura Amp em 1 ml de meio LB + Amp fresco. </li></ol> 3. Ministring Produção <ol><li> Assepticamente adicionar 20 ml de LB + Amp num balão de Erlenmeyer de 125 ml e de calor a 42 ° C. Para uma maior produção ministring, preparar 500 ml de LB + Amp, pré-aquecido a 42 ° C. </li><li> Transferir a ressuspensão em meio pré-aquecido. </li><li> Incubar a 42 ° C e 250 rpm até a fase logarítmica passado, indicado por A 600 = 1,0. Não deixar 20 ml de cultura a 42 ° C após 1 hora. </li><li> Reduzir a temperatura a 37 ° C e deixar a cultura para um adicional 90 min. Para 500 ml, deixar a cultura durante um período de indução adicional de 90-120 min e não diminuir a temperatura. </li><li> Reduzir a temperatura a 30 ° C e deixar a cultura sob agitação a 200 rpm durante um período de temperatura de redução de marcha adicional de 2 h. Por 500 ml, estender a redução de marcha temperatura para 4 horas ou durante a noite. </li></ol> 4. Ministrings Colhendo <ol><li> Transferir assepticamente a cultura em estéreis 50 ml tubos de centrífuga. Centrifugar a 10.000 xg por 10 min e inspecionar para uma pelota. </li><li> Decantar o sobrenadante para um recipiente de resíduos de risco biológico apropriada sem perturbar o sedimento. Repetir até que todas as células foram recolhidas. </li><li> Manter a pelota para a extração de plasmídeo com qualquer extração comercial e kit de remoção de endotoxina ou congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C para posterior extração. </li></ol>

<ol><li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6%2C+interleukin+12%2C+and+interferon+%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li>
<li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li>
<li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle%3A+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li>
<li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li>
<li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li>
<li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+ministrings%3A+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li>
<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal-size+vector+%28MIDGE%29+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li>
<li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li>
<li>López-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+%28MIDGE%29+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li>
<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li>
<li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PY54%2C+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li>
<li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154(2012).</li>
<li>Xu, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transcriptional+regulatory+elements+for+constructing+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.</a> Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).</li>
<li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induced+by+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).</li>
<li>Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li>
<li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li>
<li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui um sistema simples para a produção de ADN ministrings LCC utilizando um protocolo induzida pelo calor de um passo, o qual não requer nenhum equipamento especial para além de que o que é utilizado no crescimento bacteriano típico e manipulação. ministrings DNA são, cassetes lineares estáveis ​​livre de torção de expressão de ADN, desprovido de elementos genéticos procariotas. Eles podem ser utilizados em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, bem como nas avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de &quot;mini&quot; vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. A nossa robusta de um só passo em plataforma de produção in vivo de forma rápida e facilmente produz ministrings ADN para qualquer aplicação de transferência de genes, sem a necessidade de múltiplos processos dispendiosos in vitro. Há vários passos críticos paragarantir a produção ministring ideal (Figuras 2 e 3). indução de calor é a etapa mais importante para a produção ministring. Ministring completa falta de produção é muito provavelmente devido à falta de indução de calor (células retidos a 30 ° C), em que a repressão da expressão protelomerase impede a conversão do plasmídeo precursor para ministring LCC. Seguindo o protocolo de indução de calor, esperar uma eficiência de produção de aproximadamente 75%. indução de calor é optimizada, enquanto as células estão na fase log. Embora não haja nenhuma diferença estatisticamente significativa na ministring PE ao utilizar células em fase estacionária ( &quot;Overgrown&quot;, Figura 3), fizemos observar quase uma diminuição de 50% no rendimento global plasmídeo. Os rendimentos vão depender do protocolo de extracção de plasmídeo utilizado. Para a produção ministring ideal, desencadear indução de calor, enquanto as células estão em fase de registro. produção ministring pobres provavelmente será resultado de upshift temperatura prolongada ou insufficient downshift temperatura. Prolongada upshift temperatura é desencorajado, pois isso ativa a E. resposta de choque de calor coli 15, que pode inibir a actividade protelomerase e interferir com a estabilidade do plasmídeo. Portanto, cronometrando o downshift temperatura é mais um passo crítico para a produção ministring eficiente. Sem tempo de incubação adicional a 30 ° C, ministring eficiência de produção verificou-se ser muito baixa ( &quot;remoção precoce&quot;, Figura 3). Isto pode ser atribuído ao período de tempo necessário para a expressão e a actividade Tel. A originários profago PY54 codificação Tel protelomerase normalmente infecta Yersinia, que cresce optimamente cerca de 28 ° C 12, indicando que a 30 ° C também podem ser mais óptimo para a actividade Tel. O sistema de produção DNA minivector utiliza uma plataforma in vivo para gerar alta qualidade minivectors ADN livre de sequências bacterianas. Modificações para o protocolo pode include alterando os meios de crescimento para optimizar plasmídeo e produção de proteína, a fim de promover o crescimento de células durante a fase de crescimento (em vez de TB LB), ou aumentar ministring produção e eficiência de conversão. Para volumes maiores de cultura (200 ml e maiores), downshift temperatura e incubação a 30 ° C pode ser alargado durante a noite, sem impacto negativo severo sobre ministring PE. Nós incluímos modificações em nosso protocolo para 500 ml culturas como um exemplo. A purificação do ADN ministrings pode ser acelerada através de digestão in vitro de endonuclease da espinha dorsal procariótica. Há um número de locais-alvo da endonuclease de (por exemplo, PI-Scel, Pvul, ScaI) disponível na espinha dorsal do plasmídeo procariótica precursor, o qual pode ser cortado para expor linear extremidades abertas, para permitir que a degradação in vitro de a espinha dorsal procariótica. Isolamento de ministrings a partir de outras espécies de vectores pode também ser alcançada através de cromatograf ia de membrana de permuta aniónica 16. Uma limitação de corrente associado com o sistema de produção de vector de ADN LCC é a necessidade de purificação do DNA a partir de ministring outros produtos LCC e CCC. Embora facilmente purificado utilizando métodos de isolamento de plasmídeo padrão, o passo de isolamento pode ainda ser uma desvantagem numa configuração em larga escala. Separação do ministring pode ser usando idade, se o ministring e a espinha dorsal procariótica LCC são muito semelhantes em tamanho demorado. Alternativamente, a cromatografia de membrana de troca aniônica podem proporcionar uma melhor separação de ministrings a partir de espécies CCC vetor 16. Temperatura upshift pode ser outra limitação potencial como altas temperaturas também ativar a resposta ao choque térmico em E. coli, que afeta negativamente a proteína recombinante produz 17 e, consequentemente, reduzir as taxas de plasmídeo para ministring conversão. Nós relatamos em outros lugares otimizações da plataforma de produção para contornar e / ou mitigar esses efeitos de choque térmico 18. NósTambém estão otimizando os métodos actualmente para eliminar ou reduzir a contaminação LCC backbone procariotas in vivo. integração cromossómica do ADN ministring LCC perturba o cromossoma do hospedeiro e sujeita a célula a apoptose. Isto não só reduzir potenciais consequências negativas da mutagénese de inserção, tais como oncogênese e silenciamento de genes adjacentes, melhorando assim a sua segurança; o efeito letal pode também servir como um método ideal para a knock-in e estudos de substituição de genes, sem os efeitos colaterais associados e danos de integração. Os vectores de ADN ministring pode ser aplicado para a transferência e expressão de genes para proteínas terapêuticas, ARN, anticorpos ou antigénios num dado alvo in vivo ou substituir um alelo funcional inadequadamente ou não. O calor indutível-in vivo sistema simples de uma etapa de produção permite vectores de ADN ministring para ser facilmente produzidas para aplicações clínicas ou industriais.

O objetivo é produzir quantidades escaláveis ​​de linear covalentemente fechada minivectors (LCC) de ADN usando uma uma etapa in vivo DNA sistema de produção ministring induzida pelo calor da eficiência simples e alta. ministrings ADN fornecer uma estratégia não virai seguro e eficaz para entregar ADN. Elas combinam a segurança dos vectores LCC com a eficiência de minicirculos de ADN, e também oferecer uma alternativa mais segura para os vectores derivados de vírus sem comprometer a eficiência da transfecção. Para que um sistema de fornecimento de transgene a ser bem sucedida, o vector de ADN deve entrar na célula hospedeira alvo e expressam o transgene (s) codificados. Existem várias barreiras celulares que precisam de ser ultrapassados ​​na prática, particularmente em sistemas de mamíferos. A fim de evitar a degradação pelas nucleases do soro e detecção imunológica pelo sistema reticulo-endotelial, o vector de ADN devem ser bio- e imuno-compatível com o sistema de destino. DNA desprotegido é rapidamente digerido por nucleases de plasmae a membrana de plasmídeo é composto de barreiras de lipoproteínas densos de modo que o vector de ADN deve ser capaz de atravessar rapidamente a membrana plasmática das células alvo. Uma vez na célula, os vectores têm de atravessar o citoplasma e passar através da membrana nuclear para o núcleo para introduzir a expressão do transgene. técnicas de entrega de genes não virais concentrar no reforço da Tecido e célula-alvo. No entanto, a utilização de plasmídeos com estas técnicas convencionais reduz a eficiência da transfecção, devido à presença de sequências bacterianas imunogénicas, que silencia a expressão do gene rapidamente 1,2. plasmídeos convencionais normalmente carregam genes de resistência a antibióticos para manutenção em sistemas procariotas. No entanto, estes podem produzir efeitos adversos potenciais em hospedeiros humanos, a conferir resistência à ocorrência natural flora hospedeiras através de efeitos transferência horizontal de genes. Plasmídeos convencionais também contêm motivos dinucleótido CpG 2, o que pode desencadear uma resposta imunoestimuladora não desejada, potencialmentereduzir ou silenciar a expressão do transgene. Como eles são unicamente composta de a cassete de expressão eucariótica, minivectors ADN, tais como minicirculos de ADN 3, são a melhor alternativa para a entrega de genes que exibam uma biodisponibilidade melhorada extracelular e intracelular e expressão melhorada do gene devido ao seu tamanho reduzido e ausência de elementos procarióticas imunoestimuladores 4. As tarifas reduzidas tamanhos vector melhores no que diz respeito a resistência a forças de corte associadas com a administração in vivo a um local alvo 5. O maior número de cópias do vector por unidade de massa requer menos reagente de transfecção, diminuindo assim a toxicidade. No entanto, no caso de vector de integração aleatória num cromossoma do hospedeiro, circular covalentemente fechada (CCC) vectores, incluindo ambos os minicirculos de DNA e plasmídeos convencionais, conferir continuidade molecular e, por conseguinte, pode levar à mutagénese de inserção, que pode ter consequências devastadoras <s-se&gt; 6. Comparativamente, a integração de um vector de DNA linear interrompe o cromossoma e inicia percursos de morte celular, removendo assim a célula mutante a partir da população de células a proliferar e prevenção mutagénese de inserção 7. Vetores minimalistas expressão de genes imunologicamente definido (MIDGE) 8 e vetores micro-linear 9 (MiLV) são vectores de DNA LCC desenvolvidos in vitro. Vetores Midge exibiram até 17 vezes melhorada expressão do transgene in vivo em comparação com DNA plasmídeo convencional vetores 11, e têm demonstrado resultados promissores em terapia genética vacina 10 e câncer 8. Além disso, devido à estrutura livre de torção da minivector LCC, menos reagente de transfecção é necessário, em comparação com o homólogo CCC super-enrolado, reduzindo assim a toxicidade 7. Nossos vectores de DNA LCC avançados, ministrings DNA, demonstraram a eficiência expressão superior e bioavailabilidade 7. Além disso, ministrings de DNA são produzidos em um sistema de produção in vivo induzida pelo calor de um passo, uma alternativa conveniente e de baixo custo aos vectores MIDGE e MiLV LCC, que requerem etapas múltiplas in vitro. O sistema de produção ministring DNA a ser demonstrado é um processo termo-inducible simples realizado in vivo, tornando-a eficaz e facilmente escalável. Este sistema explora a Yersinia enterocolitica bacteriófago derivada-PY54 Tel / PAL protelomerase sistema de recombinação 12 para separar a cassete de expressão eucariótica mínima a partir da estrutura do plasmideo procariótica. Temos engenharia Escherichia coli (W3NN) para expressar Tel protelomerase sob o controle do promotor do bacteriófago λ induzida pelo calor, cl [TS] 857 13. Após expressão, Tel protelomerase age em locais-alvo pal presente dentro de &quot;Super Sequence&quot; (SS) sítios localizados no plasmídeo precursorpara produzir produtos LCC, a partir do qual o ministring ADN pode então ser purificado (Figura 1). Os locais de SS no plasmídeo de ADN ministring precursor também codificam locais alvo para outras recombinases incluindo a recombinase Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) e Flp recombinase (FRT), facilitando assim a produção de LCC isogénico e minivectors CCC a partir de um plasmídeo precursor. Além disso, cada sítio SS é flanqueado em ambos os lados por sequências de SV40 (SV40e), que servem para melhorar a translocação nuclear 14. Nós demonstramos noutro local que a adição sucessiva de SV40e confere progressivamente aumentos correspondentes na eficiência de transfecção 7. O plasmídeo precursor (pADN MiniString ou PDMS) contém um poli-ligante (Figura 1) para facilitar a inserção de qualquer gene desejado de interesse em fusão transcricional com o repórter fluorescente verde (GFP). A tecnologia de DNA minivector podeser utilizado em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, e as avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de &quot;mini&quot; vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. Nossa plataforma robusta de produção de uma etapa rápida e facilmente produz ministrings de DNA para qualquer aplicação de transferência de genes e oferece um perfil de segurança mais elevado.

<table><tbody><tr><td>E. coli cepa W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>para processamento de ministrings: Nafissi & Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Plasmídeo pai Mediphage</td><td></td><td>para processamento de ministring: também conhecido como pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Meios de Cultura Desidratados: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Ágar Desidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Água Milipore Ultrapura</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Modelo: Luvas Cirúrgicas Mili-Q Advantage A10 para Sistema de Purificação de Água</td></tr><tr><td></td><td>VWR(</td><td>S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri da Fisherbrand com Tampa Transparente e Crista Elevada (100&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; mm)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Teste KIMAX de 30 ml</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Cubeta</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 15 ml Tubos Falcon</td><td>&nbsp; BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr> <tr><td>Tubos de Centrífuga Estéreis de 50 ml</td><td>&nbsp; FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetas Sorológicas Descartáveis de Poliestireno 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetas Sorológicas Descartáveis de Poliestireno 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetador (100-1,000&nbsp; &mu; l)</td> <td>Micropipetador FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>(20-200&nbsp; &mu; l)</td> Pontas de Pipeta Estéreis <td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>(100-1,250&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta Estéreis (1-200&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer Estéril (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer Estéril (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer Estéril (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Modelo: Centrífuga de Piso Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Modelo: Centrífuga de Bancada Avanti J-E</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Modelo: GS-6R</td></tr><tr><td>Misturador de Vórtice Analógico Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA de 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de double-stranded dna ministrings

Production of Double-stranded DNA Ministrings

Construiu-lineares fechados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como uma alternativa vetor de administração de genes não virais produzidas através de uma plataforma simples in vivo. Ministrings ADN possuem um perfil de segurança elevado e também produzir com eficiência de carga de ADN para células alvo. vectores de ADN convencionais transportar sequências procarióticas indesejáveis, incluindo os genes de resistência a antibióticos, motivos de CpG, e as origens bacterianas de replicação, o que pode levar à estimulação de respostas imunológicas do hospedeiro. A biodisponibilidade de vectores de ADN convencionais também está comprometida devido ao seu tamanho molecular maior. A sua natureza circular também pode conferir a integração cromossômica, levando a mutagénese de inserção. sequências bacterianas são excisadas do ADN minivectors, deixando apenas o gene de interesse (GOI) e necessários elementos de expressão eucarióticos. Nossos minivectors DNA LCC, ou ministrings DNA, são desprovidos de sequências bacterianas imunogénicas; melhorando assim thbiodisponibilidade EIR e expressão GOI. No caso do vector de integração no cromossoma, o ADN ministring LCC letalmente vai perturbar o cromossoma do hospedeiro, removendo desse modo o mutante potencialmente perigosos a partir da população de células em proliferação. Consequentemente, ministrings ADN proporcionam os benefícios de ADN &#39;minicrculo&#39; enquanto elimina o potencial para eventos de integração vector indesejáveis. Em comparação com os plasmídeos e os seus homólogos convencionais (CCC) isogénicas circular covalentemente fechado, ADN ministrings demonstrar biodisponibilidade superior, a eficiência de transfecção, e a cinética citoplasmáticos - se, assim, necessitam de quantidades inferiores de agentes tensioactivos catiónicos para a transfecção eficaz das células alvo. Construímos um um passo indutível sistema in vivo para a produção de ministrings ADN em Escherichia coli, que é simples de utilizar, rápido, e escalável.

Após a extracção do ADN, plasmídeo precursor residual, LCC procariótica espinha dorsal, e o ADN ministring vai ser recuperado. rendimento plasmídeo geral e pureza pode ser avaliada utilizando um espectrofotómetro. A pureza é estimada utilizando a razão da absorvância a 260 nm e 280 nm (A260 / A280), em que uma proporção de 1,9-2,0 é óptima. Todos os produtos LCC e CCC podem ser separados através de electroforese em gel de agarose (AGE) (Figura 2). AGE visualiza os resultados de ministring produção após a indução de calor, antes ministring purificação. Uma avaliação qualitativa da produção ministring podem ser feitas nesta fase através da comparação da intensidade da banda de ministring (2,4 kb) para o plasmídeo progenitor (5,6 kb) (Figura 2). DNA Ministring podem ser recuperados através de protocolos de extração de gel plasmídeo padrão seguintes AGE. Figura 3 resume ministring eficiências de produção sob várias condições que possam ocorrer enquanto carrying fora do protocolo. Ministring eficiência da produção foi determinada com base na intensidade da banda DNA usando o programa de análise do fabricante. Qualquer programa de densitometria semelhante pode ser usada para analisar os resultados de idade. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Visão de ministring produção (A) O vector pai contém um poliligante na fusão transcricional com um gene repórter, emoldurado pelos dois locais da SS. A espinha dorsal codifica beta-lactamase para a resistência à ampicilina e também contém vários locais únicos para cortar a espinha dorsal de digestão in vitro. (B) Visão geral do protocolo principal. Passos 2) fase de crescimento e 3) Ministring produção são representados num diagrama para fornecer um esquema geral dos passos envolvidos, destacando a simplicidade do protocolo. Indução (C) Ministring. Indução de calor inactiva o repressor sensível à temperatura, permitindo a expressão tel seguido pela atividade Tel em sites da SS nos plasmídeos pais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring produção após desvios de protocolo. 1: Controle, 2: não induzido, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: remoção precoce. ministring DNA é de aproximadamente 2,4 kb, LCC backbone é de 3 kb, e pNN9 plasmídeo pai é de 5,6 kb. intensidade da banda de ministring e backbone LCC bandas cair com desvios do protocolo, indicando menor rendimento ministring. Da esquerda para a direita: 1 kb escada de New England Biolabs; Controle, seguindo o protocolo; Não induzidas, nenhuma mudança acima da temperatura; Repleto de Vegetação, temperatura upshift during fase estacionária; Overinduced, upshift temperatura ampliada; remoção precoce, sem redução de marcha temperatura. Os plasmídeos foram extraídos utilizando o Kit Omega-Biotek EZNA plasmídeo Mini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Efeitos de desvios de protocolo sobre a eficiência da produção ministring (PE) Os resultados são a média de 3 ensaios. PE é estimado a partir intensidade da banda relativa medida usando AlphaImager HP após a AGE. Os desvios ocorrem nas seguintes etapas: controle, seguindo o protocolo; Não induzidas, sem troca de marcha temperatura no passo 2; Repleto de Vegetação, upshift temperatura começou durante a fase estacionária no passo 1,6; Overinduced, upshift temperatura estendida no passo 2.3; remoção precoce, as células removida e extraídasem redução de marcha temperatura no passo 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O minivetor de DNA linear covalentemente fechado (LCC) (ministring de DNA) é um vetor de entrega de genes não viral que oferece alta eficiência de transfecção e é relevante para qualquer aplicação de entrega de DNA. O sistema de produção é simples, rápido e escalável in vivo. O protocolo a seguir fornece instruções visuais passo a passo para a produção de ministrings de DNA.

Produção de Double-stranded DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar minivetores de DNA seguros, lineares e covalentemente fechados, ou minicordas de DNA, utilizando um sistema de produção simples e de um único passo. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de vetores de DNA e entrega gênica. Em particular, como produzir de forma eficiente vetores de entrega gênica mais seguros e eficazes, denominados minicordas de DNA.A principal vantagem desta técnica é que se trata de uma abordagem eficiente e simples, em um único passo e in vivo, para a produção de minicadeias de DNA. Para preparar o meio, após preparar 500 mililitros de LB, 600 mililitros de TB e ágar LB para placas, autoclavar a 121 graus Celsius por 30 minutos. Após o resfriamento, suplementar cada meio com ampicilina, em uma concentração final de 100 microgramas por mililitro.Armazene o meio líquido a quatro graus Celsius. Em seguida, despeje de 15 a 20 mililitros do ágar LB com amp em placas de Petri estéreis e, após o resfriamento, armazene-as de cabeça para baixo a quatro graus Celsius. Faça o estriamento das células W3NN PDMS em ágar LB com ampicilina e incube a placa a 30 graus Celsius durante a noite até que colônias isoladas possam ser observadas.Em seguida, com uma única colônia da placa estriada, prepare um cultivo noturno de W3NN PDMS inoculando cinco mililitros de LB acrescido de ampicilina. Incube o cultivo a 30 graus Celsius e 230 a 250 rpm durante a noite. Em um erlenmeyer de 125 mililitros, inocule 10 mililitros de LB acrescido de ampicilina com 100 microlitros do cultivo noturno de W3NN PDMS para obter uma diluição de 1 para 100.Incube a cultura a 30 graus Celsius e 250 RPM até que fique turva à vista desarmada e atinja a fase logarítmica média a tardia. Em seguida, transfira 1 mililitro da cultura para uma cubeta limpa. Depois, utilizando um espectrofotômetro UV-Vis com um comprimento de onda de 600 nanômetros e o meio usado para cultivar as células, ajuste o branco antes de medir a absorbância da luz pela cultura.Se a cultura ainda não atingiu a DO apropriada, retorne-a ao agitador e verifique novamente a cada meia hora. Uma vez que a cultura atinja a fase logarítmica média, transfira-a para tubos estéreis de centrífuga de 50 mililitros. Pelotize as células centrifugando a 10.000 ×g durante 10 minutos.Decante o sobrenadante claro para um recipiente apropriado de resíduo biológico, e use 100 microlitros de LB com amp para ressuspender o pellet por pipetagem para cima e para baixo ou por vortex. Para induzir a produção de ministring, adicione 20 mililitros de LB com amp a um frasco Erlenmeyer de 125 mililitros e aqueça a 42 graus Celsius. Transfira o pellet ressuspenso para o meio pré-aquecido e incube a 42 graus Celsius e 250 RPM após a fase log, ou por não mais de uma hora para 20 mililitros.Reduza a temperatura para 37 graus Celsius e deixe a cultura por mais 90 minutos. Em seguida, reduza ainda mais a temperatura para 30 graus Celsius e deixe a cultura agitando a 200 rpm por duas horas. Para colher as minicascatas, transfira a cultura para tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos e verifique a presença de um precipitado. Por fim, decante o sobrenadante e utilize um kit comercial de extração e remoção de endotoxinas para extrair o plasmídeo. Após a extração do DNA, o plasmídeo precursor residual, o esqueleto procariótico LCC e a minicorda de DNA serão recuperados e poderão ser separados por eletroforese em gel de agarose, conforme mostrado aqui.Antes da purificação do ministring, pode-se fazer nesta etapa uma avaliação qualitativa da produção do ministring comparando a intensidade da banda do ministring com a do plasmídeo original. Esta figura resume as eficiências de produção de ministring provavelmente observadas sob diversas condições durante a execução do protocolo. A eficiência de produção de ministring foi determinada com base na intensidade da banda de DNA.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída totalmente em menos de oito horas, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de respeitar as mudanças corretas de temperatura. Após este procedimento, outros métodos, como eletroforese em gel de agarose ou digestão por endonuclease, podem ser realizados para isolar ministrings ou verificar a eficiência de produção.Essa técnica pode aumentar significativamente a entrega de genes a células eucarióticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como maximizar a produção de minicadeias de DNA utilizando nossa plataforma de produção. Não se esqueça de que, ao trabalhar com brometo de etídio, os iluminadores de UV podem ser extremamente perigosos, e equipamentos adequados de segurança laboratorial devem sempre ser usados ao realizar este procedimento.

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

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Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

Aprenda a produzir DNA ministrings de fita dupla usando um sistema simples de uma etapa com células W3NN PDMS. Este método eficiente melhora a entrega de genes em células eucarióticas em menos de oito horas.

Produção de Double-stranded DNA Ministrings

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