Avaliação da Perigenital Sensibilidade e Prostatic Mast Ativação celular em um rato modelo de Separação Materna Neonatal

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar o impacto do estresse no início da vida no sistema urogenital, medindo a sensibilidade mecânica perigenital e a ativação de mastócitos dentro da próstata em camundongos machos C 57 pretos de seis que foram submetidos à separação materna neonatal. Isso é conseguido realizando primeiro a separação materna neonatal em ninhadas de C 57 filhotes de camundongos pretos de seis para induzir o estresse no início da vida por 20 dias consecutivos. O segundo passo é medir a sensibilidade mecânica perigenital pela aplicação de uma série de monofilamentos de Von Fre na região perigenital.

Em seguida, a coloração com azul de toluidina acidificada é realizada em seções de criostato das próstatas de camundongos. A fim de quantificar a ativação de mastócitos. Os resultados mostram que a separação materna neonatal aumenta a sensibilidade mecânica perigenital e a ativação de mastócitos protéticos com base em nossas análises comportamentais e histológicas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a prostatite autoimune experimental, é que ela incorpora a exposição ao estresse durante o desenvolvimento inicial, o que precipita a sintomatologia mais tarde na vida, semelhante ao observado em pacientes com prostatite crônica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da dor pélvica crônica, como o impacto do estresse no início da vida no comportamento, e fornecer evidências histológicas de estados de dor alterados. Embora esse método possa fornecer informações sobre a prostatite crônica, ele também pode ser aplicado a outras síndromes de dor funcional, como cistite intersticial, síndrome da bexiga dolorosa, vulvodinia, fibromialgia ou enxaqueca.

Pode até ser aplicado a outras comorbidades psicológicas comuns, como ansiedade e depressão No dia seguinte ao nascimento, remova a barragem da gaiola doméstica e coloque-a em um recipiente secundário limpo. Esfregue um punhado de roupa de cama entre as mãos limpas e enluvadas para manter o cheiro da gaiola doméstica e, em seguida, transfira uma profundidade de um a dois centímetros da roupa de cama da gaiola doméstica para um alto-falante de vidro de dois litros limpo e devidamente rotulado. Além disso, em aproximadamente metade de qualquer material de cama de enriquecimento adicional que esteja presente na gaiola doméstica, como ninhos ou papel amassado para o alto-falante de vidro em seguida, coloque todos os filhotes de uma única ninhada no copo preparado e coloque imediatamente o copo a 33 graus Celsius e 50% de umidade por 180 minutos.

Durante o período de incubação separado, remova a barragem do recipiente secundário e devolva-a à gaiola doméstica. Retorne a gaiola doméstica ao local de alojamento apropriado dentro do viveiro. No final do período de separação, recupere a gaiola doméstica e remova a barragem, colocando-a em um recipiente secundário limpo.

Em seguida, remova o copo da incubadora e coloque um punhado de roupa de cama entre as mãos limpas e enluvadas para manter o cheiro da gaiola doméstica enquanto manuseia os filhotes. Mova suavemente os filhotes individualmente do béquer para a gaiola doméstica e devolva qualquer enriquecimento e cama restantes no béquer para a gaiola doméstica. Depois que todos os filhotes forem devolvidos, mova a barragem do contêiner secundário para a gaiola doméstica e devolva-a ao local de alojamento apropriado dentro do viveiro.

Repita todo esse procedimento para cada ninhada submetida à separação materna neonatal todos os dias até o 21º dia pós-natal. Em seguida, desmame os filhotes e os aloje nas mesmas condições que os camundongos de controle durante toda a duração do experimento. Prepare a área de teste colocando uma almofada absorvente sob uma mesa superior de malha de arame elevada com 55 centímetros de altura.

A mesa deve fornecer espaço suficiente para permitir que o investigador se aproxime pela parte inferior sem assustar os ratos. Coloque até 12 ratos de oito semanas individualmente sob câmaras de plástico perfuradas transparentes em cima da mesa de malha de arame. Coloque um objeto pesado em cima das câmaras para evitar que os ratos escapem.

Segure a base de um monofilamento de três pontos e 22 gramas e exponha o monofilamento retraído. Posicione a sonda de forma que o monofilamento fique orientado verticalmente. Quando o rato está alerta, imóvel e seu peso corporal é distribuído uniformemente entre as patas traseiras.

Aplique-o no lado esquerdo ou direito do escroto, evitando a linha média até que uma ligeira curvatura seja observada no filamento. Segure o monofilamento no lugar por 10 segundos ou até que o animal mostre uma resposta positiva, como um empurrão ou salto rápido ou comportamento de lamber ou morder direcionado ao monofilamento. Se um camundongo não se mover, nem exibir respostas positivas durante a aplicação de monofilamento de dez segundos, registre um teste de resposta negativa para todos os camundongos usando o mesmo filamento de tamanho e, em seguida, mude para o próximo monofilamento apropriado.

Continue testando cada mouse usando o próximo monofilamento maior ou menor, conforme apropriado para quatro aplicações adicionais. Após a primeira resposta positiva ser observada, disseque e, em seguida, corte criogênico, fixou o tecido da próstata de camundongos de nove semanas em cortes criogênicos de sete mícrons de espessura. Em seguida, prepare uma solução estoque de azul de toluidina a 1% adicionando um grama de azul de toluidina O a 100 mililitros de etanol a 70% e vortex a mistura até que ela entre em solução.

Armazene a solução estoque em temperatura ambiente por até três semanas. Em outro copo, adicione um grama de cloreto de sódio a 100 mililitros de água colocados em cima de uma placa de agitação. Ajustar o pH da solução salina utilizando ácido clorídrico 12 molar até obter um intervalo de pH de 0,5 a 1,0.

Em seguida, prepare uma solução de trabalho de azul de toína acidificada a 0,25% combinando oito mililitros da solução estoque de azul de Udine e 32 mililitros da solução ácida de cloreto de sódio a 1%. Canalize-o para cima e para baixo para garantir a incorporação total da solução de estoque de azul de odo e misture Usando um vórtice, prepare a solução de trabalho fresca para cada lote de lâminas. Lave as seções de tecido mergulhando individualmente as lâminas por aproximadamente um segundo em um tubo cônico de 50 mililitros contendo um volume suficiente de PBS para submergir completamente o tecido.

Deixe as lâminas secarem ao ar em uma toalha de papel. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco de vidro contendo o suficiente da solução de trabalho azul de 0,25% de toluidina para garantir que as seções de tecido fiquem completamente submersas. Incube as lâminas por 10 a 15 minutos enquanto estiver em um balancim de plataforma ajustado a 15 RPMs.

Em seguida, mergulhe as lâminas em PBS por aproximadamente um segundo para lavar qualquer excesso de azul udine alto e coloque as lâminas em uma caixa de lâminas de forma que as lâminas fiquem de lado. Para permitir a drenagem. Seque as lâminas em um forno a 37 graus Celsius por no mínimo duas horas ou durante a noite em temperatura ambiente.

Depois de secos, mergulhe as lâminas em etanol a 95% por aproximadamente um segundo e, em seguida, deixe a seção secar completamente. Repita este procedimento de uma a 10 vezes até que o tecido seque mais azul do que roxo. Em seguida, mergulhe as lâminas em etanol 100% por aproximadamente um segundo e deixe a seção secar completamente.

Repita este procedimento de uma a 10 vezes até que o tecido fique escuro a azul médio, mas não roxo. Por fim, corrija a mancha incubando as lâminas em xileno 100% por três minutos. Deixe-os secar e depois cubra, deslize as lâminas com glicerol PPS ou um meio de montagem permanente à base de xileno.

Drene o excesso de mídia e guarde as lâminas concluídas em temperatura ambiente. Quando testados com uma série graduada de monofilamentos de Von Frame, separação materna neonatal de oito semanas, os camundongos exibiram alodinia mecânica perigenital quando comparados aos colegas ingênuos. Isso é evidenciado como uma redução significativa no limiar de abstinência mecânica que provocou uma resposta comportamental positiva.

Evidências adicionais de prostatite crônica síndrome da dor pélvica crônica podem ser vistas histologicamente mostradas aqui são seções de criostato de tecidos da próstata que foram corados com azul de otoluidina acidificado para observar grânulos de triptase alojados dentro dos mastócitos. Uma porcentagem significativamente maior de mastócitos granulados foi observada em seções de próstata de camundongos de separação neonatal. Quando comparado a camundongos ingênuos Ao realizar a separação materna neonatal, é importante lembrar de manter o cheiro da gaiola doméstica para evitar a rejeição dos filhotes pela mãe Após este procedimento.

Outros métodos, como testes de campo aberto ou preferência líquida de duas escolhas, podem ser usados para avaliar evidências comportamentais para transtornos de humor comórbidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a sensibilidade mecânica perigenital e a ativação de mastócitos prostáticos como evidência comportamental e histológica de prostatite crônica e camundongos após a separação materna neonatal.