Name: Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a gerar xenotransplantes derivados de pacientes com câncer de próstata a partir de células tumorais circulantes usando citometria de fluxo. Este método oferece um modelo experimental alternativo para estudar a progressão do câncer de próstata e desenvolver novos biomarcadores.

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Agradecemos ao Dr. Jordi Ochando, dos Recursos Compartilhados de Citometria de Fluxo do Mount Sinai Medical Center, por sua assistência na análise de citometria de fluxo. Agradecemos à Dra. Rumana Huq, do Centro de Recursos Compartilhados de Microscopia do Mount Sinai Medical Center, por sua assistência por imagem. Os autores agradecem à Fundação TJ Martell por seu apoio neste projeto.

Este protocolo foi realizado em nossa instituição com a aprovação do conselho de ética em pesquisa da instituição e está em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. 1. Recolha de Sangue Periférico de pacientes com câncer de próstata avançado Nota: Selecione os pacientes com câncer de próstata metastático. Obter o consentimento escrito do paciente e registrar características clínicas dos pacientes, incluindo idade em isolamento e quimioterapia anterior e tratamentos hormonais. Os doentes com doença metastática potencialmente terão maior concentração de CTC no sangue periférico. <ol><li> Recolha de amostras de sangue, após consentimento informado e no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional apropriado protocolo aprovado. Usar luvas de látex e uma bata de laboratório durante todo o procedimento. </li><li> Conecte-25 G borboleta agulha e tubos para suporte de agulha. Use um algodão embebido em álcool para limpar a área deveia antecubital entre bíceps e antebraço, em seguida, aplicar torniquete a parte superior do braço do paciente. </li><li> Insira a agulha na veia antecubital borboleta e empurre tubo de coleta de sangue para suporte de agulha para começar a coleção. Recolha cerca de 10 ml de sangue em tubos de recolha que contêm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para impedir a coagulação. </li><li> Remova a agulha borboleta do paciente e aplicar pressão com gaze esterilizada sobre o local da punção da veia por 1 min. Local Cubra com uma gaze esterilizada. </li></ol> 2. Isolamento de Células Mononucleares Nota: O sangue recolhido a partir do passo 1 conterá células mononucleares do sangue periférico (PBMC) (por exemplo, linfócitos e monócitos), para além dos CTC mononucleares. <ol><li> Pipeta todo o sangue em tubo de poliestireno de 50 mL cónico, com uma pipeta de 5 mL e adicionar serológica Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) em uma proporção de 1: 1. Suavemente mistura pipeta para homogeneizar. </li><li> Adicionar 15 ml de uma solução preparada comercialmente (Ficoll-Paque) para separar componentes de sangue por gradiente de densidade baixa velocidade de centrifugação para um tubo cónico de 50 ml de poliestireno vazio. </li><li> Pipeta suavemente sangue total e mistura HBSS, a partir do passo 2.1, para dentro do tubo de poliestireno a partir do passo 2.2, para formar a camada superior distinta. Set pipeta a configuração mais baixa para minimizar a mistura de soluções, o que irá garantir a separação eficiente. </li><li> Centrifuga-se a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente (25 ° C). Definir desaceleração a configuração mais baixa para evitar a mistura de soluções após a separação. A aceleração pode ser ajustado para qualquer velocidade. </li><li> Após centrifugação, a banda branca identificar-cinza fina camada de PBMC e CTC ensanduichada entre o plasma em solução de topo e de separação no fundo do tubo. </li><li> Recolher as células a partir da faixa branca-acinzentada no passo 2.5 para um tubo de 50 mL de poliestireno, usando uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Adicionar HBSS a 50 ml de poliestireno tubo cónico com PBMCs e CTC e Centrifuge novamente a 400 xg durante 10 min temperatura ambiente para lavar. </li><li> Decantar sedimento líquido e ressuspender em 50 ml de HBSS e centrifugar novamente a 400 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente para lavar. </li><li> Descartar o sobrenadante, o sedimento restante ressuspender com 5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar a solução durante 5 min à TA. </li><li> Remover o tampão de lise de glóbulos vermelhos por centrifugação a 400 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS 1x suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) para bloquear antes da coloração do anticorpo. </li></ol> 3. As células mononucleares com coloração CD45-FITC de anticorpos para fluorescência celular ativado (FACS) <ol><li> Quantificar o número de células viáveis ​​(Trypan Blue-negativa) (do passo 2.11), utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Prepara-se uma 6 x 10 células / suspensão de 1 ml (em PBS 1x com 10% de FBS) e colocá-lo em gelo durante 1 hr. </li><li> Distribua o quantificadosuspensão de células a partir do passo anterior em dois tubos. Tubos de etiquetas de controle e coloração CD45. </li><li> No tubo de controlo, adicionar IgG1K-FITC (2,5 ug / ml), a uma diluição de 1: 250. No tubo de coloração CD45, CD45 adicionar FITC (2,5 ug / mL) conjugada com o anticorpo primário a uma diluição de 1: 250 e incuba-se as suspensões de células sobre gelo durante 30 min. Rotulagem antigénio CD45 é utilizado para excluir células hematopoiéticas. </li><li> Centrifugar as células a 400 xg durante 3 min a 4 ° C, e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar as células duas vezes, suspendendo cada pellet estéril com 1 x PBS suplementado com FBS a 10%, seguido por centrifugação a 400 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células numa solução de PBS contendo 1 x 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a uma concentração de 10 ug / ml 1 ml. </li><li> Filtrar a solução final através de tampas de filtro 35 um em 12 milímetros tubos de poliestireno x 75 mm. </li></ol> 4. Isolamento de próstata por CTCFACS Nota: Utilize um citômetro de fluxo para coletar ao vivo CTCs negativos CD45. <ol><li> Defina controles de compensação usando células do tubo rotulado, &quot;Control&quot;. </li><li> Criar portões que excluem detritos e aglomerados de células usando parâmetros para a frente-de dispersão e side-de dispersão apropriados. </li><li> Estabelecer as portas FITC utilizando as suspensões de células a partir do tubo rotulado, &quot;CD45-FITC.&quot; </li><li> Portão células viáveis ​​(DAPI-negativos) usando o Pacífico azul-A do canal. </li><li> Recolhe população negativa para CD45 num tubo cónico de 15 ml de poliestireno estéril, contendo 2 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado com FBS a 10%. </li><li> Centrifugar a suspensão de células de tumor da próstata classificados a 400 xg durante 3 min, em seguida, voltar a suspender as pelotas em 200 - 500 ul de meio RPMI suplementado com FBS a 10%. </li></ol> 5. Injeção de CTCs em ratos e Monitoramento de Crescimento Xenoenxerto Nota:Realizar todos os procedimentos de animais em conformidade com os protocolos aprovados pelo comitê de cuidados com os animais institucional. Este protocolo foi realizado em nossa instituição no âmbito de um protocolo específico ao Uso de Animais aprovado pelo nosso Comitê Animal Care em conformidade e cumprimento de todas as agências regulatórias e institucionais, regulamentos e orientações relevantes. <ol><li> Misture a suspensão de células de tumor da próstata classificados com matriz extracelular em uma proporção de 1: 1 e o local em gelo. </li><li> Anestesiar rato antes da implantação subcutânea em uma câmara de fornecimento de 5% (v / v) de isoflurano inalado em 1 L / min de oxigénio. Certifique-se anestesia adequada verificando a perda do reflexo corneal e dedo do pé no mouse. </li><li> Usando uma agulha G 25 e uma seringa de 1 ml, injectar 250 ul de células de tumor da próstata e na matriz extracelular de células subcutaneamente suspensão em ambos os flancos superiores de um 8-10 semanas de idade do sexo masculino murganho imunodeficiente. Injectar 250 ul, independentemente da concentração de tetracloreto de carbono como o volume de injecção é o ivalor mportant. Administração máxima SQ no rato não é mais do que 1 ml. &#160;</li><li> Monitorar ratos através da realização de palpação semanal de locais de injecção do mouse para o crescimento de densidades nodulares subcutâneas e medindo os ratos de peso duas vezes por semana. </li><li> Euthanize ratos por asfixia dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical e colheita subcutâneos xenoenxertos de cancro da próstata humano, quando o tamanho do tumor é mais do que 0,5 cm e menos de 1 cm de maior diâmetro para assegurar tecido tumoral suficiente para análises moleculares e passagem serial. Euthanize camundongos com sinais de sofrimento ou perda de peso, de 15%, apesar de nenhum tumor é palpável. </li></ol>

<ol><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%2C+detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).</li>
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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+enrichment+by+immunomagnetic+nanobeads+for+unbiased+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients.</a> Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).</li>
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<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Klein, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li>
<li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este manuscrito descreve um método para a geração de modelos de cancro da próstata a partir de PDX CTC. O uso do CTC para a geração de PDX modelos tem várias vantagens potenciais importantes quando comparado com métodos existentes. Em primeiro lugar, de recolha acessível CTC partir de sangue periférico permite a geração de modelos experimentais a partir do mesmo paciente em diferentes estádios da doença. Em segundo lugar, a colheita de sangue representa um método barato e mais seguro para o isolamento...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Paciente xenotransplantes derivados são cada vez mais populares modelos experimentais utilizadas para a investigação do cancro. Eles podem ser usados ​​para a caracterização de biomarcadores e vias biológicas, avaliação pré-clínica da eficácia do medicamento, e criação de avatares para terapias de câncer personalizado 1,2. Previamente, outros grupos de pesquisa têm desenvolvido modelos PDX quer por implantação ou injecção de suspensões de células tumorais únicas ou explantes de tumores em ratinhos inteiro 1 imunocomprometidos. Estes PDX modelos exige a recolha cirúrgica do tumor sólido fresco, ascite maligna ou derrame pleural de um paciente submetido a um procedimento cirúrgico que é caro e expõe o paciente a um risco aumentado de morbidade iatrogênica. Um desenvolvimento recente importante na investigação do cancro tem sido a detecção, isolamento e caracterização de células tumorais circulantes. Estas células tumorais escapar da massa do tumor primário e entra na circulaçãoonde eles desempenham um papel crítico na metástase e recidiva, a causa mais comum de cancro relacionados com a mortalidade 3. A avaliação e caracterização dos CTC a partir de vários tipos de tumores sólidos forneceram informação clínica para o diagnóstico, prognóstico e monitorização da doença residual 3. Uma variedade de abordagens actualmente usados ​​dependem tanto nas propriedades físicas, à expressão dos biomarcadores ou as características funcionais do CTC pode ser utilizado para isolar CTC 4 eficientemente. Métodos existentes macroescala isolamento CTC incluem centrifugação em gradiente de densidade, de filtração com poros de filtro física e separação contra moléculas da superfície. As metodologias de isolamento mais amplamente utilizados baseiam-se no CTC captura à base de anticorpo da CTC. Tanto a selecção positiva e negativa de marcadores de superfície celular podem ser empregues para isolar CTC partir de sangue periférico. A selecção positiva para a CTC na circulação periférica geralmente usa marcadores epiteliais (por exemplo, que um EpCAM)está expressa em células CTC mas não hematopoiéticas. A desvantagem deste método é que CTC com potencial metastático têm muitas vezes sido submetidos epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), que regula negativamente a marcadores de superfície epitelial 3. A fim de isolar CTC com potencial metastático, uma metodologia de selecção negativa que utiliza o marcador de superfície hematopoiéticas, CD45, para esgotar a população de células normais de leucócitos pode ser utilizado 5. O câncer de próstata é o câncer mais comumente diagnosticado e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em homens 6. Os mecanismos de progressão tumoral e agressividade não são completamente compreendidos e, por conseguinte, a geração e caracterização de modelos experimentais que recapitulam a heterogeneidade molecular de cancro da próstata são de interesse significativo. PDX modelos de câncer de próstata têm sido gerado anteriormente pelo enxerto de células cancerosas humanas da próstata em immunocomcamundongos prometidos 7,8. No entanto, a geração de tais modelos tem sido dificultada pela baixa taxa de enxerto de cancro da próstata em ratinhos imunocomprometidos, a qual é atribuída principalmente à natureza indolente da doença. Recentemente, CTC foram usadas para gerar o cancro da mama 9, cancro do pulmão e cancro da próstata 10 11 modelos PDX. Estes estudos de prova de conceito introduzido a possibilidade de gerar modelos PDX independente da necessidade de recolha de amostra cirúrgica. Neste artigo vamos descrever em detalhes um método para a geração deste modelo experimental romance.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &micro; m Filtro de células</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de poliestireno de 50 ml</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 12 mm x 75 mm com tampa de filtro de células</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>BD Vacutainer Tubos de Coleta de Sangue de Lavanda com EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Coleta de Sangue Alado BD com Botão de Pressão Retrair Agulha 23 gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Um Uso Porta-Agulha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torniquete</td><td></td><td></td><td></td>de Látex Descartável</tr><tr><td>Luvas de látex ou não-látex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>compressas com álcool</td> 2 x 2 almofadas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de gaze de algodão</td></tr><tr><td>Bandagem</td><td></td><td></td><td></td>adesiva</tr><tr><td>25 G agulha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml seringa</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de paciente com câncer de próstata derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Os modelos de xenoenxerto derivado de pacientes (PDX) estão ganhando popularidade na pesquisa do câncer e são usados para avaliação pré-clínica de medicamentos, identificação de biomarcadores, estudos biológicos e estratégias de medicina personalizada. As células tumorais circulantes (CTC) desempenham um papel crítico na metástase tumoral e foram isoladas de pacientes com vários tipos de tumores. Recentemente, as CTCs têm sido usadas para gerar modelos experimentais PDX de câncer de mama e próstata. Este manuscrito detalha o método para a geração de modelos PDX de câncer de próstata a partir de CTCs desenvolvidos por nosso grupo. As vantagens desse método em relação aos modelos PDX convencionais incluem independência da coleta de amostras cirúrgicas e geração de modelos experimentais em vários estágios da doença. A centrifugação com gradiente de densidade seguida de lise de glóbulos vermelhos e depleção por citometria de fluxo de células mononucleares CD45 positivas é usada para enriquecer CTCs de amostras de sangue periférico coletadas de pacientes com doença metastática. As CTCs são então injetadas em camundongos imunocomprometidos; Xenoenxertos gerados posteriormente podem ser usados para estudos funcionais ou colhidos para caracterização molecular. A principal limitação deste método é o método de seleção negativa usado para enriquecimento de CTC. Apesar dessa limitação, a geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um novo modelo experimental a ser aplicado à pesquisa do câncer de próstata.

Este protocolo conduz à geração de modelos de PDX isolados CD45 CTC cancro da próstata negativo. Com base no método de selecção negativa utilizada no nosso protocolo é necessário para excluir as células mortas utilizando DAPI mancha. A percentagem de células CD45 negativas detectada por citometria de fluxo é variável e depende do peso do tumor do paciente (Figura 1A). Coloração de imunofluorescência de células não triados usando CD45 e DAPI (para identificar os núcleos celulares) revela células negativa...

Este manuscrito detalha um método usado para gerar xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de próstata (PDXs) a partir de células tumorais circulantes (CTCs). A geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um modelo experimental alternativo para estudar o câncer de próstata; o tumor mais comumente diagnosticado e uma causa frequente de morte por câncer em homens.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

O objetivo geral do protocolo a seguir é gerar câncer de próstata. Enxerto heterólogo derivado de células tumorais circulantes. Isso é alcançado primeiramente pela coleta de sangue periférico de pacientes com câncer de próstata avançado.Como segundo passo, o compartimento de células mononucleares do sangue é isolado, o qual contém as células tumorais circulantes. Em seguida, as células mononucleares são coradas com um anticorpo ZI contra CD45. A fim de selecionar as células tumorais circulantes por citometria de fluxo, as células são então injetadas em camundongos imunocomprometidos. Os resultados demonstram a geração de xenoenxertos de câncer de próstata com base na injeção de células tumorais circulantes isoladas por citometria de fluxo a partir do sangue periférico de pacientes com câncer de próstata.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer de próstata ao gerar novos modelos experimentais que podem ser utilizados para a caracterização molecular do câncer de próstata e para o desenvolvimento de novos biomarcadores. Demonstrar o procedimento será Williams, um aluno do laboratório, e Omada, um pesquisador do departamento de oncologia aqui no Mount Sinai. Para começar, colete sangue total de pacientes selecionados com câncer de próstata metastático, pois eles têm potencial para apresentar altos números de células tumorais circulantes em seu sangue periférico. Usando uma pipeta serológica de 10 mililitros, transfira o sangue total para um tubo cônico de poliestireno de 50 mililitros, juntamente com solução salina balanceada de Hank's.Na proporção de um para um, pipete suavemente a mistura para homogeneizá-la. Em seguida, adicione 15 mililitros de uma solução de pacote FI a um tubo cônico de poliestireno de 50 mililitros vazio. Pipete suavemente 20 mililitros do sangue total diluído, utilizando a configuração mais baixa, por cima da solução para formar uma camada superior distinta.Em seguida, centrifugue o tubo a 400 Gs durante 30 minutos. À temperatura ambiente, ajuste a desaceleração da centrífuga para o menor valor possível para evitar a mistura das soluções após a separação. Após a centrifugação, identifique a faixa fina, branca e acinzentada de células mononucleares do sangue periférico e células tumorais circulantes, localizada entre a camada superior de plasma e a solução de separação.Na parte inferior do tubo, colete cuidadosamente as células da faixa esbranquiçada acinzentada e transfira-as para um tubo de poliestireno de 50 mililitros. Usando uma pipeta plástica de transferência, adicione então a solução salina balanceada de Hank às células isoladas, até um volume total de 10 mililitros.Centrifugue a mistura novamente a 400 Gs por 10 minutos à temperatura ambiente. Para lavar as células, remova o sobrenadante e repita essa lavagem. Repita mais uma vez.Após a segunda lavagem, descarte o sobrenatante. Suspenda o pellet remanescente em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incube a solução por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue a amostra a 400 Gs por três minutos à temperatura ambiente e remova o tampão de lise descartando o sobrenatante.Por fim, re-suspenda o pellet em um mililitro de PBS suplementado com 10% de soro bovino fetal antes da coloração. Quantifique o número de células viáveis utilizando o método padrão de exclusão com azul de tripano em um hemocitômetro ou contador automático de células. Em seguida, dilua as células para 1 milhão de células por mililitro em PBS com 10% de FBS e coloque-as no gelo por uma hora.Para bloquear a ligação inespecífica, distribua a suspensão celular em dois tubos separados. Rotule um tubo para as células controle e outro para as células marcadas com CD45 no tubo controle. Adicione IgG kappa ZI em uma diluição de 1:250 até uma concentração final de 10 nanogramas por mililitro.No tubo de coloração CD45, adicione o anticorpo primário conjugado com ZI anti-CD45 na mesma concentração de 10 nanogramas por mililitro e incube as suspensões celulares em gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue as células a 400 ×g por três minutos a quatro graus Celsius e, então, descarte o sobrenadante.Lave as células duas vezes, ressuspendendo cada pellet em PBS estéril suplementado com 10% de FBS, seguido por centrifugação a 400 Gs durante três minutos a quatro graus Celsius. Após a lavagem, ressuspenda as células em um mililitro de solução de PBS contendo 10 microgramas por mililitro de corante dappy. Filtre a solução final através de tampas peneiras de 35 micrômetros em tubos de poliestireno de 12 milímetros por 75 milímetros, a fim de excluir agregados celulares ou detritos.Em seguida, exclua as células positivas para CD45 e as células mortas da suspensão utilizando classificação de células ativada por fluorescência para removê-las conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Misture a suspensão de células tumorais da próstata classificadas com proteínas da matriz extracelular em uma proporção de um para um e coloque a mistura no gelo. A seguir, anestesie um camundongo macho imunodeficiente com idade entre oito e dez semanas de acordo com as diretrizes institucionais, utilizando 5% de isoflurano inalado em um litro por minuto de oxigênio.Assegure uma anestesia adequada verificando a perda do reflexo corneano e do reflexo plantar no camundongo. Aspire 250 microlitros da suspensão celular utilizando uma agulha de 25 graus e uma seringa de um mililitro. Em seguida, injete todo o volume da suspensão celular da matriz extracelular por via subcutânea em ambos os flancos superiores do camundongo. Monitore os tumores realizando palpação semanal dos locais de injeção nos camundongos para detectar o crescimento de nódulos subcutâneos.Com base no método de seleção negativa utilizado neste protocolo, é necessário excluir as células mortas utilizando a coloração com DAPI. Como mostrado aqui, a porcentagem de células negativas para CD45 entre as células viáveis restantes é variável e depende da carga tumoral do paciente, mas são facilmente separadas das células positivas para CD45. Quando o correto direcionamento é utilizado, após a implantação da suspensão de células tumorais da próstata, densidades nodulares subcutâneas tornar-se-ão visíveis em ambos os flancos do camundongo.Cada densidade nodular representa o crescimento do xenoenxerto e pode ser distinguida do tecido saudável por se projetar da musculatura dorsal do camundongo e por ter uma textura mais firme. Modelos de xenoenxertos derivados de pacientes, gerados a partir de células tumorais circulantes, recapitulam tumores prostáticos humanos, conforme observado pela coloração com hematoxilina e eosina, e pela imuno-histoquímica para marcadores celulares específicos da próstata, como o receptor de andrógeno e o antígeno prostático específico da membrana. Após a geração dos xenoenxertos, outros protocolos, como o perfilhamento da expressão gênica ou proteica, podem ser realizados para explorar os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para a agressividade do câncer de próstata.

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Descreve-se o fabrico de peletes de hormonas comprimidos, bem como a implantação cirúrgica subcutânea em ratos. Esta estratégia pode ser combinado com o crescimento de células e de tecidos de xenoenxertos sob a cápsula renal de ratinhos nus atímicos para avaliar a carcinogénese hormonal e regulação do crescimento benigno da próstata.

Renal Capsule xeno e subcutânea Pellet Implantação de Avaliação de próstata Carcinogênese e hiperplasia benigna da próstata

O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Um modelo de câncer ortotópico fornece uma abordagem útil para entender a biologia do câncer de próstata e avaliar a eficácia dos regimes terapêuticos. Este protocolo descreve as etapas detalhadas necessárias para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata.

Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

Descreve-se um método para rotulagem de xenoenxertos estável derivado do doente (PDXs) com partículas lentivirais que expressam a proteína e repórteres de luciferase fluorescente verde. Este método permite acompanhar o crescimento de PDXs no sítio primário, bem como a detecção de metástases espontâneas e experimentais que utilizam em sistemas de imagem in vivo.

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a injeção intrabenigna de células de câncer de próstata, com posterior castração. Ortotópico modelos pré-clínicos de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração são críticos para estudar a doença no contexto de um microambiente do tumor clinicamente relevantes e um host imunocompetentes.

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

O protocolo atual descreve métodos para estabelecer modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) e linhas de célula cancerosas preliminares das amostras cirúrgicas do cancro gastric. Os métodos fornecem uma ferramenta útil para o desenvolvimento de drogas e pesquisa de biologia do câncer.

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

Aqui apresentamos um protocolo para testar a eficácia de terapias-alvo selecionadas com base na composição genômica de um tumor. O protocolo descreve a identificação e validação de rearranjos estruturais de DNA, o enxerto dos tumores dos pacientes em camundongos e as respostas de teste a medicamentos correspondentes.

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

Apresentamos um protocolo para gerar um modelo de câncer de pâncreas ortotópico minimamente invasivo por injeção guiada por ultrassom de células cancerígenas pancreáticas humanas e o subsequente monitoramento do crescimento tumoral in vivo por ultrassonografia.

Geração de um xenoenxerto ortotópico de células cancerígenas pancreáticas por injeção guiada por ultrassom

A heterogeneidade do câncer de próstata e a resistência ao tratamento continuam sendo desafios. Descrevemos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes (PDOs) que preservam as principais características do tumor parental. Este modelo padronizado suporta a triagem de medicamentos e os avanços da medicina de precisão.

Estabelecimento e manutenção de organoides de câncer de próstata derivados de pacientes: um protocolo experimental detalhado

Aprenda a gerar xenotransplantes derivados de pacientes com câncer de próstata a partir de células tumorais circulantes usando citometria de fluxo. Este método oferece um modelo experimental alternativo para estudar a progressão do câncer de próstata e desenvolver novos biomarcadores.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

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