Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Este manuscrito detalha um método usado para gerar xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de próstata (PDXs) a partir de células tumorais circulantes (CTCs). A geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um modelo experimental alternativo para estudar o câncer de próstata; o tumor mais comumente diagnosticado e uma causa frequente de morte por câncer em homens.

O objetivo geral do protocolo a seguir é gerar câncer de próstata. Xenoenxerto derivado do paciente de células tumorais circulantes. Isso é conseguido coletando primeiro sangue periférico de pacientes com câncer de próstata avançado.

Como segundo passo, o compartimento de células mononucleares do sangue é isolado, que contém as células tumorais circulantes. Em seguida, as células mononucleares são coradas com um anticorpo CD 45 ZI Para selecionar as células tumorais circulantes usando citometria de fluxo, as células são então injetadas em camundongos imunocomprometidos. Os resultados mostram a geração de xenoenxertos de câncer de próstata com base na injeção de células tumorais circulantes isoladas por citometria de fluxo do sangue periférico de pacientes com câncer de próstata.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de próstata, gerando novos modelos experimentais que podem ser usados para a caracterização molecular do câncer de próstata e o desenvolvimento de novos biomarcadores. Demonstrando o procedimento estarão Williams, um estudante do laboratório e Omada, um pesquisador do departamento de oncologia aqui no Mount Sinai Para começar a coletar sangue total de pacientes selecionados com câncer de próstata metastático, pois eles têm o potencial de ter um grande número de células tumorais circulantes em seu sangue periférico. Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, transfira todo o sangue para um tubo cônico de poliestireno de 50 mililitros, junto com a solução salina de equilíbrio de Hank.

Na proporção de um para um, pipete suavemente a mistura para homogeneizá-la. Em seguida, adicione 15 mililitros de uma solução de pacote de chamadas FI a um tubo cônico de poliestireno vazio de 50 mililitros. Pipete suavemente 20 mililitros de sangue total diluído, usando a configuração mais baixa no topo da solução para formar uma camada superior distinta.

Em seguida, centrifugue o tubo a 400 Gs por 30 minutos. À temperatura ambiente, ajuste a desaceleração da centrífuga para a configuração mais baixa para evitar a mistura de soluções após a separação. Após a centrifugação, identifique a faixa fina, branca e cinza das células mononucleares do sangue periférico e das células tumorais circulantes imprensadas entre a camada superior do plasma e a solução de separação.

No fundo do tubo, colete cuidadosamente as células da faixa cinza branca e transfira-as para um tubo de poliestireno de 50 mililitros. Usando uma pipeta de transferência de plástico, adicione a de Hank. Equilibrar a solução salina nas células isoladas para um volume total de 10 ml.

Centrifugue novamente a mistura a 400 Gs por 10 minutos em temperatura ambiente. Para lavar as células, remova o sobrenadante e repita essa lavagem. Dê um passo mais uma vez.

Após a segunda lavagem, descarte o sobrenadante. Suspenda o pellet restante em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incube a solução por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue a amostra a 400 Gs por três minutos à temperatura ambiente e remova o tampão de lise descartando o sobrenadante.

Finalmente, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS suplementado com 10% de soro bovino fetal antes da coloração. Quantifique o número de células viáveis usando o método padrão de exclusão de azul trian em um hemo, citômetro ou contador de células automatizado. Em seguida, dilua as células para 1 milhão de células por mililitro em PBS com 10% de FBS e coloque-as no gelo por uma hora.

Para bloquear a ligação inespecífica, distribua a suspensão celular em dois tubos separados. Rotule um tubo para células de controle e outro para células de coloração CD 45 no tubo de controle. Adicionar IgG a um Kappa Zi numa diluição de um a 250 até uma concentração final de 10 nanogramas por mililitro.

No tubo de coloração CD 45. Adicionar o anticorpo primário conjugado CD 45 ZI à mesma concentração de 10 nanogramas por mililitro e incubar as suspensões celulares em gelo durante 30 minutos. Em seguida, centrifugue as células a 400 Gs por três minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o snat.

Lave as células duas vezes, suspendendo cada pellet em PBS estéril suplementado com 10% de FBS, seguido de centrifugação a 400 Gs por três minutos a quatro graus Celsius. Após a lavagem do resus, suspenda as células em uma solução de um mililitro de PBS contendo 10 microgramas por mililitro de mancha manchada. Filtre a solução final através de tampas de filtro de 35 micrômetros em tubos de poliestireno de 12 milímetros por 75 milímetros para excluir quaisquer aglomerados ou detritos celulares.

Em seguida, exclua as células positivas CD 45 e as células mortas da suspensão, utilizando a classificação de células ativadas por fluorescência para as eliminar, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha o texto. Misture a suspensão de células tumorais de próstata selecionadas com proteínas da matriz extracelular na proporção de um para um e coloque a mistura no gelo. Em seguida, anestesiar uma boca imunodeficiente masculina de oito a 10 semanas de idade, de acordo com as diretrizes institucionais, usando flúor iso inalado a 5% em um litro por minuto de oxigênio.

Garanta a anestesia apropriada verificando se há perda de reflexo da córnea e do dedo do pé no camundongo. Retire 250 microlitros da suspensão celular usando uma agulha de calibre 25 e uma seringa de um mililitro. Em seguida, injete todo o volume da suspensão de células da matriz extracelular por via subcutânea em ambos os flancos superiores dos tumores do monitor de camundongo, realizando a palpação semanal dos locais de injeção do camundongo para o crescimento de densidades nodulares subcutâneas.

Com base no método de seleção negativa utilizado neste protocolo, é necessário excluir células mortas usando a coloração DAPI. Como mostrado aqui, a porcentagem de células CD45 negativas das células viáveis restantes é variável e depende da carga tumoral do paciente, mas são facilmente separadas das células CD45 positivas. Quando o gating adequado é usado, após a implantação da suspensão de células tumorais da próstata, as densidades nodulares subcutâneas se tornarão visíveis em ambos os flancos do camundongo.

Cada densidade nodular representa o crescimento do xenoenxerto e pode ser apreciada como distinta do tecido saudável, pois se projeta da musculatura dorsal do camundongo e tem uma textura mais firme. Modelos de xenoenxerto derivados de pacientes gerados a partir de células tumorais circulantes recapitulam tumores de próstata humanos como vistos pela coloração de hemat, toína e eosina, e por imuno-histoquímica para marcadores celulares específicos da próstata, como receptor de andrógeno e antígeno de membrana específico da próstata após gerar os xenoenxertos. Outros protocolos, como perfis de expressão gênica ou proteica, podem ser feitos para explorar os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para a agressividade do câncer de próstata.