Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

O objetivo geral da injeção de azul de Evans e dextrina Fitzy na veia cardinal comum é observar a integridade da membrana do músculo esquelético em zebrafish vivos, a fim de auxiliar na caracterização dos mecanismos causadores de doenças relacionadas a vários subtipos de distrofia muscular. A injeção do corante azul de Evans pode ajudar a revelar mecanismos biológicos que contribuem para a patologia da doença ao se caracterizar modelos animais de distrofia muscular; além disso, pode contribuir para o entendimento de possíveis mecanismos terapêuticos para o tratamento da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada e analisada utilizando zebrafish vivos.

Além disso, a co-injeção de Fitz Dextrin demonstra um controle de qualidade para uma injeção bem-sucedida, o que melhora o rigor e a quantificação. As implicações dessa técnica estão relacionadas à sua utilidade na validação de modelos de peixe-zebra para doenças musculares. Elas também aprimoram a compreensão de como certas mutações levam a fenótipos de doenças musculares, como a distrofia muscular, o que é essencial para encontrar tratamentos e curas.

Para preparar placas de injeção de ágar, ferva de dois a 3% de aros em meio E três e deixe a solução esfriar ligeiramente sobre a bancada. Despeje cerca de 35 mililitros da solução de ágar resfriada em cada placa de 100 milímetros. Em seguida, coloque uma extremidade de um molde de injeção preferido na solução antes de posicionar o restante do molde sobre a solução de ágar.

Deixe a solução de ágar solidificar à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius por cerca de 30 minutos. Em seguida, use uma espátula para separar uma extremidade do molde do ágar sólido e remova lentamente o restante do molde. Prepare um estoque de 1% do corante Azul de Evans ou EBD em solução de Ringer 1x.

Em seguida, prepare uma solução estoque de Fitzy Dextrin em solução de Ringer 1x e armazene a -20 °C. Para preparar a mistura de injeção, dilua o EBD a 0,1% diretamente na solução estoque de Fitzy Dextrin, vortexe bem a mistura de injeção e mantenha-a protegida da luz direta envolvendo o tubo com papel alumínio antes da injeção. Pré-aqueça a placa de injeção à temperatura ambiente.

Posicione o micromanipulador sobre uma placa de metal e coloque-o ao lado do microscópio de injeção. Ligue o controlador de microinjeção acionado por ar. Em seguida, com aproximadamente dois a quatro microlitros da mistura de EBD, preencha a agulha de injeção por trás.

Em seguida, calibre o volume de injeção com cerca de cinco nanolitros da mistura de EBD. Depois, use solução de Ringer 1x para umedecer a placa de injeção e remova o excesso de solução dos poços. Pré-trate as larvas com 0,04% de trica diluído em solução de Ringer 1x para imobilizar completamente as larvas antes da injeção com uma pipeta de vidro. Coloque as larvas anestesiadas nos poços das placas de injeção com parafuso sem-fim, garantindo que as larvas estejam completamente nos poços, deitadas de lado.

Remova a solução de trica em excesso para minimizar o movimento das larvas no poço, mas deixe quantidade suficiente para evitar desidratação. Coloque a placa de injeção com as larvas sobre um microscópio estereoscópico e posicione a agulha da pipeta de injeção contendo o EBD. Mova-se sobre uma larva de peixe-zebra próxima ao coração e a cerca de 45 graus do eixo anterior-posterior.

Insira a agulha de injeção na veia cardinosa comum ou CCV próxima à porção anterior da gema, onde a veia inicialmente se direciona dorsalmente. Em seguida, injete cinco nanolitros da mistura de EBD e mantenha a agulha de injeção na posição por cinco a oito segundos. Para minimizar o vazamento imediato da mistura de EBD, uma boa injeção mostrará corante nas câmaras cardíacas, e pode ser repetida.

Se o EB DMX não for observado no coração imediatamente após uma injeção bem-sucedida, o embrião acumulará Fitz Dextrin na vasculatura, conforme mostrado aqui. Após o número desejado de larvas ter sido injetado, devolva as larvas à solução de Ringer 1x sem trica em placas de 100 milímetros para aumentar a taxa de sobrevivência e manter a intensidade do sinal. Mantenha as placas envoltas em folha de alumínio.

Incube as larvas a 28,5 graus Celsius por quatro a seis horas para garantir a captação eficiente do EBD. Para visualizar o EBD no músculo, use trica a 0,04% para anestesiar as larvas antes de observá-las sob fluorescência vermelha. O EBD foi injetado na CCV de mutantes Sapia homozigotos e irmãos selvagens no 3º dia pós-fertilização; injeções que preencheram as câmaras cardíacas, como mostrado aqui, foram então analisadas quanto à perfusão bem-sucedida do corante, visualizando-se o dextrano fitzil na vasculatura sob fluorescência verde.

Após um período de incubação de quatro horas, a captação de EBD foi examinada ao nível do somito, conforme mostrado nesta figura. Irmãos selvagens não exibiram fluorescência de EBD em nenhuma das fibras musculares visíveis, enquanto os mutantes homozigotos sapia mostraram captação de EBD, indicando dano à membrana muscular. Após dominar a injeção eficiente de azul de Evans na veia cardinale comum de peixes-zebra, as larvas podem ser processadas em 30 a 60 minutos, dependendo do número de larvas a serem injetadas.

Além disso, os resultados experimentais podem ser obtidos em um único dia para garantir proficiência. É importante lembrar de mirar cuidadosamente na veia cardinal para produzir resultados consistentes e interpretáveis. Isso pode ser desafiador e provavelmente exigirá prática após este procedimento.

Outros métodos podem ser realizados, como telas químicas e genéticas, para determinar os mecanismos moleculares responsáveis pelos danos à membrana associados às distrofias musculares. Esses experimentos podem ajudar a estabelecer novas estratégias terapêuticas para doenças musculares após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de doenças musculares explorarem a integridade da membrana em modelos de peixe-zebra de distrofia muscular.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão completa de como injetar o corante azul de Evans na veia cardina comum de larvas de peixe-zebra. Você também deverá entender como identificar fibras musculares com danos na membrana devido à presença do corante azul de Evans dentro das fibras.