Name: Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a analisar a integridade da membrana muscular em larvas de zebrafish usando injeção de Evans Blue Dye na veia cardial comum. Este método permite avaliar danos em modelos de distrofia muscular em tempo real.

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Queremos agradecer Trent Waugh para a sua assistência técnica. Reconhecemos também o Departamento de Pediatria do Hospital for Sick Children e cura da distrofia muscular congênita (DMC) para seu financiamento generoso para este projeto.

1. Preparação de Agar placas de injeção (Tempo: 45 min) <ol><li> Ferver 2% a 3% de agarose em meio E3 e permita que a solução arrefecer ligeiramente no banco. Nota: O número de placas de injecção a ser preparado dita a quantidade de agarose necessária. Cada placa de injecção necessita de cerca de 35 ml da solução de agarose. </li><li> Depois de ferver, permitir que a agarose a arrefecer até a temperatura desejada seja atingida (por exemplo., 45 ° C) de acordo com as instruções do fabricante do molde de injecção. </li><li> Pour cerca de 35 ml de agarose a arrefecido em um prato de 100 mm. </li><li> Coloque uma extremidade do molde de injeção preferido na solução, em seguida, estabelecer restante do molde sobre solução de agarose (isso vai ajudar a reduzir a ocorrência de bolhas de ar). </li><li> Permitir que a solução de agarose para solidificar quer à TA ou a 4 ° C durante aproximadamente 30 min. </li><li> Usar uma espátula para separar uma extremidade do molde a partir da agarose sólida. Lentamente remover o restante do m<html> velho. </li></ol> 2. Preparação de Evans Blue Dye (EBD) Injeção Mix (Tempo: 30 min) <ol><li> Adicione um estoque de 1% de CAE em solução de 1X Ringer (NaCl 155; KCl 5 mM; CaCl2 2 mM; MgCl2 1 mM; 2 mM de Na 2 HPO 4; HEPES 10 mM; glucose 10 mM; pH a 7,2), que pode ser armazenado à temperatura ambiente. </li><li> Adicione uma solução de reserva de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano MW 10.000 kDa a 25 mg / ml em solução e armazenamento de 1X Ringer a -20 ° C. </li><li> Preparar a mistura de injecção através da diluição para 0,1% CAE directamente na solução estoque de estoque de FITC-dextrano (isto é, para um volume de trabalho de 100 uL finais:. Misturar 10 ul de 1% CAE em 90 ul de estoque de dextrano FITC). </li><li> Misture bem injeção vórtice (que deve ficar verde) e manter fora da luz direta envolvendo injeção de tubo de mistura em papel alumínio. </li></ol> 3. Preparação Injeção EBD (Tempo: Cerca de 30 min) ent &quot;&gt; Nota: protocolo funciona melhor com larvas de 3-7 dias após a fertilização (DPF). <ol><li> Placa de injecção pré-aquecer a RT. </li><li> Configure aparelho de injecção, organizando micromanipulador na placa de metal e ficar ao lado do microscópio que está sendo usado para a injeção. Ligue controlador de microinjeção ar conduzido. Nota: O sistema de injeção preferido irá variar em laboratório e não deve alterar resultado da análise. </li><li> Voltar encher agulha de injecção com cerca de 2-4 ul da mistura EBD. </li><li> Calibrar volume de injeção de cerca de 5 nl de mix EBD. Nota: Injecção de calibragem de volume dependerá método de calibração. Uma injecção de êmbolo accionado directamente pode ser definido para um determinado volume de injecção ao passo que os injectores de gás de pressão terá o volume de injecção de bolus por via do volume calibrado com a utilização de um micrómetro. </li><li> Placa de injecção molhada com solução de Ringer 1X e remover o excesso de poços. </li><li> Larvas pré-prazer, com 0,04% de acetato de 3-aminobenzoato de sal metanossulfonatot (tricaina) diluídos em solução de Ringer 1X para imobilizar larvas antes do início da injecção. Nota: Garantir larvas são completamente immotile é importante como uma injecção adequada é difícil com qualquer movimento residual. </li><li> Coloque larvas anestesiados nos poços das placas de agar utilizando injecção de uma pipeta de vidro. Certifique-se de que as larvas são completamente dentro do poço e deitado sobre seu lado. Nota: O número de larvas por poço é até o experimentador. </li><li> Depois de larvas são colocadas nas cavidades, remover excesso de solução de Ringer para minimizar o movimento larvas dentro do poço. Deixar uma quantidade residual de solução para que as larvas não desidratar. </li></ol> 4. Injeção Pericárdica de Zebrafish larvas com EBD (Tempo: Dependente do número de larvas de injecção, estima 1-3 hr) <ol><li> Colocar a placa de injecção contendo as larvas em um escopo de dissecação onde as injecções serão realizados. </li><li> Posicione a agulha pipeta de injeção contendoCAE misturar mais de um larvas do peixe. </li><li> Reposicionar a placa de injecção através da rotação de modo que a agulha de injecção está próximo do coração do larvas e cerca de 45 ° ventralmente em relação ao eixo ântero-posterior. </li><li> Inserir a agulha de injecção na veia cardinal comum (CCV) na região da veia na porção anterior da gema quando a veia está inicialmente rodar na direcção dorsal (Figura 1). Nota: A ampliação de até 40x pode ser útil para ver claramente o CCV. </li><li> Injectar 5 nl de mix EBD e manter agulha de injeção na posição para 5-8 segundos para minimizar a perda imediata do mix EBD. Nota: Uma boa injecção terá corante coloração visto nas câmaras do coração (Figura 1). Se EBD mistura não é observada no coração e, em seguida injectando um adicional de 5 nl mistura EBD pode ser suficiente para induzir a absorção do corante. Alternativamente, o embrião pode ser descartado. Nota: Em algumas situações, o coração pode parar de bater. Se este óccurs, continuar a acompanhar as larvas de 20-40 seg. Tipicamente, o coração recomeça a bater como o corante se move através do sistema circulatório. </li><li> Passar para a próxima larvas e repita. </li><li> Identificar embriões injectados com sucesso mediante a observação da presença de FITC-dextrano na vasculatura imediatamente após a injecção (Figura 2). </li></ol> 5. Incubação e EBD Captação (Tempo: 4-6 hr) <ol><li> Após o número desejado de larvas são injectados, larvas injectadas retorno para a solução de Ringer 1X sem tricaina em placas de 100 mm. </li><li> Mantenha pratos embrulhados em papel alumínio. Nota: Manter larvas injetadas no escuro aumenta significativamente as taxas de sobrevivência e garante a maior consistência na intensidade do sinal. Embalagem em folha de alumínio é especialmente importante durante o período de tempo que as larvas estão fora da incubadora. </li><li> Permitir que as larvas incubar a 28,5 ° C durante 4-6 horas para assegurar a aceitação EBD suficiente. </li></ol&gt; 6. Visualização da EBD no músculo (Tempo: Dependente do número de larvas e de injecção tipo de microscopia, estimados 0,5-3 hr) <ol><li> Antes de imagiologia, anestesiar as larvas com 0,04% tricaina para impedir o movimento. </li><li> Ver larvas sob fluorescência vermelha para determinar se está a ocorrer EBD captação no músculo esquelético (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+%28DMD%29+for+the+pediatricians+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pediatr+%28Phila%22%5BJournal%5D)">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li>
<li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+prominence%3A+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li>
<li>Lancet, , 381-845 (2013).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li>
<li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li>
<li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li>
<li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue%3A+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li>
<li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li>
<li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li>
<li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.</li>
<li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum%22%5BJournal%5D)">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Zebrafish estão emergindo como uma poderosa ferramenta para o estudo de 2,29 doença neuromuscular. Até à data, o sistema de peixe-zebra foi utilizado para validar causadores de doenças musculares nova mutações 16,17,30, elucidar novos patomecanismos 18, e potencialmente identificar novas drogas terapêuticas 12,24. Estes esforços coletivos estabeleceram a utilidade do peixe-zebra para modelar doenças neuromusculares humanas. No entanto, apesar dos avanços feitos com modelos de peixe-zebra e mamíferos, há opções limitadas de tratamento para pacientes dentro do amplo espectro de condições neuromusculares. Portanto, existe uma grande demanda para o desenvolvimento de terapia para esse grupo de doenças devastadoras. Em paralelo a essa demanda por terapêutica é a correspondente necessidade de inovação experimental em curso, bem como uma análise rigorosa para verificar novos modelos animais e estratégias terapêuticas putativos. Análise EBD é comumente usado em modelos de ratos paratecido estudo e danos celulares no cérebro, coração, músculo esquelético e 27,31. Mais notavelmente, EBD é amplamente utilizado em modelos de ratos com vários subtipos de distrofia muscular para mostrar a gravidade da membrana muscular instabilidade e danificar 8. O uso de CAE para revelar danos membrana muscular é um parâmetro de suporte que estabelece semelhanças entre o modelo animal para o estado de doença humana 9. O poder da EBD no rato levou vários laboratórios, inclusive o nosso, para desenvolver e aplicar EBD para modelos de peixe-zebra de doença neuromuscular. Devido à aplicabilidade da análise EBD, esta técnica está ativamente sendo implementadas para corroborar os modelos de peixe-zebra para o estado de doença humana 11,15,22,24,32. Larvas com as membranas musculares danificadas terá captação EBD e fluorescência vermelha, portanto, dentro de fibras musculares. A fluorescência observada no espaço entre as fibras, mas não nas fibras musculares individuais podem também ser informativo de fibras destacados do porão em t membranaele ausência de dano à membrana, fornecendo detalhes úteis de diagnóstico. Análise EBD tem potencial de aplicação para além validação do modelo animal. Os esforços do nosso laboratório demonstraram recentemente que a análise EBD é benéfica na validação de medicamentos terapêuticos potencialmente novos 24. Determinar se os potenciais tratamentos terapêuticos reduzir ou abolir a captação EBD em modelos de doenças neuromusculares podem significar ação terapêutica relevante 8. Este tipo de análise pode ajudar a estabelecer o mecanismo (s) de terapêuticas e expande a aplicação da análise EBD. Tal como acontece com muitas técnicas, análise EBD tem muitos cuidados a serem observados durante a concepção e prática experimental. Por exemplo, pode ser um desafio para identificar o CCV devido ao espessamento do tecido com a idade. Além disso, é fácil de danificar larvas em preparação antes e durante a injecção do pericárdio, reduzindo a contagem experimentais e aumentando a necessidade de preparar um grande número de larvas.Além disso, os danos físicos causados ​​ao larvas durante o manuseio e de injecção pode resultar em falsos positivos como músculo danificado pode levar até EBD. A fim de ultrapassar alguns destes obstáculos, descrevemos uma estratégia de co-injecção neste artigo de vídeo que permite a identificação fácil e fiável das larvas com infusão de corante sucesso imediatamente após a injecção e antes da análise subsequente. O FITC-dextrano controlos co-injecção para a injecção bem sucedido, permitindo a confirmação de CAE na vasculatura antes da sua absorção pelas fibras musculares. Isto pode ser particularmente útil como EBD fluorescência torna-se altamente difusa em larvas após várias horas, se não recolhidos nas fibras musculares; como tal, pode ser difícil de detectar. Além disso, a falta de CCV e injectando EBD na gema ou cavidade corporal pode, após a incubação, resultam em fluorescência vermelha difusa semelhante para controlar embriões, ainda com a probabilidade reduzida de absorção pelas fibras musculares danificadas. Coletivamente, estas cavernaats sugerem injeção EBD requer paciência e prática para alcançar resultados consistentes e confiáveis. Ao todo, nós descrevemos um método prático e simples para realizar a análise EBD em larvas do peixe. Até à data, a utilização de peixe-zebra como um sistema modelo, especialmente como um modelo da doença humana, tem vindo a expandir-se rapidamente. Esta expansão é parcialmente devido ao contínuo desenvolvimento e modificação de técnicas experimentais que melhoram sobre as vantagens atuais do sistema peixe-zebra. A técnica de injeção EBD fornece uma ferramenta adicional e poderosa para arsenal do pesquisador para a validação e estudo de modelos de doenças músculo de peixe-zebra. A implementação em curso e modificação desta técnica tem o potencial de ajudar a descobrir novas estratégias terapêuticas, bem como mecanismos que causam doenças.

As distrofias musculares constituem um grupo de doenças musculares humanas prevalentes e heterogêneas com características histopatológicas específicas1,2. Os sintomas tipicamente associados a esse grupo devastador de doenças incluem fraqueza muscular, degeneração muscular, perda de motilidade e mortalidade precoce1,3. Os principais mecanismos patológicos das distrofias musculares são a perda de proteínas que estabilizam o sarcolema, ancoram complexos transmembranares e medeiam a sinalização celular através da membrana4-6. Por exemplo, a perda completa da proteína distrofina, uma proteína de suporte primária do complexo distrofina-glicoproteína, resulta em desestabilização da membrana muscular na distrofia muscular de Duchenne7. Devido ao fato de que a maioria das distrofias musculares resulta de mutações em proteínas que participam da ligação entre a matriz extracelular e o citoesqueleto sarcolemal, uma observação comum no nível celular é a perda da integridade sacrolâmica8,9. Essa compreensão do(s) principal(is) mecanismo(s) associado(s) às distrofias musculares é o produto de vários anos de pesquisa empregando sistemas de modelos animais2,10-15. No entanto, apesar dos avanços no campo, ainda existem opções terapêuticas limitadas para o tratamento ou manejo da gama de subtipos de distrofia. Essa limitação de terapias viáveis se deve a vários fatores-chave: 1) a dificuldade das estratégias de terapia gênica, 2) uma alta frequência de casos de doença de novo e a correspondente falta de modelos animais traduzíveis e 3) a falta de estratégias rigorosas para testar as consequências fisiológicas de agentes terapêuticos putativos com medidas de resultados claras e reprodutíveis.
Para superar algumas dessas limitações, vários laboratórios, incluindo o nosso, estão empregando o peixe-zebra como um sistema para modelar e estudar doenças neuromusculares humanas2. Até o momento, o peixe-zebra provou ser uma ferramenta valiosa na pesquisa de doenças. O modelo do peixe-zebra tem sido usado para identificar e validar novas mutações causadoras de doenças humanas16,17, elucidar mecanismos causadores de doenças não caracterizadas17,18 e identificar novas estratégias terapêuticas12,19. Esses avanços foram feitos, em parte, pelos pontos fortes canônicos do sistema do peixe-zebra, como sua clareza óptica, facilidade de manipulação genética e capacidade de se reproduzir em grande número20. O peixe-zebra também provou ser passível de triagem de drogas em larga escala21, um método valioso para a identificação de novas terapias22-24. Em relação à pesquisa de doenças musculares, esses pontos fortes são complementados pela capacidade de isolar fibras musculares esqueléticas de peixe-zebra por meio de dissociação25 e pela capacidade de examinar a organização das miofibras in vivo usando o fenômeno óptico chamado birrefringência26, que coletivamente permite a determinação rápida da integridade muscular macroscópica. Independentemente desses utilitários disponíveis, o desenvolvimento adicional de ferramentas é continuamente necessário para avançar na investigação.
Nós e outros adaptamos um protocolo para injeção e análise de EBD no modelo de peixe-zebra. EBD é um corante vital permeável à célula que é absorvido por células danificadas, degeneradas ou apoptóticas e então visualizado sob fluorescência27. Até o momento, a análise de EBD tem sido amplamente utilizada para analisar a integridade da membrana muscular em modelos de camundongos de músculo esquelético e doenças cardíacas8,9,27. No entanto, em preparações de mamíferos, o músculo colhido normalmente requer seccionamento ou dissecação trabalhosa antes da análise. No peixe-zebra, a análise direta é possível em grande número usando animais vivos e intactos. Neste artigo em vídeo, demonstraremos a metodologia para realizar injeção e análise de EBD em larvas vivas de peixe-zebra, com imagens representativas da captação de EBD na linha mutante de distrofia de peixe-zebra sapje15,28. Além disso, apresentamos uma estratégia de co-injeção que permite aumentar a quantificação das preparações de EBD.

<table><tbody><tr><td>Isotiocianato-dextrano de fluoresceína MW 10.000</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Corante azul de Evan</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875712</td><td>Base de molde de injeção</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de parede fina</td><td>Instrumentos</td> <td>de precisão mundialTW100F-4</td><td>Para agulha de injeção</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Molde de</td></tr><tr><td>injeção Molde de microinjeção</td><td>Ferramentas de ciência adaptáveis</td><td>TU-1</td><td>Molde de injeção</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Solução de Ringer Cloreto de</td></tr><tr><td>potássio</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Solução de Ringer</td></tr><tr><td>Cloreto de magnessium hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Solução de Ringer</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Solução de Ringer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Solução de Ringer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Solução de Ringer</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C1061</td><td>Solução de Ringer</td></tr></tbody></table>

análise de zebrafish larvas músculo esquelético integrity com evans blue dye

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

O modelo zebrafish é um sistema emergente para o estudo de distúrbios neuromusculares. No estudo das doenças neuromusculares, a integridade da membrana muscular é um determinante crítico da doença. Até o momento, várias condições neuromusculares exibem fibras musculares degeneradas com integridade anormal da membrana; Isso é mais comumente observado em distrofias musculares. O corante azul de Evans (EBD) é um corante vital e permeável às células que é rapidamente absorvido por células degeneradas, danificadas ou apoptóticas; em contraste, não é absorvido por células com membrana intacta. A injeção de EBD é comumente empregada para verificar a integridade muscular em modelos de camundongos com doenças neuromusculares. No entanto, esses experimentos de EBD requerem dissecção e/ou secção muscular antes da análise. Em contraste, a absorção de EBD no peixe-zebra é visualizada em preparações vivas e intactas. Aqui, demonstramos uma metodologia simples e direta para realizar injeções e análises de EBD em peixes-zebra vivos. Além disso, demonstramos uma estratégia de co-injeção para aumentar a eficácia da análise de EBD. No geral, este artigo em vídeo fornece um esboço para realizar a injeção e caracterização de EBD em modelos de peixe-zebra de doença neuromuscular.

A mistura de injecção EBD foi injectada na CCV de mutantes homozigóticos sapje e irmãos de tipo selvagem no 3 dpf. As injecções que encheu as câmaras do coração (Figura 1B) foram então analisadas por injecção bem sucedida por meio da visualização de FITC-dextrano na vasculatura sob fluorescência verde (Figura 2). Após um período de incubação de 4 h, EBD absorção foi examinada a nível somito utilizando microscopia de fluorescência. Irmãos de tipo selvagem exibiram nenhuma fluorescência EBD dentro de quaisquer fibras musculares visíveis (Figura 3A), ao passo que os mutantes homozigóticos sapje EBD mostrou absorção, indicando os danos para a membrana muscular 15 (Figura 3B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> Figura 1. Injectar EBD mix injeção na veia cardinal comum (CCV) de um peixe-zebra embryo. Embrião (A) não injectado. Seta indica a localização ideal para a injeção CCV. (B) injecção bem sucedido para a CCV. O corante entra nas câmaras do coração (seta) e começa a ser bombeado através da vasculatura. (C) Uma injeção vencida CCV irá resultar em alguns ou todos do corante entrar no saco vitelino do embrião (seta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> Figura 2. Os embriões podem ser classificadas para injeção de sucesso, observando distribuição FITC-dextrano sob fluorescência verde em toda a vasculatura imediatamente a seguir à injecção e antes da EBD captação.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> Figura 3: EBD será retomada por fibras com membranas danificadas irmãos (A) do tipo selvagem mostrando ausência de fluorescência EBD nas fibras musculares.. (B) Sapje ​​mutante homozigótica com fluorescência EBD dentro múltiplas fibras musculares (setas). Todas as larvas foram injectados com a mistura de injecção CAE e analisados ​​após um período de incubação de 4 horas a 3 dpf. Irmãos e mutantes foram ordenados por fibra muscular destacamento antes da injeção CCV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra. Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

O objetivo geral da injeção de azul de Evans e dextrina Fitzy na veia cardinal comum é observar a integridade da membrana do músculo esquelético em zebrafish vivos, a fim de auxiliar na caracterização dos mecanismos causadores de doenças relacionadas a vários subtipos de distrofia muscular. A injeção do corante azul de Evans pode ajudar a revelar mecanismos biológicos que contribuem para a patologia da doença ao se caracterizar modelos animais de distrofia muscular; além disso, pode contribuir para o entendimento de possíveis mecanismos terapêuticos para o tratamento da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada e analisada utilizando zebrafish vivos.Além disso, a co-injeção de Fitz Dextrin demonstra um controle de qualidade para uma injeção bem-sucedida, o que melhora o rigor e a quantificação. As implicações dessa técnica estão relacionadas à sua utilidade na validação de modelos de peixe-zebra para doenças musculares. Elas também aprimoram a compreensão de como certas mutações levam a fenótipos de doenças musculares, como a distrofia muscular, o que é essencial para encontrar tratamentos e curas.Para preparar placas de injeção de ágar, ferva de dois a 3% de aros em meio E três e deixe a solução esfriar ligeiramente sobre a bancada. Despeje cerca de 35 mililitros da solução de ágar resfriada em cada placa de 100 milímetros. Em seguida, coloque uma extremidade de um molde de injeção preferido na solução antes de posicionar o restante do molde sobre a solução de ágar.Deixe a solução de ágar solidificar à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius por cerca de 30 minutos. Em seguida, use uma espátula para separar uma extremidade do molde do ágar sólido e remova lentamente o restante do molde. Prepare um estoque de 1% do corante Azul de Evans ou EBD em solução de Ringer 1x.Em seguida, prepare uma solução estoque de Fitzy Dextrin em solução de Ringer 1x e armazene a -20 °C. Para preparar a mistura de injeção, dilua o EBD a 0,1% diretamente na solução estoque de Fitzy Dextrin, vortexe bem a mistura de injeção e mantenha-a protegida da luz direta envolvendo o tubo com papel alumínio antes da injeção. Pré-aqueça a placa de injeção à temperatura ambiente.Posicione o micromanipulador sobre uma placa de metal e coloque-o ao lado do microscópio de injeção. Ligue o controlador de microinjeção acionado por ar. Em seguida, com aproximadamente dois a quatro microlitros da mistura de EBD, preencha a agulha de injeção por trás.Em seguida, calibre o volume de injeção com cerca de cinco nanolitros da mistura de EBD. Depois, use solução de Ringer 1x para umedecer a placa de injeção e remova o excesso de solução dos poços. Pré-trate as larvas com 0,04% de trica diluído em solução de Ringer 1x para imobilizar completamente as larvas antes da injeção com uma pipeta de vidro. Coloque as larvas anestesiadas nos poços das placas de injeção com parafuso sem-fim, garantindo que as larvas estejam completamente nos poços, deitadas de lado.Remova a solução de trica em excesso para minimizar o movimento das larvas no poço, mas deixe quantidade suficiente para evitar desidratação. Coloque a placa de injeção com as larvas sobre um microscópio estereoscópico e posicione a agulha da pipeta de injeção contendo o EBD. Mova-se sobre uma larva de peixe-zebra próxima ao coração e a cerca de 45 graus do eixo anterior-posterior.Insira a agulha de injeção na veia cardinosa comum ou CCV próxima à porção anterior da gema, onde a veia inicialmente se direciona dorsalmente. Em seguida, injete cinco nanolitros da mistura de EBD e mantenha a agulha de injeção na posição por cinco a oito segundos. Para minimizar o vazamento imediato da mistura de EBD, uma boa injeção mostrará corante nas câmaras cardíacas, e pode ser repetida.Se o EB DMX não for observado no coração imediatamente após uma injeção bem-sucedida, o embrião acumulará Fitz Dextrin na vasculatura, conforme mostrado aqui. Após o número desejado de larvas ter sido injetado, devolva as larvas à solução de Ringer 1x sem trica em placas de 100 milímetros para aumentar a taxa de sobrevivência e manter a intensidade do sinal. Mantenha as placas envoltas em folha de alumínio.Incube as larvas a 28,5 graus Celsius por quatro a seis horas para garantir a captação eficiente do EBD. Para visualizar o EBD no músculo, use trica a 0,04% para anestesiar as larvas antes de observá-las sob fluorescência vermelha. O EBD foi injetado na CCV de mutantes Sapia homozigotos e irmãos selvagens no 3º dia pós-fertilização; injeções que preencheram as câmaras cardíacas, como mostrado aqui, foram então analisadas quanto à perfusão bem-sucedida do corante, visualizando-se o dextrano fitzil na vasculatura sob fluorescência verde.Após um período de incubação de quatro horas, a captação de EBD foi examinada ao nível do somito, conforme mostrado nesta figura. Irmãos selvagens não exibiram fluorescência de EBD em nenhuma das fibras musculares visíveis, enquanto os mutantes homozigotos sapia mostraram captação de EBD, indicando dano à membrana muscular. Após dominar a injeção eficiente de azul de Evans na veia cardinale comum de peixes-zebra, as larvas podem ser processadas em 30 a 60 minutos, dependendo do número de larvas a serem injetadas.Além disso, os resultados experimentais podem ser obtidos em um único dia para garantir proficiência. É importante lembrar de mirar cuidadosamente na veia cardinal para produzir resultados consistentes e interpretáveis. Isso pode ser desafiador e provavelmente exigirá prática após este procedimento.Outros métodos podem ser realizados, como telas químicas e genéticas, para determinar os mecanismos moleculares responsáveis pelos danos à membrana associados às distrofias musculares. Esses experimentos podem ajudar a estabelecer novas estratégias terapêuticas para doenças musculares após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de doenças musculares explorarem a integridade da membrana em modelos de peixe-zebra de distrofia muscular.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão completa de como injetar o corante azul de Evans na veia cardina comum de larvas de peixe-zebra. Você também deverá entender como identificar fibras musculares com danos na membrana devido à presença do corante azul de Evans dentro das fibras.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

Medições da força pode ser usada para demonstrar as alterações na função muscular, devido ao desenvolvimento, lesões, doença, o tratamento ou a toxicidade química. Neste vídeo, demonstramos um método para medir a força durante uma contração máxima de zebrafish músculos do tronco larval.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em C. elegans

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

A Análise de Elementos Finitos é uma ferramenta frequentemente usada para investigar o desempenho mecânico de estruturas sob carga. Aqui, aplicamos seu uso para modelar a biomecânica da mandíbula do peixe-zebra.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.

Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Este protocolo descreve um modelo de criolesão para induzir danos profundos de vários miômeros caudais em zebrafish adultos. Este método fornece uma nova abordagem para o estudo da regeneração muscular esquelética após perda severa de tecido em vertebrados não mamíferos.

Modelo de criolesão para o estudo da regeneração muscular esquelética do pedúnculo caudal em zebrafish adulto

Aprenda a analisar a integridade da membrana muscular em larvas de zebrafish usando injeção de Evans Blue Dye na veia cardial comum. Este método permite avaliar danos em modelos de distrofia muscular em tempo real.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

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