Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

O objetivo geral da injeção de veia cardinal comum Evans Blue Dye e Fitzy Dextrin é observar a integridade da membrana muscular esquelética em peixes-zebra vivos para ajudar a caracterizar os mecanismos causadores de doenças relacionados a vários subtipos de distrofia muscular. A injeção de corante azul de Evan pode ajudar a descobrir mecanismos biológicos que contribuem para a patologia da doença ao caracterizar modelos animais na distrofia muscular, também pode contribuir para nossa compreensão dos potenciais mecanismos terapêuticos para o tratamento da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada e analisada com peixe-zebra vivo.

Além disso, a coinjeção de Fitz Dextrin demonstra um controle de qualidade para uma injeção bem-sucedida, o que melhora o rigor e a quantificação. As implicações desta técnica estão relacionadas à utilidade na validação de modelos de peixe-zebra de doenças musculares. Eles também melhoram a compreensão de como certas mutações levam a fenótipos de doenças musculares, como a distrofia muscular, que é fundamental para encontrar tratamentos e curas.

Para preparar placas de injeção de ágar, ferva dois a 3% aros em E três meios e deixe a solução esfriar ligeiramente na bancada. Despeje cerca de 35 mililitros do agros resfriado em cada prato de 100 milímetros. Em seguida, coloque uma extremidade de um molde de injeção preferido na solução antes de colocar o restante do molde na solução agrícola.

Deixe a solução agro solidificar em temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius por cerca de 30 minutos. Em seguida, use uma espátula para separar uma extremidade do molde do agros sólido e remova lentamente o restante do molde. Faça um estoque de 1% de corante azul de Evan ou EBD em uma solução de campainha.

Em seguida, prepare uma solução estoque de Fitzy Dextrin em uma solução de campainha e armazene a 20 graus Celsius negativos. Para fazer uma mistura de injeção, dilua o EBD a 0,1% diretamente na solução de estoque Fitz Dextrin, bata completamente a mistura de injeção e mantenha-a longe da luz direta usando papel alumínio para envolver o tubo antes da injeção. Pré-aqueça a placa de injeção à temperatura ambiente.

Disponha o micromanipulador em uma placa de metal e fique ao lado do microscópio de injeção. Ligue o controlador de microinjeção acionado por ar. Em seguida, com aproximadamente dois a quatro microlitros de mistura EBD, preencha a agulha de injeção.

Em seguida, calibre o volume de injeção com cerca de cinco nanolitros de mistura EBD. Em seguida, use uma solução de campainha para molhar a placa de injeção e remover o excesso de solução dos poços, pré-trate as larvas com 0,04% trica diluído em uma solução de campainha para imobilizar completamente as larvas antes de injetar com uma pipeta de vidro. Coloque as larvas anestesiadas nos poços das placas de injeção do sem-fim, garantindo que as larvas estejam completamente nos poços deitados de lado.

Remova o excesso de solução trica para minimizar o movimento das larvas dentro do poço, mas deixe o suficiente para evitar a desidratação. Coloque a placa de injeção de larvas em um escopo de dissecação e posicione a agulha da pipeta de injeção contendo o EBD. Misture sobre uma larva de peixe-zebra perto do coração e a cerca de 45 graus do eixo ântero-posterior.

Insira a agulha de injeção na veia cardinal comum ou CCV perto da porção anterior da gema, onde a veia inicialmente gira na direção dorsal. Em seguida, injete cinco nanolitros de mistura EBD e mantenha a agulha de injeção na posição por cinco a oito segundos. Para minimizar o vazamento imediato da mistura de EBD, uma boa injeção mostrará corante nas câmaras cardíacas e poderá ser repetida.

Se o EB DMX não for observado no coração imediatamente após uma injeção bem-sucedida, o embrião acumulará Fitz Dextrina na vasculatura, conforme mostrado aqui. Após a injeção do número desejado de larvas, retorne as larvas a uma solução de ringer sem trica em placas de 100 milímetros para aumentar a taxa de sobrevivência e manter a intensidade do sinal. Mantenha os pratos embrulhados em papel alumínio.

Incube as larvas a 28,5 graus Celsius por quatro a seis horas para garantir a absorção eficiente de EBD. Para visualizar EBD no músculo, use 0,04% trica para anestesiar as larvas antes de visualizar as larvas sob fluorescência vermelha. EBD foi injetado no CCV de mutantes homogêneos de Sapia e irmãos do tipo selvagem em injeções de PF 3D que encheram as câmaras cardíacas, como mostrado aqui, foram então analisados quanto à perfusão bem-sucedida da matriz, visualizando dextrina fitzy na vasculatura sob fluorescência verde.

Após um período de incubação de quatro horas, a absorção de EBD foi examinada no nível do ácaro, conforme mostrado nesta figura. Os irmãos do tipo selvagem não exibiram fluorescência de EBD dentro de nenhuma fibra muscular visível, enquanto os mutantes homozigotos de sapia mostraram captação de EBD indicando danos à membrana muscular. Uma vez proficiente a injeção do corante azul de Evans na veia cardinal comum do peixe-zebra, as larvas podem ser concluídas em 30 a 60 minutos, dependendo do número de larvas que estão sendo injetadas.

Além disso, os resultados experimentais podem ser obtidos em um único dia Para garantir a proficiência. É importante lembrar de apontar cuidadosamente para a veia cardinal para produzir resultados consistentes e interpretáveis. Isso pode ser desafiador e provavelmente exigirá prática após este procedimento.

Outros métodos podem ser realizados, como triagens químicas e genéticas, a fim de determinar os mecanismos moleculares responsáveis pelo dano à membrana associado às distrofias musculares. Esses experimentos podem ajudar a estabelecer novas estratégias terapêuticas para doenças musculares após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa de doenças musculares explorarem a integridade da membrana em modelos de distrofia muscular de peixe-zebra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão completa de como injetar o corante azul de Evan na veia cardinal comum das larvas de peixe-zebra. Você também deve entender como identificar fibras musculares com danos na membrana devido à presença do corante azul de Evan dentro das fibras.