Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a distribuição e a estequiometria dos receptores do fator de crescimento epidérmico ou EGFRs na membrana plasmática de células intactas e hidratadas por meio de microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica. Isso é alcançado primeiramente cultivando células que expressam EGFR, como as células cos seven, em microchips com uma membrana de nitreto de silício com 50 nanômetros de espessura, que se estende sobre uma área central em forma de janela. Em seguida, as células são incubadas com uma versão biotinilada do fator de crescimento epidérmico que se liga ao receptor e altera a conformação do EGFR, levando à dimerização e ativação.

Em seguida, as células são fixadas para imobilizar os receptores e incubadas com pontos quânticos conjugados desprovidos de anticorpos (stripped Hagen) que se ligam aos receptores ativados por EGF, e as células são então imageadas. Por fim, uma segunda fixação com glutaraldeído promove ligações cruzadas que fixam permanentemente os pontos quânticos conjugados desprovidos de anticorpos ao EGFR, estabilizando a amostra para microscopia eletrônica. Os resultados mostram uma emissão de fluorescência vermelha por meio da imageagem com pontos quânticos fluorescentes e a distribuição do EGFR, bem como seu estado estequiométrico ou agregação, por meio de microscopia eletrônica de transmissão com varredura.

Este método fornece informações únicas sobre a geometria e distribuição dos estoques de receptores de membrana em células intactas e pode ser utilizado para obter insights sobre a ativação do receptor do fator de crescimento epidérmico em células normais e em células cancerosas. Também pode ser aplicado para estudar outros receptores de membrana, como canais iônicos. Para começar, trabalhe sob uma capela química. Para as primeiras etapas de preparação das microplacas de membrana de nitreto de silício e após a imersão em acetona de acordo com o protocolo descrito, transfira diretamente as microplacas para um béquer contendo etanol e aguarde dois minutos; em seguida, remova as placas do etanol e coloque-as sobre um papel de sala limpa.

Após a secagem dos chips, transfira-os para uma lâmina de vidro previamente colocada em uma placa de Petri. Em seguida, coloque a tampa sobre a placa. Depois, insira a lâmina de vidro com os microchips em um limpador de plasma.

Execute um programa padrão de limpeza de cinco minutos para tornar a superfície da membrana de nitreto de silício hidrofílica. Em seguida, sob capela de fluxo laminar, transfira os microchips do vidro. Deslize-os sobre um lenço de sala limpa antes de colocá-los em um poço de uma placa de 24 poços preenchida com solução de poli-L-lisina ou PLL e incube por cinco minutos.

Em seguida, transfira os microchips um a um para um segundo poço contendo água grau HPLC antes de lavá-los em um segundo poço com água. Por fim, coloque os microchips individualmente em poços preenchidos com DM de uma placa de 96 poços e posicione a placa em um incubador de dióxido de carbono utilizando um subcultivo de células COS sete. Prepare uma suspensão celular monodispersa com uma concentração de aproximadamente cinco vezes 10º.

Cinco células por mililitro. Adicione uma gota de suspensão celular a cada microchip na placa de 96 poços e incube à temperatura ambiente por cinco minutos com um microscópio invertido. Comece a examinar as áreas dos microchips para obter uma densidade aproximada de 20 a 30 células por janela de 150 por 400 micrômetros.

Quando as células tiverem aderido suficientemente, transfira cuidadosamente os microchips com o espaçamento celular para novos poços contendo dm. Quando um número suficiente de células permanecer aderido, transfira os microchips com as células voltadas para cima para novos poços contendo dmm sem soro. Em seguida, incube os microchips a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por várias horas até a noite inteira para os passos seguintes.

Usando uma placa de 96 poços, reabasteça os poços com as soluções necessárias e utilize uma linha ou coluna por microchip. Lave os microchips colocando-os em um poço com B-S-A-G-E-L-P-B-S fresco e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Transfira os microchips para uma solução de EGF biotinilado de 300 nano molar e coloque-os novamente no incubador por três minutos, pois as células começarão a internalizar o EGFR marcado com EGF.

Use rapidamente PBS para lavar os microchips três vezes. Em seguida, use tampão de catecol a 0,1 molar ou CB para lavar as amostras. Em seguida, transfira os microchips para PFA a 3% e incube por 10 minutos.

Após lavar uma vez com CB e três vezes com PBS, transfira as lâminas para G-L-Y-P-B-S e incube por dois minutos. Em seguida, use PBS para lavar duas vezes. Agora, coloque as microchips em S-T-R-Q-D 10 NANOMOLAR por 10 minutos antes de lavar quatro vezes com B-S-A-P-B-S.

Em seguida, submerja um microchip em uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros previamente preenchida com B-S-A-P-B-S à temperatura ambiente para observar as células por microscopia DIC e de fluorescência. Utilize uma objetiva de ar de 40 x para imagens gerais das células marcadas com QD 6 55. Use um cubo de filtro que excite os pontos quânticos entre 340 e 380 nanômetros, com emissão acima de 420 nanômetros.

Minimize a intensidade da luz para evitar duas luzes intensas que possam danificar a amostra. Ajuste o tempo de exposição para pelo menos 300 milissegundos para que os sinais de todos os pontos quânticos sejam capturados, já que a fluorescência dos pontos quânticos pisca; ajuste a intensidade da luz e a amplificação para fornecer imagens brilhantes sem ruído visível na imagem, ao mesmo tempo em que se minimiza a intensidade da luz. Após a aquisição de imagens, coloque o microchip de volta em uma placa de 96 poços com B-S-A-P-B-S.

Lave uma vez em CB, depois transfira para uma solução de glutaraldeído a 2% e incube por mais 10 minutos. Lave e use PBS com BSA para lavar o microchip três vezes, armazenando-o em poços pré-preenchidos com PBS com BSA em uma nova placa de 96 poços para cada microchip. Preencha uma fileira de quatro poços com água grau HPLC.

Após configurar o MEV-SEM de acordo com o protocolo descrito, carregue uma amostra na platina STEM ESEM pré-COOL retirando a placa de 96 WAT do recipiente de refrigeração e colocando-a próxima à platina ESEM aberta. Coloque um lenço de sala limpa ao lado. Enxágue rapidamente um microchip mergulhando-o quatro vezes, por um segundo cada vez, em um poço contendo água grau HPLC.

Enxugue brevemente o lado posterior do microchip no papel e coloque-o na platina pré-resfriada com três microlitros de água grau HPLC resfriada. Umedeça a superfície da amostra e fixe a amostra na platina. Em seguida, coloque três gotas adicionais de água de três microlitros na platina próximo à amostra e feche a câmara de espécime.

Após identificar uma célula de interesse, de acordo com o protocolo descrito no texto, registre uma imagem geral em MEV da célula, mova-se para uma região periférica da célula onde a borda celular seja visível e aumente até uma magnificação de 50.000 X. Registre imagens mostrando QDs individuais e utilize tempos de permanência no pixel de 20 a 30 microssegundos. Aqui são mostrados QDs 655 marcados com EGFR ligado à membrana em células COS sete intactas e totalmente hidratadas. A imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) ilustra a topografia da membrana das células e a imagem de fluorescência correspondente mostra a distribuição de EGFR em toda a superfície da célula após três minutos de incubação com biotina-EGF.

Essas imagens de MEV-STEM de baixa ampliação revelam estruturas finas, como filópodes estendendo-se da célula em direção a células vizinhas, e algumas estruturas dentro das regiões celulares mais finas. Regiões celulares centrais espessas, incluindo o núcleo, aparecem brancas porque a transmissão através da amostra não é possível para elétrons com a energia utilizada. Alta resolução.

Imagens ESEM STEM das regiões periféricas mais finas mostram marcadores de QD em uma dobra da membrana que atravessa diagonalmente a imagem. Esta estrutura de membrana apresenta maior densidade de EGFR do que as regiões de membrana circundantes em diversos locais, com dois marcadores em proximidade. Dois exemplos com distâncias de 20 e 24 nanômetros são indicados com cabeças de seta.

Esses pares de rótulos são interpretados como pertencentes a EGFR. Esta imagem foi registrada de uma região com menor densidade de EGFR e sinal fluorescente. Apesar disso, o EGFR também foi encontrado aqui em dímeros, e dois aglomerados de 10 ou 11 EGFR estavam presentes.

Uma vez dominada, a preparação da amostra pode ser realizada em até duas horas, muito mais rápido do que as técnicas comumente utilizadas para microscopia eletrônica. A subsequente imagem STEM em essem pode fornecer até 100 imagens de alta resolução em meio dia.