Name: Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a usar PCR digital em gotículas para detectar mutações BRAF V600E em amostras FFPE de linhas celulares padrão. Este método automatizado permite análise rápida e precisa em oncologia molecular.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de P &amp; D para a Sociedade da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. Extração de DNA de linhas celulares FFPE Referência Padrão Nota: Para este procedimento, a extracção do ADN foi realizada a partir de linhas celulares padrão de referência (FFPE HD598, HD593, HD617, HD273 e de tipo selvagem (WT)) usando o kit de isolamento de DNA de tecidos FFPE como descrito no protocolo abaixo. Extracção automática do DNA foi conseguida seguindo as instruções do fabricante para o isolamento de DNA total. <ol><li> Usando um micrótomo eo bloco FFPE original, preparar manualmente seções frescas antes da extração de DNA e análise, de acordo com os procedimentos estabelecidos. Assegurar que a amostra de entrada para a secção (s) tecido analisado não exceda uma espessura total de 10 um e que a área de superfície que não excede 600 mm2 para uma única secção. </li></ol> 1.2 protocolo TPS Nota: As quantidades indicadas na Tabela 1 correspondem ao mínimo necessária para processar 48 amostras, e o procedimentoapresentadas estão de acordo com as diretrizes do TPS. Antes de iniciar o experimento estabelecer-se as amostras de FFPE em o e-tubo de centrifugação a 600 xg, para evitar a perda de amostras durante o programa automatizado. <ol><li> Ative o instrumento isolamento de ADN automatizada e computador. Abra o software de controle Run e inserir uma bandeja de carregamento automático em área de plataforma de carga do TPS. </li><li> Distribuir reagentes em suas depressões correspondentes, como mostrado na Figura 1. <ol><li> Coloque as amostras (4 BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% e 1%) nas cremalheiras porta-amostras. </li><li> Coloque as caixas de ponta nos cochos nas colunas 2 e 3 e confira as dicas para a presença de mais de um filtro por ponta, que irá abortar a execução. </li><li> Assegurar a mistura adequada de tampão de lise e o tampão de lavagem, invertendo-lhes 3-5 vezes e carregá-los para as respectivas calhas na coluna 4 (Figura 1). </li><li> Após a inversão de algumas vezes ou vort leveexing, carregar o tampão de eluição, esferas magnéticas, e tampão de FFPE em pequenas depressões na coluna 5, deixando um espaço vazio onde indicado (Figura 1, Tabela 1). </li><li> Coloque 2 ml de uma placa de profundidade bem (DWP) sobre o suporte da placa (Figura 1). </li></ol></li><li> Execute os seguintes passos finais antes de iniciar uma execução: <ol><li> Uncap todos os tubos e as calhas reagentes. Confirme que a capacidade suficiente disponível no frasco de resíduos líquidos. Confirme se o frasco de resíduos sólidos está vazio e forrado com um saco de risco biológico. Confirme se a placa de ejeção de ponta é centrado na montagem de resíduos. </li><li> Feche a tampa frontal. </li></ol></li><li> Inicie o software. Abra o arquivo NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Clique em &quot;Iniciar&quot;. O status do instrumento vai mudar de marcha lenta até execução. </li><li> Digite o número de amostras para essa execução. Escolha o método desejado para essa execução (DNA = 0). Introduza a posição da primeira alta volume ponta, a seleção de &quot;1&quot; se todas as bandejas estão cheias. Introduza a posição da primeira dica volume padrão, selecionando &quot;1&quot; se todas as bandejas estão cheias. Nota: O instrumento será executado através de etapas automatizadas, sem intervenção do usuário. Um fluxo de trabalho detalhado é mostrado na Figura 2. Uma vez que o experimento é terminada, os resíduos de reagentes e as pontas são injectados para dentro do conjunto de resíduos. </li><li> Quantificar ADN genómico purificado, utilizando um método fluorométrico. Nota: As amostras de DNA que contêm uma concentração mínima de 3,3 ng / mL são submetidos à análise ddPCR (seção 2). </li></ol> 2. Mutação DNA Profiling: ddPCR Protocol Nota: O protocolo de mutação de DNA profiling consiste em 3 etapas principais: 1) geração gota, 2) amplificação convencional PCR, 3) leitura da gota e 4) mutação do DNA profiling. 2.1. Geração de gotículas Nota: ddPCR é Supermixrecomendado para ddPCR, como esta mistura contém os reagentes necessários para a geração de gotículas. <ol><li> Para evitar a contaminação, siga as precauções padrão, como o uso de luvas, usando um capuz limpo PCR, pipetas limpas, e tubos de baixa ligação às proteínas. </li><li> Assegure-se que a concentração mínima da amostra de DNA genómico humano é de 3,3 ng / uL. Nota: A quantidade de concentração purificado amostra de DNA varia de acordo com a análise de detecção de frequência de mutação%. </li><li> Montar misturas reaccionais de PCR em placas de 96 poços. Descongelar e equilibrar os componentes da reacção à temperatura ambiente. Prepare reações de PCR, combinando 2X ddPCR supermix (10 ul) e 20 primers (frente e verso, a 900 nm) e sonda (250 milhas náuticas) com cada amostra de ADN purificado (66ng / 2 ul) fazer até 20 l com água destilada (como por o protocolo gerador de gota) </li><li> Vortex a mistura cuidadosamente para assegurar a homogeneidade e centrifugar para recolher rapidamente os conteúdos ao fundo do tubo antes de dispensar. Carga 20 &amp; #181, L para o cartucho para a formação de gotículas. </li><li> A operação do gerador de gotícula de, acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante <ol><li> Insira o cartucho no suporte com o entalhe do cartucho posicionado no lado superior esquerdo do titular. Adicionar 20 ul de mistura reaccional contendo amostras para o meio, e 70 ul de óleo de gerador para os poços de fundo. </li><li> Fixar a junta em toda a parte superior do cartucho. Certifique-se de que a junta está firmemente viciado em ambas as extremidades do titular; de outra forma, uma pressão suficiente para a geração de gotículas não serão alcançados. </li><li> Abra o gerador de gotículas ao pressionar o botão verde na parte superior do aparelho e inserir o cartucho. Quando o titular está na posição correta, tanto o poder (da esquerda para direita) e titular (médio direito) luzes indicadoras são verdes. </li><li> Pressione o botão de cima do instrumento novamente para fechar a porta e iniciar a geração de gotículas. Nota: Depois de pressionar a button, ele próprio um múltiplas posições ao longo dos poços de saída, desenho petróleo e amostras através dos canais microfluídicos, onde gotículas são criados. Gotas fluir para a gota bem, onde se acumulam. A luz indicadora de gota (à direita) pisca em verde após 10 segundos para indicar que a geração de gota está em andamento. </li><li> Quando a geração de gota está completa, todos os 3 luzes indicadoras de mudar para verde sólido; abrir a porta, pressionando o botão, e remova o suporte da unidade. Remover a vedação descartável do titular e descartá-lo. Nota: Os poços superior do cartucho conter gotículas, e os poços e inferiores são médias quase vazia, com uma pequena quantidade de óleo residual. </li></ol></li></ol> 2.2. Preparação para a PCR <ol><li> Para cada amostra, pipetar a 40 ul do conteúdo das gotículas a partir do topo bem os cartuchos num único poço de uma placa de 96 poços de PCR recomendado como indicado no protocolo do aparelho do fabricante. NãoTE: Usando uma pipeta multi-canal é ideal para a transferência de gotas de emulsões. Aspiração lenta e suave de gotículas é recomendado para minimizar corte gotícula durante as transferências. </li><li> Selar a placa PCR com a folha imediatamente após a transferência de gotas para evitar a evaporação. Use selos perfuráveis ​​placa de folha que são compatíveis com o vedante de placa de PCR e as agulhas no leitor de gotícula. Siga as instruções do manual da placa PCR instrução selador. </li><li> Ajustar a temperatura vedante de placa a 180 ° C e o tempo de 5 segundos. </li><li> Toque na seta para abrir a porta da bandeja. Posicione o bloco de suporte na bandeja com o lado de 96 poços voltada para cima. Colocar a placa de 96 poços para o bloco de suporte e assegurar que todos os poços da placa são alinhados com o bloco de suporte. </li><li> Cobrir a placa de 96 poços com uma folha de selagem de folha metálica perfurável. Uma vez que a placa de 96 poços é fixada no bloco de suporte e coberta com a folha de vedação perfurável, tocar no botão de vedação. O tabuleiro fecharáe vedação de calor irá iniciar. </li><li> Quando selagem térmica estiver concluída, a porta se abre automaticamente; remova a placa do bloco de calor de ciclos térmicos e, em seguida, remover o bloco de calor. </li><li> Assegurar que todos os poços da placa são vedados através da verificação de que as depressões na folha são facilmente aparentes ao longo cada poço. Uma vez selado, a placa está pronta para o ciclo térmico. </li><li> Uma vez que as gotículas são removidos, pressionar as patilhas de suporte do cartucho para abri-la. Remova o cartucho vazio e descartá-lo. </li><li> Realizar a amplificação por PCR convencional, seguindo os parâmetros descritos na Tabela 2. </li></ol> 2.3 leitura gota (conforme o protocolo recomendado pelo fabricante) Nota: Após amplificação por PCR do ácido nucleico alvo nas gotículas, o instrumento leitor gota analisa cada gotícula individual utilizando um sistema de detecção de 2-13 cor. Nós normalmente definido para detectar um FAMd VIC fluorophores repórter. <ol><li> Clique em &quot;sistema nivelado&quot; para preparar o leitor gota e torná-lo pronto para a análise ddPCR. </li><li> Coloque a placa no leitor de gota e clique em &quot;Iniciar&quot;. O leitor gota aspira cada amostra, singulates as gotas, e córregos-los em um único arquivo passado um detector de 2 cores. O detector lê as gotículas para enumerar as amostras positivas e negativas. </li><li> Quando leitura gota está completa, abra a porta e retire o suporte da placa da unidade. Remova a placa de 96 poços de PCR a partir do suporte e descartá-lo. </li><li> Para uma manutenção adequada, substitua o óleo leitor gota e esvaziar o recipiente de resíduos, conforme necessário. Adicionar 50 ml de 10% de água sanitária para o frasco de resíduos para evitar o crescimento microbiano. </li></ol> 2.4 ADN mutação perfis (de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante) Nota: Gotas de PCR-positivas e negativas por PCR são contados para fornecer Quantific absolutação de mutações BRAF V600E-alvo de DNA em forma digital, utilizando software de análise de dados. <ol><li> Clique em Configurar para inserir informações sobre as amostras, ensaios e experimentos. </li><li> Na janela de configuração, coloque uma placa (filename.qlp), em seguida, clique em Analisar para abrir e analisar os dados. A interface de análise de dados é separado em três janelas: Resultados da Mesa, Bem Seletor e processou dados / gráfica de vídeo. </li><li> Na janela de dados processados, os dados de concentração para cada alvo aparecem nos poços da placa mapa e estão tabelados na Tabela de Resultados. Clique Concentração de visualizar dados em parcelas de concentração. </li></ol>

<ol><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li>
<li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li>
<li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras%2FRaf%2F+MEK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+anti-cancer+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li>
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<li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li>
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<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Kim Eun, e Young Kim DEUG são funcionários da ABION CRO.

Aqui, destaca-se a aplicabilidade do ddPCR e isolamento de DNA a partir de amostras de linhas celulares FFPE padrão de referência para uma avaliação específica mutação genética. Neste estudo, a TPS método de isolamento de DNA automatizado é utilizado, que pode ser facilmente adaptado, automatizada, e pode acomodar até 48 amostras diferentes simultaneamente, permitindo experiências escala maior e menor variabilidade. Uma das limitações do isolamento de ADN no presente trabalho é que todas as amostras FFPE é único, e irá ...

A acumulação de mutações genéticas nos genes reguladores chave altera a programação de células normais como a proliferação celular, diferenciação, sobrevivência e, levando a um cancro. A via RAS-RAF-cinase de MAP-medeia as respostas celulares a sinais de crescimento. Mutações BRAF oncogênico pode resultar de mutações driver no gene BRAF, que podem causar o BRAF oncoprotein para tornar-se hiperativa 2. As mutações no gene BRAF também resultar na sinalização a jusante através hiperactiva MEK e ERK 3, que, por sua vez, conduz ao crescimento celular e proliferação excessiva de forma independente do crescimento mediada pelo factor de regulação 4-6. Várias ferramentas estão disponíveis para a mutação de DNA profiling, como em tempo real mutações BRAF V600E quantitativas na fixados em formol, embebidos em parafina (FFPE) de referência linhas de células normais por ddPCR. ddPCR é um método baseado na PCR, para a quantificação absolutaoferecendo maior precisão em comparação com em tempo real quantitativa de PCR convencional (qPCR) 7,8. ddPCR também oferece maior potência e precisão de resolução para a detecção de mutações raras em modelos de DNA, permitindo a pesquisa de cancro mais informativo e diagnóstico 9. Vantagens adicionais do ddPCR sobre qPCR convencional incluem a sua sensibilidade e precisão melhorada quando se estuda número de cópias baixo de modelo 10-12. Nisto, um protocolo de extracção automática de ADN a partir de linhas celulares FFPE padrão de referência, seguido pela determinação da presença ou ausência de mutações BRAF V600E por ddPCR é demonstrada. O uso de software para análise de dados e uma representação gráfica dos resultados são também descritos. Todo o procedimento é relativamente simples e completamente depende do número de amostras a serem perfiladas e o número de máquinas de PCR e ddPCR convencionais disponíveis. O protocolo seguinte descreve os procedimentos padrão para BR<html> Linhas celulares AF V600E-positivos FFPE de referência padrão (HD598, HD593, HD617, HD273 e do tipo selvagem (WT)) é realizado em um instrumento totalmente automatizada usando a preparação do sistema (TPS) protocolo de tecido. Subsequentemente, as amostras de ADN isoladas são analisadas quanto à presença de mutações de BRAF V600E usando o sistema ddPCR. Análise da mutação alvo é realizada após todas as amostras foram perfilado e os dados terem sido carregados no software de análise de dados. Dependendo do número de amostras / grupos estudados, a análise dos dados pode exigir a partir de uma a várias horas. O componente experimental da metodologia requer precisão na manipulação <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Isolando Nucleic Acids de levedura, um vídeo JoVE Educação Ciência explicando mais sobre sobre o contexto do RNA">de ADN</a> eneurológica Pipettes e Pipetadores, um vídeo de Educação Científica JoVE explicando mais sobre sobre o contexto de pipetagem &quot;&gt; pipetando para placas de 96 poços, enquanto a análise dos dados é realizada utilizando software.

<table><tbody><tr><td>Instrumento Hamilton MICROLAB STARlet IVD</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>Automated DNA Isolation</td></tr><tr><td>instrument QX200 Droplet Generator&nbsp;</td>Leitor de gotículas <td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200</td> Máquina de PCR convencional <td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>capaz de ajuste</td><td></td> de tempo de rampa <td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>Seladora de placas PCR PX1</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td> Kit <td>de isolamento de DNA Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa de Reagentes de Preparação de Tecidos VERSANT 1&nbsp;</td><td>Caixa de</td> Reagentes <td>de Preparação de</td> Tecidos Siemens 10632398 <td></td></tr><tr><td>VERSANT 1&nbsp;</td><td>Pontas Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE</td><td>Análise</td> de mutação DDPCR da Siemens <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>Cartucho de concentração DG8 BR186-3010</td><td>2X</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td>Óleo gerador de gotículas <td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Junta</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de leitor de gotículas</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

empregando digital gota pcr para detectar mutações braf v600e em parafina-encaixados linhas celulares de referência padrão fixadas em formalina

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR é um método de PCR altamente sensível que utiliza um sistema de emulsão água-óleo. Usando um gerador de gotículas, uma amostra de ácido nucleico extraída é particionada em ~ 20.000 gotículas de água em óleo de tamanho nanométrico, e a amplificação de PCR ocorre em gotículas individuais. A abordagem ddPCR está na identificação de mutações de sequência, alterações no número de cópias e rearranjos estruturais selecionados envolvendo genes-alvo. Aqui, demonstramos o uso de ddPCR como uma técnica poderosa para quantificar com precisão mutações raras de BRAF V600E em linhagens celulares padrão de referência FFPE, o que é útil na identificação de indivíduos com câncer. Em conclusão, a técnica de ddPCR oferece o potencial de traçar com precisão o perfil das mutações raras específicas em diferentes genes em vários tipos de amostras FFPE.

Pela nossa análise ddPCR, estudamos as linhas de células-padrão de referência mutação BRAF V600E FFPE. O leitor gota se conecta a um laptop software de análise de dados do computador de corrida. Cada gotícula individual é definido com base na amplitude fluorescente como sendo positivos ou negativos. O software fornecido pelo fabricante também permite um corte definido pelo usuário para ser inscrito para definir o limite entre as gotículas positivos e negativos. O número de gotículas de positivos e negativos em ...

O objetivo deste vídeo é para demonstrar como executar extração de DNA automatizado a partir de linhas fixas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de referência padrão de células e de gotículas digital de análise de PCR (ddPCR) para detectar mutações raras em um ambiente clínico. Detecção de mutações em amostras de FFPE demonstra a utilidade clínica de ddPCR em amostras FFPE.

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

O objetivo geral deste experimento é isolar o DNA genômico humano de linhagens celulares de referência padronizadas, fixadas em formalina e emblocadas em parafina, utilizando um sistema de preparação de tecidos, seguido pela análise das mutações BRAF V600E no DNA genômico por meio da técnica de digital droplet. A PCR em gotas digitais (ddPCR) pode ajudar a responder perguntas fundamentais na oncologia molecular, como a presença e abundância de mutações na sequência de BRAF e a quantificação de ácidos nucleicos em números baixos de cópias do molde. Embora este método esteja sendo demonstrado em linhagens celulares padronizadas, ele também pode ser aplicado a outras amostras biológicas, desde que se otimizem as condições para o isolamento do DNA de interesse.Este sistema de preparação de tecido pode ser usado para isolar até 48 amostras de DNA genômico humano livre de contaminantes em até quatro horas, em comparação com outros procedimentos manuais. Esse sistema é um pouco caro para a preparação devido ao uso de esferas magnéticas. No entanto, é mais seguro e produz clivagem de alta qualidade. A demonstração será feita por um pesquisador A e um técnico do nosso laboratório.A extração de DNA será realizada em um instrumento de isolamento de DNA totalmente automatizado, utilizando o sistema de preparação de tecidos ou protocolo TPS. Comece ligando o instrumento e o computador. Abra o software de controle de execução e insira uma bandeja de carregamento automático na área de carregamento do deck TPS.Em seguida, distribua os reagentes em suas respectivas canaletas conforme mostrado nesta figura e coloque as quatro amostras na grade do porta-amostras. Certifique-se de misturar adequadamente o tampão de lise e os tampões de lavagem invertendo-os de três a cinco vezes e, em seguida, carregue-os nas canaletas correspondentes na coluna quatro. Após inverter algumas vezes ou realizar uma vórtex suave, carregue o tampão de eluição, as microesferas magnéticas e o tampão FFPE nas canaletas pequenas da coluna cinco, deixando dois espaços vazios conforme indicado.Carregue uma placa de poços profundos de dois mililitros no suporte para placas. Antes de iniciar um ciclo, tampe todos os tubos e os reservatórios de reagentes. Confirme se há capacidade suficiente no frasco de resíduo líquido e se o frasco de resíduo sólido está vazio e forrado com um saco de biohazard.Confirme que a placa de ejeção da ponteira está centralizada no conjunto de descarte. Feche a tampa frontal, inicie o software e abra o ML starlet principal de preparo de ácidos nucleicos. Faça o arquivo med.Clique em iniciar. O status do instrumento mudará de ocioso para em execução. Insira o número de amostras para esta execução.Escolha o método desejado para esta execução. Insira a posição da primeira ponta de alto volume, selecionando uma. Se todas as bandejas estiverem cheias, insira a posição da primeira ponta de volume padrão, selecionando uma.Se todas as bandejas estiverem cheias, o instrumento executará os passos automatizados sem intervenção do usuário. Um fluxo de trabalho detalhado é mostrado aqui para evitar contaminação. Siga precauções padrão, como o uso de luvas e uma capela de PCR limpa.Pipetas limpas e tubos de baixa ligação a proteínas. Monte as misturas de reação em tiras de tubos para PCR, descongele e equilibre os componentes da reação à temperatura ambiente. A amostra de DNA genômico humano para análise por PCR em gotas digitais, ou D-D-P-C-R, deve ter uma concentração mínima de 3,3 nanogramas por microlitro.Prepare as reações de PCR. Combine a mistura super X-D-D-P-C-R 20x, os primers direto e reverso e a sonda com cada amostra de DNA purificada e complete até 20 microlitros com água destilada. Vortexie bem a mistura para garantir homogeneidade e centrifugue brevemente para recolher o conteúdo no fundo dos tubos antes da dispensação.Opere o gerador de gotículas conforme o protocolo recomendado pelo fabricante. Insira o cartucho no suporte com a ranhura do cartucho posicionada no canto superior esquerdo do suporte. Adicione 20 microlitros da mistura de reação contendo as amostras nos poços centrais e 70 microlitros de óleo gerador nos poços inferiores.Fixe a junta na parte superior da cartucho. Certifique-se de que a junta esteja firmemente presa em ambas as extremidades do suporte. Caso contrário, a pressão suficiente para a geração de gotículas não será alcançada.Abra o gerador de microgotas pressionando o botão verde na parte superior do instrumento. Insira o cartucho quando o suporte estiver na posição correta. As luzes indicadoras de energia e de suporte estão verdes.Pressione novamente o botão superior do instrumento para fechar a porta e iniciar a geração de gotículas. A luz indicadora de gotículas pisca em verde após 10 segundos, indicando que a geração de gotículas está em andamento. Quando a geração de gotículas for concluída, as três luzes indicadoras ficarão verdes fixas.Abra a porta pressionando o botão e remova o suporte da unidade. Remova a junta descartável do suporte e descarte-a. Observe que os poços superiores do cartucho contêm as gotículas, enquanto os poços médios e inferiores estão quase vazios, com uma pequena quantidade de óleo residual após a geração das gotículas.Prepare-se para a amplificação por PCR convencional. Para cada amostra, retire 40 microlitros do conteúdo das gotas do poço superior das cartuchas para um único poço de uma placa PCR de 96 poços recomendada, conforme indicado no protocolo do instrumento do fabricante; aspire a gota lentamente e com cuidado para minimizar o cisalhamento das gotas durante as transferências. Imediatamente após a transferência das gotas, a placa PCR deve ser selada para evitar evaporação.Defina a temperatura do selador de placas em 180 graus Celsius e o tempo em cinco segundos. Toque na seta para abrir a porta da bandeja. Posicione o bloco de suporte sobre a bandeja com o lado de 96 poços voltado para cima.Coloque a placa de 96 poços sobre o bloco de suporte e certifique-se de que todos os poços da placa estejam alinhados com a tampa do bloco de suporte. A placa de 96 poços com uma folha de selo de alumínio. Utilize selos de alumínio parafínicos compatíveis com seladora de placa PCR e com as agulhas no leitor de gotas. Uma vez que a placa de 96 poços esteja fixada no bloco de suporte e coberta com um selo de alumínio curável.Toque o botão de vedação. A bandeja fechará e o aquecimento do teto será iniciado. Quando a vedação térmica estiver concluída, a porta se abrirá automaticamente.Retire a placa do bloco de aquecimento e, em seguida, remova o bloco de aquecimento. Certifique-se de que todos os poços da placa estão selados, verificando as reentrâncias. O filme de alumínio é claramente visível sobre cada poço.Uma vez selada, a placa está pronta para o ciclo térmico. Realize a amplificação por PCR convencional seguindo os parâmetros detalhados no texto do protocolo. Após a conclusão da amplificação por PCR do alvo de ácido nucleico nas gotículas.O próximo passo é analisar cada gotícula individualmente utilizando um sistema de detecção de duas cores. Normalmente, o instrumento leitor de gotículas é configurado para detectar fluoróforos marcadores FAM e VIC. Clique em lavar o sistema para escorificar o leitor de gotículas e deixá-lo pronto para análise de D-D-P-C-R.Carregue a placa no leitor de gotas e clique em iniciar. Quando a leitura das gotas for concluída, abra a porta e remova o suporte da placa da unidade. Remova a placa de 96 poços do suporte e descarte-a.Posteriormente, realize o perfil de mutação do DNA utilizando software de análise de dados conforme descrito no texto do protocolo. Nessa análise D-D-P-C-R, as mutações RAF V600E foram estudadas. A fluorescência foi detectada e processada em uma exibição de gráfico de dispersão bidimensional.Um software personalizado foi utilizado para desenhar os limites apropriados e o número de gotículas dentro de cada limite foi contado. As gotículas representadas por pontos azuis acima da linha de corte rosa em todas as amostras são positivas. Para RAF mutado V600E e tipo selvagem BRA, as gotículas são representadas por pontos verdes em ambos os gráficos.Os pontos cinzentos na parte inferior são considerados como o fundo de fluorescência. As frequências alélicas mutantes globais foram então calculadas com base nas porcentagens relativas das concentrações de modelos do tipo selvagem bra e brav V600E detectadas em um semestre. A RH com a análise individual pode ser realizada dentro de quatro horas após esta postura.Outras amostras, como uma biópsia líquida de PPT, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como o monitoramento da progressão do câncer após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de diagnósticos complementares explorarem diversas detecções de mutações no campo da oncologia molecular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o sistema de preparação de tecidos e a P-C-R-S-A em gotas digitais para a detecção específica de uma mutação pontual no DNA.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

A PCR de bloqueio do tipo selvagem seguida de sequenciamento direto oferece um método altamente sensível de detecção de mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra.

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Detecção de ácido ribonucleico (cRNA) do sangue que circula é uma necessidade insatisfeita em diagnósticos clínicos. Aqui descrevemos os métodos que caracterizam cRNA de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células usando a reação em cadeia da polimerase digital sensível e específico. Os testes de requisitos de projeto para detectar variantes de fusão dentro de 72 horas.

Um sangue com base em teste para a detecção de ROS1 e RET transcrições de fusão do ácido ribonucleico, usando a reação em cadeia da polimerase Digital de circulação

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Aqui, descrevemos um em situ ensaio de hibridização que permite detecção sensível e específica de sequências tão curtas quanto 50 nucleótidos com single-nucleotide resolução a nível de célula única. O ensaio, que pode ser executado manualmente ou automaticamente, pode habilitar a visualização de variantes da tala, sequências curtas e mutações dentro do contexto de tecido.

Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

Este protocolo fornece um método reprodutível para visualizar a amplificação gênica em amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE).

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Identificação dos mecanismos subjacentes à lesão muscular é crucial. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Isto permite a análise da morfologia do músculo e localização de proteínas e outros componentes celulares do músculo.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Aprenda a usar PCR digital em gotículas para detectar mutações BRAF V600E em amostras FFPE de linhas celulares padrão. Este método automatizado permite análise rápida e precisa em oncologia molecular.

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina (Vídeo) | JoVE Journal

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

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