Name: Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda a criar um modelo de lesão cerebral em ratos por hipóxia-isquemia pré-natal e inflamação intra-amniótica com LPS. Este método reproduz insultos intrauterinos por infecção e insuficiência placentária.

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Os autores agradecem a Dan Firl, Chris Corbett e Jesse Denson, PhD. O financiamento foi fornecido pelo NIH R01 NINDS NS060765 para SR, o P30 Cobre Programa Piloto para a LJ e do Programa de Saúde da Criança Assinatura para LJ na Universidade do Novo México.

Cuidado Institucional e Comissões Use no hospital de ambos Boston Children ea Universidade do Novo México Centro de Ciências da Saúde aprovou todos os procedimentos experimentais. NOTA: Antes de iniciar o procedimento, selo, esterilizar e autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e campos cirúrgicos. Além disso, preparar medicamentos pós-operatórios em frascos esterilizados, incluindo 0,125% bipivucaine e 0,1 mg / kg de buprenorfina. Também preparar a solução de lipopolissacarídeo (LPS) de forma estéril: 0,04 mg / ml de LPS (0111: B4) em solução salina estéril contendo diluir corante azul de Evan. 1. Anestesia <ol><li> Induzir a anestesia em um dia embrionário 18 (E18) grávida de ratos Sprague Dawley com uma mistura de 3% de isoflurano equilibrado de nitrogênio 70% e 30% de oxigênio. </li><li> Remover rato a partir da câmara de indução e colocar o rato na posição supina drapeado cirúrgica cobertor de circulação de água regulado a 37 ° C. Transferir para anestesia nariz cone e reduzir isofluranível ne a 2%. </li><li> Gentilmente aplicar pomada oftálmica a cada olho para evitar o ressecamento da córnea. Durante o procedimento de monitorar continuamente a temperatura, taxa de respiração e batimentos cardíacos do animal. Fisiologia materna deveria permanecer estável durante todo o procedimento. </li></ol> 2. Prep Cirúrgica e Scrub <ol><li> Usando pequenas tesouras remover todos os pêlos na região abdominal inferior. Barbear em um padrão retangular com cuidado para evitar entalhar os mamilos ou a geração de erupção de barbear que pode ser irritante para o futuro dos cuidados de filhotes nascidos vivos. </li><li> Prepare a pele abdominal através da aplicação de iodopovidona e 70% de etanol matagal alternando com cotonetes estéreis. Repita o matagal tal que iodopovidona e 70% de etanol são cada aplicada 3x de maneira alternada. Deixe secar. </li><li> Confirme profundidade da anestesia via ausência de toe-pitada reflexo. Na ausência do reflexo à dor e estímulos, reduzir o nível de isoflurano a 1%. </li><li> Usando toalhas cirúrgicos estéreis,armar o animal. Tenha cuidado para colocar as cortinas em um ângulo adequado de tal forma que eles maximizar a quantidade de fluido de irrigação que absorvem enquanto não obstruindo o fluxo sanguíneo para os cornos uterinos. </li></ol> 3. Abdominal Laparotomia <ol><li> Usando um bisturi de fazer uma incisão na linha média de 3 cm de pele abdominal preparado. Sem rodeios dissecar a camada de pele da fáscia abdominal com uma tesoura. Usando fórceps e tesouras cirúrgicas, elevar a camada fascial abdominal e fazer uma incisão da linea alba avascular a ganhar acesso à cavidade peritoneal. </li><li> Coloque gaze cirúrgica no exterior da incisão e humedecer com solução salina estéril. Utilizando uma pinça sem corte e pressão externa sobre o abdômen, remova cuidadosamente os cornos uterinos da cavidade peritoneal e organizar na gaze umedecida. </li><li> Evitar cuidadosamente emaranhamento e entre em contato com o intestino. Organizar fetos usando uma pinça, contactando somente o tecido muscular entre sacos amniótico individuais.Expor e isolar as artérias uterinas 4 utilizando dissecção romba. NOTA: É preciso ter cuidado para dissecar as artérias uterinas. Tecido circundante e navios próprios são extremamente delicada. Danos aos vasos maternos pode causar sangramento e, em casos graves, morte fetal e materna. </li></ol> 4. Colocação de aneurisma Clipes <ol><li> Coloque um clipe de aneurisma rato G 30 em cada artéria uterina. Assegurar a cessação do fluxo sanguíneo, incluindo proximais e distais impulsos, e escurecimento dos vasos uterinos incluindo placentas individuais. Cubra as pontas expostas e toda campo cirúrgico com gaze e irrigar com solução salina estéril. Tome cuidado para manter o campo úmido com irrigação aproximadamente a cada 10 min. </li><li> Depois de 60 minutos, retire a gaze e irrigar o campo. Certifique-se de que os cornos uterinos e as embarcações estão devidamente umedecido para remoção clipe bem sucedido. Remova cuidadosamente cada clipe de aneurisma com a pinça. Tome cuidado para não causar trauma para o navio, e maintintegridade do tecido ain durante a remoção. </li><li> Completamente irrigar os cornos uterinos e campo, tendo o cuidado de remover quaisquer fios soltos de gaze dos sacos amniótico. </li></ol> 5. A injeção de lipopolissacarídeo para amniótico Sacs <ol><li> Na base de cada indivíduo saco amniótico, imediatamente anterior à placa placentária, injectar 100 ul de LPS (4 mg / SAC) com corante azul de Evan em diluída para o fluido amniótico. Use uma pinça sem corte para estabilizar e girar cada saco amniótico para uma posição ideal para injecção. Corante azul de Evan diluído é um agente de contraste que é útil para confirmar a colocação de seringa adequada e injeção. NOTA: Use apenas um ultra-fino seringa de 0,3 ml de insulina com anexado 8 milímetros 31 G agulha para as injeções intra-amniótica. Usando agulhas de calibre maiores resultará na perda de líquido amniótico crônica, morte fetal e reabsorção da gravidez. Pequenas quantidades de fuga de líquido amniótico após a remoção da seringa pode ser mitigciado por pressão direta para o saco amniótico. Alguns fetos de ratos pode tolerar um grau de oligohydramnios. No entanto, a perda de líquido amniótico aguda de punção com agulhas de calibre grandes, ou punção acidental, resultando em vazamento de fluido crônica, resulta em perda fetal e, em casos graves, perda de gravidezes vizinhos. </li><li> Irrigar o cornos uterinos 3x com solução salina estéril. </li></ol> 6. Fechando a Laparotomia <ol><li> Utilizando uma pinça, voltar cuidadosamente os cornos uterinos para a cavidade peritoneal. Garantindo um espaço adequado entre os sacos amniótico ea incisão na linha média, re-aproximar as bordas da camada musculofascial usando uma sutura de seda 3-0 em execução. Esteja ciente da colocação dos sacos amniótico ao fechar a incisão muscular. Tenha cuidado para não suturar em ou através de um saco. </li><li> Re-aproximar a camada de pele, utilizando uma sutura de seda 3-0 execução, o fechamento da camada de pele. NOTA: A laparotomia deve ser fechada em duas camadas de sutura contínua para permitirpara a pele e expansão muscular com o aumento da gestação. Suturas contínuas permitir a tensão ferida uniformemente distribuída. Suturas interrompidas são menos desejado como vários nós são irritantes e podem ser facilmente mastigado pelo rato em cima de recuperação da anestesia. Grampos cirúrgicos não são desejados. Caudas dos nós cirúrgicos deve ser cortado muito curto (&lt;3 mm). </li><li> Injectar 1 mL de 0.125% de bupivacaína por via subcutânea em torno de bordas da ferida usando uma agulha 26 G. Administrar uma dose de 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea na nuca do pescoço. </li><li> Desligue o isoflurano e toalha rato seco, se necessário. Coloque na gaiola casa limpa e monitorar a recuperação da anestesia. Certifique-rato não se torne hipotérmica. </li></ol> 7. Recuperação Pós-Operatória e Cuidados <ol><li> Monitorar o rato cada 8-12 horas para 72 horas e em seguida diariamente até filhotes nascem (aproximadamente E22 ou E23). Administrar doses adicionais de buprenorfina q8-12 h / 72 h ou prn como ditado pelo IACUC. </li><li> Monitorar ratos para sinais de dor, desconforto, sangramento vaginal ou sangramento do sítio cirúrgico. Inspecionar as suturas e incisão e tomar cuidado para garantir rato não está mastigando ou remover suas suturas prematuramente. Embora excepcionalmente raro, os ratos que comprometem suas suturas estão em risco de deiscência da ferida. NOTA: Ocasionalmente ratos podem ingerir quantidades excessivas de cama ou não alimentares, denominado pica, como um efeito colateral da administração buprenorfina. Embora muito raro, os ratos devem ser monitorados para pica e obstrução do intestino potencial subseqüente. </li></ol> 8. Tissue Processing e cryosectioning <ol><li> Para se preparar para Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) coloração do cérebro pós-natal, remover os filhotes de sua gaiola de origem no dia 2 pós-natal (P2). Usando uma tesoura cirúrgica decapitar filhotes de ratos e retire cuidadosamente o cérebro do crânio. </li><li> Gota correcção cérebro em um tubo de 15 ml contendo 7 ml de paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato(PBS). Coloque cérebro a 4 ° C e fixar durante 72 h. </li><li> Após 72 horas, transferir os cérebros a uma solução de PBS estéril contendo 30% de sacarose (w / v) e voltar a 4 ° C. NOTA: Uma vez que os cérebros cair na solução de sacarose eles estão prontos para ser seccionado em um criostato. </li><li> Rapidamente congelar cérebros e montar no pilão cryostat para aquisição de cortes coronais congeladas. Cortar 20 mm cortes coronais congeladas e montagem em lâminas. Garantir seções são recolhidas em série. </li><li> Permitir que as lâminas secar à temperatura ambiente durante a noite. Loja desliza a -20 ° C. </li></ol> 9. Hematoxilina &amp; eosina <ol><li> Tome slides montado cortes congelados e quente à temperatura ambiente. NOTA: Prepare todas as soluções fresco. </li><li> Colocar as lâminas em conjunto uma lâmina de aquecedor para 50 ° C durante 2 h. </li><li> Transferir as lâminas para um suporte de coloração. Dip desliza 10x em água deionizada bidestilada (ddH2O). </li><li> Incubar as lâminas em hematoxilina 100% para 5 min. Time em hematoxilina pode ser otimizada dependendo do grau de coloração roxa. </li><li> Dip slides em 4x torneira H 2 O, e deixe descansar em limpo torneira H2O para 1 min. </li><li> Dip slides para 15x ácido em álcool (250 ml etanol a 70% + 1 ml de ácido clorídrico concentrado). </li><li> Dip slides em 4x torneira H 2 O, e deixe descansar em limpo torneira H2O para 1 min. </li><li> Incubar em 1% de carbonato de lítio durante 2 min. </li><li> Dip slides em 4x torneira H 2 O, e deixe descansar em limpo torneira H2O para 1 min. </li><li> Incubar em etanol a 95% durante 1 min. </li><li> Dip slides 7x em 100% Eosina. Número de mergulhos em Eosina pode ser modificado dependendo do grau de coloração rosa. </li><li> Dip slides 5x em etanol a 95%. </li><li> 5x Dip slides em uma nova mudança de etanol a 95%. </li><li> Incubar as lâminas em etanol a 100% durante 1 min. </li><li> Incubar as lâminas em uma nova mudança de etanol a 100% durante 1 min. </li><li> Incubar as lâminas em 100% de xileno para 15 min. NOTA: Os passos xileno elamínulas deve ocorrer em um exaustor. </li><li> Incubar as lâminas em novas mudanças de xileno para 15 min. </li><li> Lamela com Permount e deixe secar no exaustor. </li><li> Imagem slides com um microscópio de luz. </li></ol>

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<li>Bergeron, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+injury+and+autistic+like+behavior+predominantly+affecting+male+rat+offspring+exposed+to+group+B+streptococcal+maternal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Devel+Neurosci%22%5BJournal%5D)">White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation.</a> Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).</li>
<li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Ureaplasma+parvum+lipoprotein+multiple+banded+antigen+on+pregnancy+outcome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice.</a> J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Encefalopatia da prematuridade é difícil de modelar em animais por causa da complexa interação de etiologias, curso do tempo do desenvolvimento neurológico, complexidade da formação da rede cerebral humano, sobrepondo mecanismos de lesão, e os diversos fenótipos de CNS insulta manifesto em prematuros humanos. EoP está associada com as vulnerabilidades no tipo específico de célula (isto é, oligodendrócitos imaturos) 21, bem como diversas vias desenvolvente reguladas (isto é subplate, transpor...

Com mais de 12% das crianças nascidas nos Estados Unidos antes da idade gestacional de 37 semanas estimada 1, lesão cerebral perinatal (PBI) da prematuridade é uma importante causa de incapacidade permanente. PBI da prematuridade, encefalopatia também denominado de prematuridade (EOP), afecta todo o sistema nervoso central (SNC). Lesão CNS muitas vezes começa no útero, e é agravada por processos de pré-natal, incluindo chorioamnionitis e complicações pós-natais, como hipóxia e sepse. PBI de insultos sistêmicos altera neurodesenvolvimento e leva à paralisia cerebral, epilepsia, atraso cognitivo e inúmeros transtornos neuropsiquiátricos afetando regulação emocional, memória e função executiva 1,2. Embora muito progresso tenha sido feito, uma compreensão limitada de como continua a ser as conseqüências celulares e moleculares da lesão CNS desde o nascimento prematuro traduzir para o grande número de sequelas neurológicas em crianças que nascem prematuros. Esta falta de conhecimento traseiraers diagnóstico em tempo real do CNS gravidade da lesão e dosagem informado das intervenções emergentes. Além disso, as estratégias terapêuticas adequadas à idade para essa população vulnerável paciente ainda imperceptíveis. Inflamação intra-uterino é muito comum na prematuridade extrema e envolve uma cascata inflamatória materno-fetal-placentária complexo 3. Infecção intra-uterina é frequentemente subclínica. Achados placentários específicos consistentes com inflamação aguda, ou corioamnionite histológica, são os principais determinantes da resposta inflamatória fetal e são coincidentes com lesão cerebral associada com o nascimento pré-termo 3-5. Na verdade, a resposta inflamatória fetal tem implicações clínicas distintas para resultados a longo prazo desde o nascimento prematuro. Os bebês que são pequenos para a idade gestacional (PIG) ​​ou que experimentam infecção são excepcionalmente vulneráveis ​​aos déficits neurológicos 3,4. Corioamnionite é um diagnóstico patológico típico após o nascimento prematuro <sup&gt; 6,7, e exame histológico revela sinais de inflamação em 70% das placentas de recém-nascidos muito prematuros 4. Além disso, corioamnionite é associado à disfunção cognitiva em dois anos 8. Evidência de subperfusão vascular materno na placenta de recém-nascidos prematuros extremos também está associada com paralisia cerebral na infância 9. O impacto sinérgico de corioamnionite e placentários defeitos de perfusão é bem ilustrado pelo notavelmente alto risco de resultados neurológicos anormais nessa população de pacientes aos dois anos de idade 10,11. Para imitar defeitos sistêmicos humanos placentária de perfusão e chorioamnionitis associadas com a inflamação induzida por patógeno, foi desenvolvido um modelo de pré-natal transitória sistêmica a hipóxia-isquemia (tshi) combinado com lipopolissacarídeo intra-amniótica (LPS) em ratos. Nosso objetivo foi adaptar o nosso modelo de tshi sozinho em ratos 12-16 para incluir a inflamação intra-uterina,para facilitar a modelagem pré-clínico de lesão do SNC associada com o nascimento prematuro. Tshi sozinho revelou perda persistente de células da linhagem oligodendrogliais, neurônios corticais, aumento da morte celular, e níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, com intervalos de isquemia progressivas que levam a um padrão de lesão classificada consistente com lesão cerebral pré-natal 16. Modificações isquémicos os componentes deste modelo também demonstraram défices de codificação da memória, a memória de curto e longo prazo e alterações músculo-esqueléticas leves em ratos com a idade 17-19. Na verdade, nós já demonstraram que a combinação de tshi + LPS recapitula as características fisiopatológicas da EoP, incluindo oligodendrócitos e perda neuronal, lesão axonal, inflamação celular e anormalidades funcionais 20.

<table><tbody><tr><td>Solução salina, 0,9%</td> <td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>LPS 011B4</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>Corante azul de</td><td>Evan Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>Biogel</td><td>40870</td><td></td></tr><tr><td>OU Toalhas</td><td>Cardinal Health</td><td>287000-008</td><td>Almofadas de preparação de álcool PDI estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Clippers Recarregáveis</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Esfoliação cirúrgica Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante para os olhos</td><td>Refresh Lacri Lube</td><td>00023-0312</td><td></td></tr><tr><td>Pinça sem corte</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td>Tesoura Roboz</tr><tr><td></td><td></td><td>RS-6808</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>FST</td><td></td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Agulha</td><td>BD</td><td>305122</td><td>25G 5/8</td></tr><tr><td>Agulha</td><td>BD</td><td>305128</td><td>30G 1</td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-114</td><td>Pequeno, 6 polegadas estéril</td></tr><tr><td>Esponja de gaze de algodão</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Kent Corporação Científica</td><td>INS600109</td><td>12,5 CM STR</td></tr><tr><td>Vessel Clips</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>INS600120</td><td>30G Pressão 3-0</td></tr><tr><td>Perma Hand Silk Sutures</td><td>Ethicon</td><td>1684G</td><td>Preto trançado, 3-0 (2 métricos), 18", não absorvível,&nbsp; PS-1 agulha de 24 mm,</td></tr><tr><td>seringas de insulina</td><td>de</td> 3/8 de círculo BD <td>328438</td><td>0,3 cc 3 mm 31G</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaína</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Lítio</td><td>Acros Chemicals</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Leica</td><td>3801521</td><td>Surgipath Gill II Hematoxilina</td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>Surgipath Eosina</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisherbrand</td><td>X3S-4</td><td>Grau Histológico</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisherbrand</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-548-5P</td><td>Fisher Finest Premium Coverglass</td></tr></tbody></table>

modelagem encefalopatia da prematuridade usando pré-natal hipóxia-isquemia com lipopolysaccharide intra-amniótica em ratos

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encefalopatia da prematuridade (final do período) é um termo que engloba o sistema nervoso central (CNS) anormalidades associadas à prematuridade. Para melhores objetivos translacionais antecedência e descobrir novas estratégias terapêuticas para a lesão cerebral associada ao nascimento prematuro, modelos pré-clínicos de EoP deve incluir mecanismos semelhantes de lesões pré-natal mundial observada em humanos e envolvem múltiplos componentes do sistema materno-fetal-placentária. Idealmente, os modelos devem produzir um espectro semelhante de déficits funcionais no animal maduro e recapitular vários aspectos da fisiopatologia. Para imitar os defeitos humanos sistêmicas da placenta de perfusão, subperfusão placentária e / ou chorioamnionitis associadas com a inflamação induzida por patógeno em parto prematuro cedo, foi desenvolvido um modelo de pré-natal transitória sistêmica a hipóxia-isquemia (tshi) combinado com lipopolissacarídeo intra-amniótica (LPS). Em grávidas ratos Sprague Dawley, tshi via oclusão da artéria uterina on dia embrionário 18 (E18) induz um defeito subperfusão placentária graduada associada com o aumento da lesão do SNC do feto. Quando combinado com injeções de LPS intra-amniótica, inflamação da placenta é aumentada e danos CNS é agravado com a matéria, da marcha e de imagem brancos anormalidades associadas. Pré-natal tshi e tshi + LPS insultos pré-natal atender vários dos critérios de um modelo EoP incluindo recapitulando o insulto intra-uterina, causando perda de neurônios, oligodendrócitos e axônios, perda de subplate e déficits funcionais em animais adultos que imitam aqueles observados em crianças nascidas extremamente prematuro. Além disso, este modelo permite a dissecção da inflamação induzida por tipos de lesões divergentes.

Seguindo tshi + LPS em E18, hematoxilina e eosina revela anormalidades histopatológicas significativas, tanto na placenta (Figura 1) e no cérebro (Figura 2). Placentas examinadas em E19 e E21 são grosseiramente edematosa com micro-hemorragia e necrose em toda a decídua e labirinto. Também se observa infiltrado inflamatório significativo e aumento da vascularização. Cérebros examinados em P2 revelar ventriculomegalia, bem como a substância branca e perda subplate neurônio em comparação c...

A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é fornecer um modelo reprodutível de lesão cerebral associada ao nascimento extremamente prematuro, por meio da indução de hipóxia sistêmica transitória in utero, isquemia e inflamação intra-amniótica, a fim de recapitular a insuficiência placentária e a corioamnionite em ratos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a patogênese da lesão cerebral perinatal decorrente de processos intrauterinos, facilitando o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas. A principal vantagem desta técnica é que ela induz uma lesão sistêmica que mimetiza os danos intrauterinos tanto por infecção quanto por hipóxia e isquemia, produzindo déficits neurológicos funcionais no rato adulto.Este modelo é particularmente adequado para analisar os mecanismos de lesão relacionados à inflamação. Como os estímulos de hipóxia, isquemia e infecção podem ser testados individualmente ou como uma lesão combinada, o procedimento será demonstrado por Lindsey Chan, uma técnica do nosso laboratório. Antes de iniciar o procedimento, utilize uma tesoura elétrica para pequenos animais para remover todos os pelos da região abdominal inferior de um embrião no dia.18 ratas prenhes em um padrão retangular, tomando cuidado para não cortar os mamilos ou causar irritação da pele. Em seguida, usando cotonetes estéreis, esfregue a pele com três aplicações alternadas de iodopovidona e etanol 70%. Quando a pele estiver seca, confirme a profundidade adequada da anestesia por meio do reflexo de pinçamento dos dedos dos pés e cubra o animal.Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão mediana de três centímetros no abdômen do animal, seguida por dissecação romba da camada de pele a partir da fáscia abdominal com tesoura. Usando pinça e tesoura cirúrgica, eleve a camada da fáscia abdominal e faça uma incisão através da linha alba avascular.Quando a cavidade peritoneal for exposta, coloque uma gaze cirúrgica na parte externa da incisão e umedeça a gaze com solução salina estéril. Em seguida, utilizando pinças rombas e pressão externa sobre o abdômen, retire suavemente os cornos uterinos da cavidade peritoneal e organize-os sobre a gaze umedecida. Tendo o cuidado de evitar emaranhamento e contato com os intestinos, utilize apenas o tecido muscular entre os sacos amnióticos individuais para posicionar os fetos.Em seguida, utilizando dissecação romba, exponha e isole as quatro artérias uterinas. Tendo cuidado para não danificar os vasos maternos quando as artérias forem isoladas. Coloque um clipe de aneurisma para rato de calibre 30 em cada vaso. Antes de aplicar os clipes, é importante garantir que todos os tecidos ao redor estejam completamente livres.Ao posicionar os clipes, segure-os com pinça romba e, em seguida, coloque-os em paralelo. Observar a cessação do pulso é essencial para garantir hipóxia isquêmica completa após a colocação de todos os clipes. Confirme a cessação dos pulsos proximal e distal e o escurecimento dos vasos uterinos, inclusive nas placentas individuais.Em seguida, cubra todo o campo cirúrgico com gaze e irrigue o tecido com solução salina estéril. A cada 10 minutos durante uma hora após 60 minutos, remova a gaze e irrigue o campo novamente. Quando os cornos uterinos e os vasos estiverem adequadamente umedecidos, use pinça para remover suavemente cada clipe de aneurisma, tomando cuidado para não causar trauma ao vaso e para manter a integridade do tecido.Em seguida, irrigue cuidadosamente os cornos e o campo cirúrgico. Uma última vez, tomando cuidado para remover quaisquer fios soltos de gaze dos sacos amnióticos. Para tratar os fetos com LPS, utilize pinças rombas para estabilizar e girar cada saco amniótico, de modo que a base de cada saco amniótico individual fique visível.Em seguida, carregue uma seringa de insulina ultrafina de 0,3 mililitro com uma agulha acoplada de 31 graus e oito milímetros com a solução de LPS e injete 100 microlitros da solução logo anterior a cada placa placentária. Ao retirar a agulha, aplique pressão direta sobre o saco amniótico para interromper qualquer vazamento de fluido. A inserção de uma agulha ultrafina de 31 graus na base do saco amniótico é essencial para uma correta administração do LPS sem permitir que o líquido amniótico escape.Após irrigar os cornos uterinos três vezes com soro fisiológico estéril, use uma pinça para reposicionar os cornos na cavidade peritoneal. Em seguida, utilize um ponto contínuo de seda 3-0 para reaproximar as bordas da camada musculofascial sem suturar dentro ou através de uma bolsa, seguido pelo fechamento da pele com outro ponto contínuo de seda 3,0. A seguir, utilize uma agulha de calibre 26 para administrar subcutaneamente.Injete um mililitro de bupivacaína 0,125% ao redor das bordas da ferida. Seque o rato com toalha conforme necessário e injete 0,1 miligrama por quilograma de buprenorfina na nuca. Coloque o animal em uma gaiola doméstica limpa com monitoramento até completa recuperação.Após hipóxia-isquemia sistêmica transitória e administração de LPS no dia 18 de desenvolvimento embrionário, conforme acabou de ser demonstrado, a coloração com hematoxilina e eosina revela anormalidades histopatológicas significativas tanto na placenta quanto no cérebro. De fato, placenta examinadas nos dias 19 e 21 de desenvolvimento embrionário apresentam-se macroscopicamente com micro-hemorragias e necrose difusas na decidua e no labirinto. Infiltrado inflamatório significativo e aumento da vascularização também são observados.Cérebros adicionais examinados no segundo dia pós-natal revelam alargamento ventricular, bem como perda de substância branca e de neurônios do subplaca, em comparação com os controles submetidos à hipóxia sistêmica transitória, isquemia e LPS, que também reduziram significativamente a expressão da proteína cotransportadora de potássio e cloreto dois, um cotransportador de cloreto essencial para o desenvolvimento da inibição GABAérgica na córtex no 15º dia pós-natal, o que está de acordo com a regulação inadequada observada durante o período crítico pós-natal de maturação dos circuitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão sólida de como realizar esta cirurgia em ratas prenhes e como induzir hipóxia-isquemia pré-natal transitória por meio da oclusão da artéria uterina, juntamente com inflamação intra-uterina por injeção intra-amniótica de solução de lipopolissacarídeo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 90 minutos, se realizada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O modelo de ratos pós-natal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral é um modelo bem estabelecido de humanos encefalopatia hipóxico isquêmica neonatal (HIE). Neste artigo, descrevemos o modelo de HIE em filhotes de ratos pós-natal.

O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia

Nós estabelecemos modelos do rato de leucomalácia periventricular (LPV), a lesão cerebral predominante em prematuros caracterizada por lesões na substância branca periventricular. Hipóxia / isquemia com / sem infecção sistêmica são as principais causas de LPV. Ligadura da carótida unilateral e exposição a hipóxia com / sem injeção de lipopolissacarídeo cria PVL-como lesões em camundongos P6.

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

Este vídeo demonstra o processo de indução da ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) e micro-hemorragias cerebrais em um modelo de rato usando lipopolissacarídeo (LPS). Ele destaca a sequência de respostas imunes que levam ao aumento da permeabilidade da BHE e subsequente dano ao tecido cerebral.

Indução de micro-hemorragias cerebrais em modelo de rato usando lipopolissacarídeo

Fonte: Jantzie, L. L., et. al. Modelagem de encefalopatia da prematuridade usando hipóxia-isquemia pré-natal com lipopolissacarídeo intra-amniótico em ratos. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um protocolo para induzir condições hipóxico-isquêmicas e inflamatórias em ratos fetais, restringindo o fluxo sanguíneo uterino e injetando LPS, modelando neuroinflamação e desenvolvimento cerebral interrompido relevante para estudos de parto prematuro.

Induzindo condições hipóxico-isquêmicas e inflamatórias para modelar encefalopatia em ratos pré-natais

A encefalopatia hipóxico-isquêmica após asfixia perinatal pode ser estudada usando modelos animais. Demonstramos os procedimentos necessários para estabelecer um modelo de leitão de encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal.

Um Modelo de Leitão Neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica

Leve hipoperfusão intra-uterina foi produzido por estenose da artéria com suportes de metal enrolado as artérias uterinas e dos ovários em ratos em embrionário dia 17. Este procedimento produziu hipoperfusão pré-natal e restrição de crescimento intra-uterino.

Um modelo do rato de leve hipoperfusão intra-uterino com estenose Microcoil

O método descreve inflamação sensibilizada hicóxico-isquêmica e lesão cerebral hiperoxica no furão P17 para modelar a interação complexa entre inflamação prolongada e lesão cerebral oxidativa experimentada em um número de bebês prematuros tardios.

Um modelo de furão de inflamação sensibilizada tardia preterm-isquêmica lesão cerebral

Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.

Modelagem da Hemorragia Intraventricular Neonatal Através da Injeção Intraventricular de Hemoglobina

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) pode ser modelada em ratos neonatais combinando corioamnionite e hemorragia intraventricular. A combinação desses eventos pré-natais e pós-natais recapitula com precisão as características clínicas da PHHP, incluindo macrocefalia, ventriculomegalia e pressão intracraniana elevada, ao longo da vida.

Modelagem da hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade em ratos

Filamentosas de oclusão da artéria cerebral média é um modelo comum para o estudo de AVC isquêmico em ratos.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Aprenda a criar um modelo de lesão cerebral em ratos por hipóxia-isquemia pré-natal e inflamação intra-amniótica com LPS. Este método reproduz insultos intrauterinos por infecção e insuficiência placentária.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

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