Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos
20 de novembro de 2015
A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.
O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é fornecer um modelo reprodutível de lesão cerebral associada a parto prematuro extremo, por meio da indução de insuficiência in-uterina, hipóxia sistêmica transitória, isquemia e inflamação intra-amniótica para recapitular, insuficiência placentária e corioamnioíte em ratos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a patogênese da lesão cerebral perinatal que surgem de processos intrauterinos, facilitando o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela induz a lesão sistêmica que mimetiza insultos intrauterinos de infecção e hipóxia, isquemia produzindo déficits neurológicos funcionais no rato maduro.
Este modelo é particularmente adequado para dissecar os mecanismos de lesão relacionados à inflamação. Como a hipóxia, isquemia e estímulos infecciosos podem ser testados individualmente ou como uma lesão combinada, demonstrando o procedimento estará Lindsey Chan, técnica do nosso laboratório. Antes de iniciar o procedimento, use uma tesoura de pequenos animais para remover todos os pelos da região abdominal inferior de um dia embrionário.
18 rata grávida em um padrão retangular, tomando cuidado para não cortar os mamilos ou gerar erupção cutânea. Em seguida, usando cotonetes estéreis, esfregue a pele com três aplicações alternadas de iodopovidona e etanol 70%. Quando a pele estiver seca, confirme a profundidade apropriada da anestesia com os dedos dos pés, aperte e cubra o animal.
Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão na linha média de três centímetros no abdômen do animal, seguida de dissecção romba da camada de pele da fáscia abdominal com tesoura. Uso de pinças e tesouras cirúrgicas. Eleve a camada da fáscia abdominal e faça uma incisão através do cotovelo linear avascular.
Quando a cavidade peritoneal estiver exposta, coloque gaze cirúrgica na parte externa da incisão e umedeça a gaze com solução salina estéril. Em seguida, usando uma pinça romba e pressão externa no abdômen, remova suavemente os chifres uterinos da cavidade peritoneal e arrume os chifres na gaze umedecida. Tomando cuidado para evitar o emaranhamento e o contato com os intestinos, use apenas o tecido muscular entre os sacos amnióticos individuais para organizar os fetos.
Em seguida, usando dissecção romba, exponha e isole as quatro artérias uterinas. Tomando cuidado para não danificar os vasos maternos quando as artérias estiverem isoladas. Coloque um clipe de aneurisma de rato de calibre 30 em cada vaso Antes de aplicar os clipes, é importante garantir que todo o tecido circundante esteja completamente limpo.
Ao colocar os clipes, prenda-os com a pinça romba e coloque-os em paralelo. Observar a cessação do pulso é fundamental para garantir a isquemia completa da hipóxia quando todos os clipes foram colocados. Confirme a cessação dos pulsos proximal e distal e o escurecimento dos vasos uterinos, inclusive nas placentas individuais.
Em seguida, cubra todo o campo cirúrgico com gaze e irrigue o tecido com solução salina estéril. A cada 10 minutos por uma hora após 60 minutos, retire a gaze e irrigue o campo novamente. Quando os cornos e vasos uterinos estiverem adequadamente umedecidos, use uma pinça para remover suavemente cada clipe de aneurisma, tomando cuidado para não causar trauma ao vaso e manter a integridade do tecido.
Em seguida, irrigue bem os chifres e o campo. Uma última vez, tendo o cuidado de remover quaisquer fios de gaze perdidos dos sacos amnióticos. Para tratar os fetos com LPS, use uma pinça romba para estabilizar e girar cada saco amniótico de modo que a base de cada saco amniótico individual fique visível.
Em seguida, carregue uma seringa de insulina ultrafina de 0,3 mililitro com uma agulha de calibre 31 de oito milímetros com solução de LPS e injete 100 microlitros da solução imediatamente anterior a cada placa placentária. À medida que a agulha é removida, aplique pressão direta no saco amniótico para impedir qualquer vazamento de fluido. A inserção de uma agulha ultrafina de calibre 31 na base do saco amniótico é fundamental para a administração adequada de LPS sem permitir que nenhum líquido amniótico escape.
Depois de irrigar os cornos uterinos três vezes com solução salina estéril, use uma pinça para retornar os chifres à cavidade peritoneal. Em seguida, use uma sutura de seda de três oh para aproximar novamente as bordas da camada fascial muscular sem suturar dentro ou através de um saco, seguido pelo fechamento da pele com outra sutura de seda 3.0 em execução. Em seguida, use uma agulha de calibre 26 por via subcutânea.
Injete um mililitro de 0,125% de bupivacaína ao redor das bordas da ferida. Seque o rato com uma toalha conforme necessário, injete 0,1 miligrama por quilograma de buprenorfina na nuca. Coloque o animal em uma gaiola doméstica limpa com monitoramento até que esteja totalmente recuperado.
Após a administração transitória de hipóxia sistêmica, isquemia e LPS no dia embrionário 18, como acabamos de demonstrar, a coloração de het e eosina revela anormalidades histopatológicas significativas na placenta e no cérebro. De fato, a placenta examinada nos dias embrionários 19 e 21 é emitida grosseiramente com micro hemorragia e necrose em toda a decídua e labirinto. Infiltrado inflamatório significativo e aumento da vascularização também são observados.
Outros cérebros examinados no segundo dia pós-natal revelam magaly ventricular, bem como perda de neurônios da substância branca e da subplaca em comparação com hipóxia sistêmica transitória simulada, isquemia e LPS também diminuíram significativamente a expressão da proteína do cotransportador de cloreto de potássio dois, um cotransportador de cloreto central para o desenvolvimento da inibição GABAérgica no córtex no dia pós-natal 15, o que é consistente com a regulação positiva do desenvolvimento prejudicada observada durante o período pós-natal crítico de maturação do circuito. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma sólida compreensão de como realizar esta cirurgia em ratas prenhes e como induzir isquemia de hipóxia transitória pré-natal por oclusão da artéria uterina com inflamação intra-uterina por meio de injeção intraamniótica de solução de lipopolissacarídeo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 90 minutos se for executada corretamente.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um modelo em rato que simula lesão cerebral associada ao nascimento extremamente prematuro por meio de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e inflamação intra-amniótica. O modelo tem como objetivo elucidar os mecanismos de lesão cerebral perinatal relacionados à infecção e à insuficiência placentária.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Medicina Perinatal
Antecedentes
- A encefalopatia da prematuridade envolve anormalidades do SNC decorrentes do nascimento prematuro.
- A corioamnionite e a hipoperfusão placentária são fatores significativos no desenvolvimento do SNC.
- Compreender esses fatores é essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- Processos intrauterinos podem levar a déficits neurológicos funcionais.
Objetivo do Estudo
- Criar um modelo reprodutível de lesão cerebral em ratos extremamente prematuros.
- Investigar os efeitos de lesões sistêmicas que simulam agressões intrauterinas.
- Explorar a patogênese da lesão cerebral perinatal.
Métodos Utilizados
- Indução de hipóxia sistêmica transitória in utero.
- Indução de isquemia e inflamação intra-amniótica.
- Uso de um modelo de rato para estudar os efeitos de lesões combinadas.
- Avaliação de déficits neurológicos funcionais em ratos adultos.
Resultados Principais
- O modelo mimetiza com sucesso os efeitos da infecção e da hipóxia-isquemia.
- Demonstrou a capacidade de testar os efeitos individuais e combinados de lesões.
- Forneceram insights sobre os mecanismos de lesão relacionados à inflamação.
- Facilitou o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas.
Conclusões
- Este modelo é valioso para estudar os mecanismos de lesão cerebral perinatal.
- Pode auxiliar na compreensão do impacto de condições intrauterinas no desenvolvimento do SNC.
- Pesquisas futuras podem utilizar este modelo para explorar intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo pré-natal em ratos aborda uma lacuna crítica na pesquisa da encefalopatia da prematuridade, combinando hipóxia-isquemia sistêmica transitória com inflamação intra-amniótica para imitar a hipoperfusão placentária humana e a corioamnionite. Ele permite a dissecção mecanicista de tipos diferentes de lesão — isquêmica versus infecciosa —, apoiando a validação de alvos terapêuticos e a descoberta de biomarcadores na neuroproteção perinatal. A capacidade do modelo de produzir déficits funcionais em ratos adultos que refletem fenótipos clínicos aumenta a confiança preditiva para triagem terapêutica pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar as vias de hipóxia-isquemia e inflamatórias em um modelo de lesão combinada.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de danos mensuráveis no SNC, incluindo perda de substância branca, de neurônios do subplaca e de oligodendrócitos.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao modelar patofisiologias convergentes observadas em recém-nascidos extremamente prematuros.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera indicadores neuroanatômicos e funcionais relevantes para doenças (anormalidades da marcha, morfologia ventricular, redução da KCC2) para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Fornece resultados reprodutíveis e quantificáveis em compartimentos placentários e fetais, permitindo triagem de compostos com alta fidelidade.
- Utilidade da Plataforma: Permite testes sequenciais de agressões individuais e combinadas para reduzir a ambiguidade mecanicista na identificação de compostos promissores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Recapitula múltiplos critérios de PEo—perda neuronal/axonal, degeneração da lâmina subplaca e déficits funcionais persistentes—, aumentando a validade translacional.
- Valor Operacional: Permite a continuidade do insulto pré-natal até o fenótipo pós-natal, apoiando o acompanhamento longitudinal de biomarcadores.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao modelar etiologias combinadas de insuficiência placentária e inflamação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a triagem fenotípica e a validação pré-clínica, especialmente para agentes neuroprotetores que visam vias inflamatórias ou hipóxico-isquêmicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desvinculação mecanicista ao permitir a análise da inflamação decorrente de diferentes tipos de lesão (isquêmica versus infecciosa) in utero.
- Triagem: Fornece resultados histopatológicos e comportamentais padronizados e quantitativos, essenciais para a reprodutibilidade dos ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite a comparação da gravidade da lesão por meio de histopatologia placentária, histologia cerebral fetal e ensaios neurofuncionais pós-natais.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à fisiopatologia clínica do EoP, apoiando a concordância de biomarcadores e a continuidade pré-clínica para clínica.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável para avaliação de monoterapias e intervenções combinadas em diferentes modalidades de lesão.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas lesões cerebrais perinatais ao modelar lesões placentárias e fetais sinérgicas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de cronometragem cirúrgica (E18), posicionamento de clipes e dosagem de LPS.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao modelar etiologias multifatoriais que levam ao fracasso clínico em estágios avançados da neuroproteção.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização estratificada por risco de compostos com base na eficácia em paradigmas de lesão isquêmica, inflamatória ou combinada.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia de roedores, isolamento da artéria uterina e manipulação do saco amniótico.
- Depende de instrumentação de precisão: clipes de aneurisma de calibre 30, seringas de insulina de calibre 31 e manutenção de campo estéril.
- Necessita padronização entre equipes cirúrgica, de histologia e de análise comportamental para fenotipagem consistente.
- A adaptação a outros modelos exige validação da dinâmica de perfusão placentária e da resposta dose-dependente inflamatória.
- As limitações práticas incluem a variabilidade cirúrgica na colocação dos clipes e na difusão de LPS, que devem ser controladas mediante verificação da cessação do pulso e irrigação com solução salina.
