Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar ao longo do tempo a desregulação do cálcio no retículo endoplasmático utilizando uma proteína relatora secretada. Isso é alcançado por meio da transgênese mediada por vetor viral do tecido-alvo, especificamente o fígado. Neste exemplo, com o repórter Gai luciferase circa, fluidos biológicos, como o sangue, são coletados para medir a quantidade de circa liberada a partir do tecido; em seguida, o substrato da luciferase é adicionado às amostras de plasma e a luminescência é medida para determinar a depleção de cálcio no retículo endoplasmático.

Os resultados mostram a desregulação do cálcio no retículo endoplasmático, indicada pelos níveis aumentados de C no plasma. A homeostase de cálcio no retículo endoplasmático pode ser monitorada por durações prolongadas mediante coleta repetida de pequenos volumes de fluidos biológicos. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como corantes de baixa afinidade para cálcio ou indicadores genéticos de cálcio, é que a homeostase de cálcio no retículo endoplasmático pode ser monitorada in vivo ao longo do tempo por meio de um procedimento minimamente invasivo. Existem duas vertentes terapêuticas para esta técnica.

O primeiro é triar fármacos que possam manter ou restaurar a homeostase de cálcio no retículo endoplasmatico ao estado fisiológico normal. A segunda abordagem é modificar a proteína terapêutica para se tornar AMPs terapêuticos, nos quais a secreção ocorre em resposta à diminuição de cálcio no retículo endoplasmatico. Embora este método possa fornecer informações sobre a desregulação de cálcio no retículo endoplasmatico no fígado.

Ele também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos, como cérebro, coração, músculo ou pâncreas. Após anestesiar uma rata Dolly Sprague-Dawley, de acordo com o protocolo descrito, aplique pomada oftálmica e realize uma compressão na cauda para verificar a anestesia, raspe a região do abdômen ligeiramente abaixo das costelas até a região abdominal média e limpe a área cirúrgica três vezes, alternando Betadine e etanol 70%. Em seguida, posicione a rata em posição supina sobre uma área cirúrgica estéril, cubra com campos cirúrgicos estéreis e dilua uma amostra de glucagon à concentração otimizada pelo usuário.

Neste caso, utilizamos 7,6 vezes 10 à nona potência de genomas virais por mililitro e misturamos invertendo o tubo. Em seguida, pipete 105 microlitros do A a V diluído em uma placa estéril e use uma agulha de 30 para coletar o vírus em uma seringa. Marque o local da incisão para expor o fígado para injeção usando um bisturi.

Realize uma incisão horizontal com cerca de dois a três centímetros de comprimento abaixo da caixa torácica. Realize dissecação romba para separar o tecido conjuntivo da hipoderme. Corte o músculo abdominal para expor o lobo medial direito do fígado.

Em seguida, posicione o animal sob um microscópio cirúrgico e ajuste para obter o lobo medial direito do fígado no campo de visão. Em seguida, utilizando a seringa, injete um terço do volume total do vírus em três locais no parênquima do lobo medial direito, mantendo a agulha no tecido por cinco a 10 segundos após a injeção para garantir a administração completa do volume injetado, suturando então o músculo abdominal e o corte, e utilize um aplicador de algodão para aplicar Neosporin. Coloque a rata em uma câmara de recuperação até que a consciência seja recuperada e o animal seja capaz de manter uma posição ereta antes de devolvê-lo à sua gaiola individual.

Quatro a sete dias após a injeção. Prepare os tubos para coleta de sangue etiquetando-os e pesando-os previamente. Em seguida, adicione 50 microlitros de 1000 unidades por mililitro de heparina a cada tubo.

Após anestesiar a rata de acordo com o protocolo descrito, realize uma compressão na cauda para verificar a sedação e, com tesoura estéril, corte a ponta da cauda a cerca de um a dois milímetros da extremidade. Colete mais de 100 microlitros de sangue, gota a gota, em um tubo pré-preenchido com heparina para interromper o sangramento.

Use um aplicador de algodão úmido para aplicar o pó STIC na cauda. Use um disco de etanol para limpar a tesoura e esterilizar a conta entre as coletas. Armazene os tubos de sangue a quatro graus Celsius.

Se for coletar amostras subsequentes, pese os tubos de coleta e ajuste a heparina para obter uma proporção de dois para um de sangue em relação à heparina. Este passo normalizará a quantidade de heparina em cada amostra. Centrifugue os tubos a 2000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Transfira o sobrenadante plasmático para um tubo novo e armazene a quatro graus Celsius por até 72 horas ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo para o ensaio de luciferase para administrar thaa garin como controle positivo. Dilua em etanol até uma concentração final de 2,5 miligramas por mililitro. Em seguida, injete um miligrama por quilograma por via intraperitoneal no abdômen inferior.

Colete a primeira amostra de sangue às 24 horas após a injeção, conforme descrito acima. Para medir a luminescência, prepare o substrato selen ezine de trabalho de acordo com o protocolo descrito no texto e incube-o à temperatura ambiente, protegido da luz, por 30 minutos.

Enquanto isso, descongele todas as amostras em gelo e transfira 10 microlitros de plasma para uma placa com paredes opacas usando um leitor de placas capaz de monitorar bioluminescência e equipado com um injetor de substrato. Prepare as linhas com o substrato. Injete 100 microlitros de substrato em um poço.

Agite em velocidade média por cinco segundos e meça a emissão de luz para amostras in vitro. Integre a emissão de luz ao longo de 0,5 segundos para o passo de leitura e, para amostras in vivo, integre ao longo de cinco segundos no passo de leitura para avaliar a homeostase de cálcio. Utilizando o Método Gluc SAR Camp, diversos controles podem ser incluídos, como um repórter secretado constitutivamente, como o Gluc Noag neste caso.

Um aumento nos níveis extracelulares de GLUC SAR camp e Gluc noag em resposta a condições experimentais seria considerado um resultado ambíguo. No entanto, um aumento na secreção de gluc SAR camp sem resposta de gluc noag apoia um evento dependente de cálcio do retículo endoplasmatico. Moduladores farmacológicos da reserva de cálcio do retículo endoplasmatico podem ser utilizados para confirmar a contribuição do cálcio do retículo endoplasmatico para a liberação de SAR camp em novos paradigmas.

Por exemplo, conforme demonstrado aqui, a dantroleno, um antagonista do receptor INE que estabiliza o cálcio do retículo endoplasmatico, inibe a liberação de AMPc SAR em resposta ao tioc argônio em estudos in vitro utilizando AMPc SAR baseado em gluc. A resposta induzida pelo tratamento deve ser melhor avaliada ao longo do curso temporal. Ao acompanhar as alterações na resposta relativa dentro de uma placa em comparação com os controles, não é aconselhável comparar números brutos entre várias placas, onde a degradação do substrato pode levar a alterações nos valores brutos. Para estudos in vivo, os dados devem ser avaliados independentemente para cada animal, com cada animal servindo como seu próprio controle pré-tratamento.

Isso é necessário para levar em conta a variabilidade na entrega e expressão do transgene entre os animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a tecnologia sircam para investigar a regulação de cálcio no retículo endoplasmatico em modelos roedores de doenças hepáticas. Não se esqueça de que o trabalho com vetores virais pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.