Name: Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um Gaussia Luciferase SERCaMP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a monitorar a homeostase do cálcio no retículo endoplasmático usando o SERCaMP com luciferase Gaussia em tecido hepático. Este método permite acompanhar a desregulação de cálcio de forma minimamente invasiva ao longo do tempo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Abuso de Drogas. Agradecemos a Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno e Josh Hinkle por suas contribuições para o desenvolvimento deste método.

<ol><li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li>
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<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
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<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intraorganellar+Ca2%2B+at+subcellular+resolution+using+CEPIA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153(2014).</li>
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<li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCaMP%3A+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li>
<li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+%28MANF%29+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li>
<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo destaca o in vitro e in vivo da utilidade glic-SERCaMP para monitorar a depleção de cálcio ER. Embora a modificação de proteínas para gerar SERCaMP parece generalizar a outras proteínas repórter 12, optamos Gaussia luciferase por sua robusta (200-1.000 maior vezes) bioluminescência em comparação com outras luciferases 18. Nós demonstramos detectável libertação induzida por thapsigargin Gluc-SERCaMP através de uma gama de doses 100 vezes de vírus Gluc-SERCaMP entregu...

O funções em muitas capacidades celulares, incluindo o dobramento de proteínas, a secreção de proteínas, a homeostase lipídica e de sinalização intracelular 1 retículo endoplasmático (ER). Central para a função ER normal é manter as concentrações de cálcio luminais em ~ 5.000 vezes aqueles encontrados no citoplasma 2-4. Este processo intensivo de energia é regulada pela ATPase sarco / retículo endoplasmático de cálcio (SERCA), uma bomba que move íons de cálcio para o ER. O efluxo de cálcio do RE é mediada principalmente pela rianodina (RyR) e trifosfato de inositol (IP3R receptores). Uma vez que muitos processos de ER são dependentes de cálcio, interrompendo o armazenamento pode levar ao estresse ER e eventual morte celular. ER desregulação de cálcio tem sido observada em doenças, incluindo cardiomiopatia, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e 5. Devido à natureza progressiva destas doenças, tem sido um desafio para delinear a causa-efeito relação entre patogênese e alterações na loja ER cálcio. Uma série de tecnologias têm permitido avanços significativos em nossa compreensão da dinâmica ER cálcio, incluindo corantes e indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis). Corantes de cálcio de baixa afinidade, que aumentam em fluorescência quando ligados a Ca2 +, podem ser carregados em células para examinar compartimentos subcelulares com elevadas concentrações de cálcio 6. Gecis, tal como Catcher D1ER e permitir o monitoramento das flutuações de cálcio com um controle mais preciso da localização subcelular 7-9. Recentemente, uma outra classe de Gecis chamados indicadores de proteína encapsulada em organelo medição de cálcio (cepia) foram descritos 10. Uma terceira abordagem combinando genética e pequena molécula química é-esterase alvo corante de carga (TED), que utiliza um carboxilesterase geneticamente codificado (voltado para o ER) com um corante à base de cálcio éster 11. Enquanto o AFORementioned abordagens têm forças e fraquezas inerentes, podem fornecer informações valiosas sobre a dinâmica do cálcio ER através de medições agudos de fluorescência. Eles são, no entanto, não é óptima para os estudos longitudinais muitas vezes necessários para investigar a progressão da doença. Com o objectivo de conceber um método para controlar a dinâmica de cálcio durante grandes períodos de tempo, foram identificados e desenvolvida uma modificação da proteína para criar as proteínas secretadas de monitorização de cálcio ER (SERCaMPs) 12. SERCaMP contorna várias limitações associadas com outras metodologias, através de uma abordagem minimamente invasiva para interrogar repetidamente o armazenamento de cálcio ER. Temos anteriormente demonstrado que o péptido carboxi-terminal ASARTDL (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-leucina-ácido aspártico) é suficiente para promover a retenção no ER; no entanto, em condições que causam decréscimos em ER de cálcio, a sequência do péptido não é mais capaz de reter ER localization e a proteína é secretada 13. A base da tecnologia SERCaMP é o apêndice da ASARTDL ao terminal carboxi de uma proteína segregada (por exemplo, luciferase Gaussia, ou Gluc) de tal modo que a secreção é desencadeada pela depleção de cálcio ER, criando, assim, um repórter robusta de ER desregulação de cálcio 12. A expressão de glic-SERCaMP através de métodos transgénicos permite fluidos biológicos, incluindo meio de cultura celular e de plasma para ser analisado para alterações na actividade gluc como um indicador da homeostase do cálcio ER. O método tem aplicações para o estudo longitudinal de alterações progressivas na loja ER cálcio tanto in vitro como in vivo. O protocolo seguinte é escrito como um esboço geral para a utilização de base SERCaMP-Gluc para estudar a homeostase do cálcio ER, mas o protocolo pode servir como um guia para SERCaMPs repórter alternativos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Solução 10% NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>para ensaios intracelulares de GLuc</td></tr><tr><td>Seringas Luer-Lok de 1 ml</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro de 200 microlitros</td> Suturas cirúrgicas <td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Agulhas</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 G Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Folhas adesivas de vedação de microplacas</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fluxo automático de anestesia</td><td>EZ Anestesia</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de recuperação de animais</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solução Betadine</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Soro de crescimento bovino</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de corte Suturas circulares de 3/8</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrascônico digital</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM glicose alta, GlutaMAX, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Escada de massa de DNA</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase (proteína recombinante)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase anticorpo (para WB, ICC ou IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2,000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ensaio Gluc (96 poços, opacas)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Mordomo em pó hemostático</td><td>Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>Fisher a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Microfuge 22R</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel e PCR Cleanup</td><td>Pipeta Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X kit de titulação rápida</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Selo de filme PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Coquetel de</td> inibidores de protease Life Technologies <td>15140-122</td><td></td></tr> Filtro de carvão ReFresh <tr><td></td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi, #10</td><td>Ferramentas de ciência fina Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Ratos SD 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Ratos</td><td>ratos encomendados a 150-200 g.&nbsp; Cirurgia 5 dias após a chegada</td></tr><tr><td>Brincos para pequenos animais</td><td>National Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Campos cirúrgicos estéreis</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 leitor de placas</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>prejudicial a </td></tr><tr><td>Mistura de embalagens lentivirais de Virapower</td> de saúde humana Life <td>Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Transfection reagente</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio usando um<em&gt; gaussia</em&gt; luciferase sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

O retículo endoplasmático (ER) contém o mais alto nível de cálcio intracelular, com concentrações de aproximadamente 5000 vezes maior do que os níveis citoplasmáticos. Um controlo apertado sobre ER cálcio é imprescindível para o dobramento de proteínas, modificação e tráfico. Perturbações para Er cálcio podem resultar na activação da resposta proteína desdobrada, um mecanismo de resposta de stress do ER de três pinos, e contribuir para a patogénese de uma variedade de doenças. A capacidade de controlar alterações ER cálcio durante o início e progressão da doença é importante, em princípio, no entanto, um desafio na prática. Métodos actualmente disponíveis para o monitoramento ER cálcio, tais como corantes e proteínas fluorescentes dependentes de cálcio, têm fornecido uma visão sobre a dinâmica ER cálcio nas células, porém essas ferramentas não são adequados para estudos in vivo. O nosso laboratório demonstrou que uma modificação para o terminal carboxi de Gaussia luciferase confere secreção do repórter em resposta aDepleção de cálcio ER. Os métodos para a utilização de uma base de luciferase, proteína secretada ER monitorização de cálcio (SERCaMP) in vitro e in vivo em aplicações são aqui descritos. Este vídeo destaca injeções hepáticas, manipulação farmacológica de Gluc-SERCaMP, coleta e processamento do sangue e os parâmetros de ensaio para acompanhamento longitudinal de ER cálcio.

O método Gluc-SERCaMP permite a avaliação da homeostase do cálcio ER por amostragem líquidos extracelulares. Vários controlos podem ser incluídos no desenho experimental para melhorar a interpretação dos resultados. Em primeiro lugar, a utilização de um repórter constitutivamente segregada (por exemplo, sem a glic ASARTDL C-terminal ou &quot;n-gluc Tag&quot;) podem ser empregues para avaliar os efeitos dos tratamentos experimentais sobre a via secretora (secreção celular global) e de expressão do transgene. Por...

A homeostase do cálcio do retículo endoplasmático é interrompida em diversas patologias. Um repórter de proteína de monitoramento de cálcio ER secretado (SERCaMP) pode ser usado para detectar interrupções no armazenamento de cálcio ER. Este protocolo descreve o uso de um SERCaMP de Gaussia luciferase para examinar a homeostase do cálcio do RE in vitro e in vivo.

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar ao longo do tempo a desregulação do cálcio no retículo endoplasmático utilizando uma proteína relatora secretada. Isso é alcançado por meio da transgênese mediada por vetor viral do tecido-alvo, especificamente o fígado. Neste exemplo, com o repórter Gai luciferase circa, fluidos biológicos, como o sangue, são coletados para medir a quantidade de circa liberada a partir do tecido; em seguida, o substrato da luciferase é adicionado às amostras de plasma e a luminescência é medida para determinar a depleção de cálcio no retículo endoplasmático.Os resultados mostram a desregulação do cálcio no retículo endoplasmático, indicada pelos níveis aumentados de C no plasma. A homeostase de cálcio no retículo endoplasmático pode ser monitorada por durações prolongadas mediante coleta repetida de pequenos volumes de fluidos biológicos. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como corantes de baixa afinidade para cálcio ou indicadores genéticos de cálcio, é que a homeostase de cálcio no retículo endoplasmático pode ser monitorada in vivo ao longo do tempo por meio de um procedimento minimamente invasivo. Existem duas vertentes terapêuticas para esta técnica.O primeiro é triar fármacos que possam manter ou restaurar a homeostase de cálcio no retículo endoplasmatico ao estado fisiológico normal. A segunda abordagem é modificar a proteína terapêutica para se tornar AMPs terapêuticos, nos quais a secreção ocorre em resposta à diminuição de cálcio no retículo endoplasmatico. Embora este método possa fornecer informações sobre a desregulação de cálcio no retículo endoplasmatico no fígado.Ele também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos, como cérebro, coração, músculo ou pâncreas. Após anestesiar uma rata Dolly Sprague-Dawley, de acordo com o protocolo descrito, aplique pomada oftálmica e realize uma compressão na cauda para verificar a anestesia, raspe a região do abdômen ligeiramente abaixo das costelas até a região abdominal média e limpe a área cirúrgica três vezes, alternando Betadine e etanol 70%. Em seguida, posicione a rata em posição supina sobre uma área cirúrgica estéril, cubra com campos cirúrgicos estéreis e dilua uma amostra de glucagon à concentração otimizada pelo usuário.Neste caso, utilizamos 7,6 vezes 10 à nona potência de genomas virais por mililitro e misturamos invertendo o tubo. Em seguida, pipete 105 microlitros do A a V diluído em uma placa estéril e use uma agulha de 30 para coletar o vírus em uma seringa. Marque o local da incisão para expor o fígado para injeção usando um bisturi.Realize uma incisão horizontal com cerca de dois a três centímetros de comprimento abaixo da caixa torácica. Realize dissecação romba para separar o tecido conjuntivo da hipoderme. Corte o músculo abdominal para expor o lobo medial direito do fígado.Em seguida, posicione o animal sob um microscópio cirúrgico e ajuste para obter o lobo medial direito do fígado no campo de visão. Em seguida, utilizando a seringa, injete um terço do volume total do vírus em três locais no parênquima do lobo medial direito, mantendo a agulha no tecido por cinco a 10 segundos após a injeção para garantir a administração completa do volume injetado, suturando então o músculo abdominal e o corte, e utilize um aplicador de algodão para aplicar Neosporin. Coloque a rata em uma câmara de recuperação até que a consciência seja recuperada e o animal seja capaz de manter uma posição ereta antes de devolvê-lo à sua gaiola individual.Quatro a sete dias após a injeção. Prepare os tubos para coleta de sangue etiquetando-os e pesando-os previamente. Em seguida, adicione 50 microlitros de 1000 unidades por mililitro de heparina a cada tubo.Após anestesiar a rata de acordo com o protocolo descrito, realize uma compressão na cauda para verificar a sedação e, com tesoura estéril, corte a ponta da cauda a cerca de um a dois milímetros da extremidade. Colete mais de 100 microlitros de sangue, gota a gota, em um tubo pré-preenchido com heparina para interromper o sangramento.Use um aplicador de algodão úmido para aplicar o pó STIC na cauda. Use um disco de etanol para limpar a tesoura e esterilizar a conta entre as coletas. Armazene os tubos de sangue a quatro graus Celsius.Se for coletar amostras subsequentes, pese os tubos de coleta e ajuste a heparina para obter uma proporção de dois para um de sangue em relação à heparina. Este passo normalizará a quantidade de heparina em cada amostra. Centrifugue os tubos a 2000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Transfira o sobrenadante plasmático para um tubo novo e armazene a quatro graus Celsius por até 72 horas ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo para o ensaio de luciferase para administrar thaa garin como controle positivo. Dilua em etanol até uma concentração final de 2,5 miligramas por mililitro. Em seguida, injete um miligrama por quilograma por via intraperitoneal no abdômen inferior.Colete a primeira amostra de sangue às 24 horas após a injeção, conforme descrito acima. Para medir a luminescência, prepare o substrato selen ezine de trabalho de acordo com o protocolo descrito no texto e incube-o à temperatura ambiente, protegido da luz, por 30 minutos.Enquanto isso, descongele todas as amostras em gelo e transfira 10 microlitros de plasma para uma placa com paredes opacas usando um leitor de placas capaz de monitorar bioluminescência e equipado com um injetor de substrato. Prepare as linhas com o substrato. Injete 100 microlitros de substrato em um poço.Agite em velocidade média por cinco segundos e meça a emissão de luz para amostras in vitro. Integre a emissão de luz ao longo de 0,5 segundos para o passo de leitura e, para amostras in vivo, integre ao longo de cinco segundos no passo de leitura para avaliar a homeostase de cálcio. Utilizando o Método Gluc SAR Camp, diversos controles podem ser incluídos, como um repórter secretado constitutivamente, como o Gluc Noag neste caso.Um aumento nos níveis extracelulares de GLUC SAR camp e Gluc noag em resposta a condições experimentais seria considerado um resultado ambíguo. No entanto, um aumento na secreção de gluc SAR camp sem resposta de gluc noag apoia um evento dependente de cálcio do retículo endoplasmatico. Moduladores farmacológicos da reserva de cálcio do retículo endoplasmatico podem ser utilizados para confirmar a contribuição do cálcio do retículo endoplasmatico para a liberação de SAR camp em novos paradigmas.Por exemplo, conforme demonstrado aqui, a dantroleno, um antagonista do receptor INE que estabiliza o cálcio do retículo endoplasmatico, inibe a liberação de AMPc SAR em resposta ao tioc argônio em estudos in vitro utilizando AMPc SAR baseado em gluc. A resposta induzida pelo tratamento deve ser melhor avaliada ao longo do curso temporal. Ao acompanhar as alterações na resposta relativa dentro de uma placa em comparação com os controles, não é aconselhável comparar números brutos entre várias placas, onde a degradação do substrato pode levar a alterações nos valores brutos. Para estudos in vivo, os dados devem ser avaliados independentemente para cada animal, com cada animal servindo como seu próprio controle pré-tratamento.Isso é necessário para levar em conta a variabilidade na entrega e expressão do transgene entre os animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a tecnologia sircam para investigar a regulação de cálcio no retículo endoplasmatico em modelos roedores de doenças hepáticas. Não se esqueça de que o trabalho com vetores virais pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

O retículo endoplasmático desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas e na homeostase do cálcio. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar o papel dos canais de Ca2 + de vazamento e para caracterizar o suposto mecanismos de regulação. Este sistema envolve siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca2 + imagem.

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissecção de sinais locais de Ca2+ em células cultivadas por indicadores de Ca2+ direcionados à membrana. J. Vis. Exp. (2019)O vídeo demonstra imagens de fluorescência para observar a dinâmica espontânea do cálcio específica do compartimento em astrócitos, monitorando sequencialmente proteínas sensíveis ao cálcio localizadas na membrana plasmática e no retículo endoplasmático.

Imagem espontânea de cálcio para dinâmica específica do compartimento em astrócitos

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade...

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido.

Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Captador<sup-benzóico.</sup

Este protocolo descreve um método simples para análise de sinais de cálcio em plantas geradas pela alimentação hemipteran insetos, como pulgões. Arabidopsis thaliana transformada com o biosensor de cálcio GFP GCaMP3 permitem a imagem em tempo real na vivo da dinâmica de cálcio com alta resolução temporal e espacial.

Gravação em tempo real na Vivo de Arabidopsis sinais de cálcio durante a alimentação de insetos usando um biossensor fluorescente

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca2 + imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca2 + sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca2 + indicadores.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Este protocolo descreve uma abordagem para a realização de imagens de cálcio em organoides intestinais humanos infectados por vírus e oferece uma abordagem para análise.

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Estabelecemos um ensaio de remontagem de luciferase dividida para monitorar os contatos retículo-mitocôndria endoplasmática em células vivas. Usando este ensaio, descrevemos um protocolo para medir quantitativamente o nível desses acoplamentos inter-organelas em HEK293T células, sob a condição de tratamento químico.

Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

Aprenda a monitorar a homeostase do cálcio no retículo endoplasmático usando o SERCaMP com luciferase Gaussia em tecido hepático. Este método permite acompanhar a desregulação de cálcio de forma minimamente invasiva ao longo do tempo.

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um

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