Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

O objetivo geral deste procedimento é dissecar experimentalmente, manipular e cultivar implantes retinianos inteiros de embriões de galinha. Isso é realizado primeiramente coletando ambos os olhos de um embrião de galinha e colocando-os em uma placa de Petri. O segundo passo consiste em remover o bulbo escleral e o epitélio pigmentar utilizando pinças finas.

Em seguida, o explante retiniano inteiro é submetido à eletroporação de DNA plasmidial com eletrodos planos circulares. O passo final é incubar o explante retiniano em meio de cultura. Em uma placa de 24 poços em um incubador.

No final, os implantes retinianos inteiros são fixados, seccionados por criomicrotomia e analisados por microscopia de imunofluorescência para visualizar os neurônios retinianos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como nas operações eletro OVO, é que ela é rápida, fácil de realizar e garante resultados reprodutíveis. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do desenvolvimento do sistema nervoso central, como a forma pela qual a neurogênese é afetada por reagentes químicos específicos, como inibidores enzimáticos ou produtos gênicos que visam o ciclo celular após a incubação.

Coloque os ovos na idade embrionária desejada dentro da cabine de fluxo laminar e limpe as cascas dos ovos com etanol 70% para evitar contaminação do embrião. Bata firmemente o lado do ovo contra uma superfície dura para quebrar a casca e, em seguida, transfira o conteúdo para uma placa de Petri de 100 milímetros. Utilize uma colher pequena para transferir o embrião para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius, a fim de evitar o ressecamento do tecido.

Em seguida, decapite o embrião e coloque a placa de Petri de 35 milímetros contendo o tecido embrionário sob um microscópio estereoscópico binocular. No interior da cabine de fluxo laminar, utilize pinças finas para fazer uma incisão pela boca, ventralmente ao olho. A partir do local da incisão, rasgue o tecido que envolve completamente o olho.

Em seguida, pince o nervo óptico e remova o olho intacto da órbita. Colete ambos os olhos, o esquerdo e o direito, do mesmo embrião para utilizá-los como olho controle ou olho tratado. Utilize uma pequena colher para transferir os olhos para um novo recipiente de Petri de 35 milímetros contendo PBS pré-aquecido usando pinças finas.

Remova todos os tecidos ao redor do olho, incluindo a esclera na laga. Em seguida, pressione com pinça uma pequena incisão no epitélio pigmentar na parte dorsal do olho, tomando cuidado para não danificar a retina neural. Então, abra suavemente o epitélio pigmentar a partir do local da incisão.

Deixe a lente e toda a retina aderidas ao corpo vítreo. Remova o epitélio pigmentado, tomando cuidado ao longo do corpo ciliar em torno da pupila na região anterior do olho e ao longo da fissura corioidal, pois é difícil removê-lo desses locais. Ligue o eletrodo e ajuste a voltagem para 15 volts para uma retina nos estágios 20 a 25 ou para 20 volts para uma retina nos estágios 26 a 27.

Em seguida, defina as repetições de pulso para cinco pulsos de 50 milissegundos de duração, com intervalos de um segundo. Utilize um gerador de pulsos que possa ser controlado por um pedal no chão, já que ambas as mãos serão necessárias para segurar os eletrodos no lugar. Conecte dois eletrodos de platina em formato de pá, fabricados especialmente, ao soquete de saída do gerador de pulsos.

Os eletrodos mostrados aqui foram feitos a partir de placas de platina de 0,1 milímetro e o fio de conexão de 0,8 milímetro era isolado. Usando tubos de plástico, transfira cuidadosamente todo o explante retiniano para um vete usando uma pipeta de polietileno pastorizada com a extremidade cortada. Evite usar ponteiras de pipeta, pois a retina tende a aderir ao plástico e se romper.

Em seguida, utilize uma pipeta de 100 microlitros para remover suavemente todo o PBS ao redor do explante retiniano. Tenha cuidado para não tocar na retina, a fim de evitar rasgá-la. Adicione 100 microlitros da solução de plasmídeo diluída ao QVE e certifique-se de que todo o explante retiniano esteja coberto pela solução.

Empurre suavemente para baixo o explante retiniano com pinças caso ele flutue para o topo. Use eletrodos de pinças para posicionar a lente de modo que fique voltada para qualquer um dos lados do vete e direcione o nervo óptico para o fundo do vete. Em seguida, posicione o eletrodo positivo na frente da lente e o eletrodo negativo atrás da retina, sem tocar o tecido.

Aplicar a corrente pressionando o pedal do pé e verificar a presença de bolhas nos eletrodos, o que indica uma descarga bem-sucedida. Utilize uma pipeta de 100 microlitros para remover toda a mistura de plasmídeo do qve sem danificar a retina. A mistura de plasmídeo pode ser reutilizada de três a cinco vezes após a remoção do plasmídeo.

Encha o recipiente com PBS pré-aquecido. Use pinça para destacar suavemente o explante retiniano da parede do recipiente. Em seguida, use o tubo de polietileno acoplado à sua pipeta para transferir todo o explante retiniano para uma placa de 24 poços contendo um mililitro de meio de cultura pré-aquecido.

Incube apenas um explante retiniano por poço no meio. Incube o explante retiniano a 37 graus Celsius e 5% de CO2 em um agitador rotativo com velocidade constante de 50 RPM. A rotação garante exposição máxima ao meio e evita a adesão da retina ao fundo da placa de 24 poços.

Após 24 horas de cultivo, células positivas para GFP foram visualizadas em grande parte da retina intacta, já que a eletroporação resultou na incorporação do plasmídeo e na expressão do gene repórter em uma ampla área retiniana. Após o corte em seções, células individuais positivas para GFP foram facilmente detectadas ao longo do eixo basal ACO da retina. O explante retiniano completo pode ser cultivado por aproximadamente mais 24 horas.

Os tempos de incubação podem levar a atraso no desenvolvimento, malformações morfológicas, apoptose e, eventualmente, desintegração da retina. Uma seção de uma retina inteira cultivada por 24 horas foi imunomarcada com fosfohistona três, exibida aqui no canal vermelho; a fosfohistona três marca células no final da fase G2 da mitose. As células positivas para pH3 foram encontradas no lado apical da retina, compatível com o desenvolvimento retiniano normal.

Como mostrado aqui, esse desenvolvimento pode ser bloqueado pela adição de um inibidor de CDK um dois. A incubação com o inibidor por quatro horas antes da aquisição de imagens reduziu significativamente o número de células positivas para pH três na retina após seu desenvolvimento. Esta técnica tem sido usada com sucesso para investigar a expressão gênica relatada a partir de novos plasmídeos de DNA e para tratar explantes retinianos com reagentes químicos, incluindo reguladores da via de dano ao DNA e do ciclo celular. Após este procedimento, outros métodos, como eletroporações inovo, podem ser realizados para confirmar ainda mais os resultados.