Name: Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a dissecar, manipular e cultivar explantes de retina inteira de embriões de galinha usando eletroporação de DNA plasmidial. Este método robusto permite estudar neurogênese e testar reagentes químicos em biologia do desenvolvimento.

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O trabalho foi apoiado por Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond e St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Este protocolo é realizada de acordo com as recomendações contidas no &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia&quot;. 1. Egg Manuseio e coleção dos olhos <ol><li> Armazenar ovos brancos Leghorn em 12-14 ° C durante não mais de uma semana. Se possível, use um refrigerador de vinho refrigerado para armazenar os ovos fertilizados. Nota: temperaturas mais elevadas armazenar levar ao desenvolvimento anormal dos embriões, enquanto temperaturas mais baixas aumenta a mortalidade. Tempo de armazenamento prolongado aumenta a mortalidade e desenvolvimento anormal. </li><li> Incubar os ovos em uma de 37,5 ° C e 60% incubadora de ovos umidificado com balanço delicado a uma frequência de 5 vezes por 24 horas. </li><li> Remover os ovos incubados na incubadora de ovos com a idade embrionária pretendida. Nota: A idade do embrião de galinha é determinada como o tempo de incubação e é denotado como dia embrionário (E) ou como fases (r), De acordo com a série de estágios de desenvolvimento descritas por Hamburger e Hamilton 12. </li><li> Coloque os ovos selecionados na capela de fluxo laminar. Limpar a casca de ovo com 70% de etanol para evitar a contaminação do embrião. Nota: Realizar todos os procedimentos sob condições assépticas com soluções estéreis <url> https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> e instrumentos. </li><li> Toque no lado do ovo firmemente contra uma superfície dura para rachar o ovo. Coloque o conteúdo em uma placa de Petri de 100 milímetros. Utilize uma pequena colher a transferência do embrião para um prato de 35 mm de Petri contendo pré-aquecido (37 ° C) 1x PBS para evitar que o tecido de secagem. </li><li> Coloque o prato de 35 milímetros Petri contendo o tecido embrionário em um microscópio binocular de dissecação estereovisão na capela de fluxo laminar. Decapitar o embrião por beliscar o pescoço com uma pinça fina e descartar o corpo. </li><li> Use uma pinça fina para fazer uma incisão tháspero boca, ventral para o olho. Começando no local da incisão, rasgar o tecido circundante o olho inteiro. Beliscar fora do nervo óptico e remover o olho intacto de cavidade ocular. Recolha tanto o olho esquerdo e direito do mesmo embrião para o uso como o controle ou o olho tratado. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir os olhos para uma nova placa de Petri 35 mm contendo pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x. </li></ol> 2. Preparação de explantes de retina inteiras <ol><li> Use uma pinça fina para remover todo o tecido em volta do olho incluindo a anlage escleral. Nota: O tecido irá separar facilmente deixando a retina no corpo vítreo e a lente com o epitélio pigmentar intacta (Figura 1A-B). </li><li> Utilize uma pinça fina para comprimir uma pequena incisão no epitélio pigmentado na parte dorsal do olho sem danificar a retina neural (Figura 1C). </li><li> Utilize uma pinça fina para rasgar suavemente abrir o epitélio pigmentar starting no local da incisão, deixando a lente e a retina inteira ligada ao corpo vítreo (Figura 1D). Manter o olho em água morna (37 ° C) 1x PBS para facilitar a remoção do epitélio de pigmento. Nota: O epitélio do pigmento podem ser difíceis de remover, em particular ao longo do corpo ciliar em torno da pupila, na região anterior do olho, e ao longo da fissura coróide. Portanto, alguns do epitélio de pigmento pode ser deixada sobre a retina neural (Figura 1E-F). </li></ol> 3. Tratamento de toda retinianas explantes <ol start="1"><li> A electroporação de explantes de retina inteiras Nota: A electroporação de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2. <ol><li> Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Cortar um 1,5 ml cuvette de plástico descartável (12,5 mm x 12,5 milímetros x 45 mm) (ou qualquer recipiente pequeno capaz de conter uma solução de 300-400 uL) de aproximadamente 8 mm a partir do fundo usando uma serra de lâminas finas. </li><li> Dilui-se o plasmídeo de ADN de escolha em 1xDPBS a uma concentração final de 0,1 ug / ul. </li><li> Ligue os parâmetros electroporador e definido para 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V para ST26 - st27 (E5) retina. Defina as Pulso-repetições para 5 pulsos de 50 ms de pulso de comprimento com intervalos de 1 segundo. Usar um gerador de impulsos que pode ser controlada por um pedal de pé sobre o chão, como será necessário duas mãos para segurar os eléctrodos no lugar. </li><li> Conecte dois pá em forma (flat, diam circular. 4 mm) eletrodos de platina (Figura 2A) à tomada de saída no gerador de impulsos. Nota: Os eletrodos de platina utilizados neste protocolo foram feitas pela oficina da universidade. Os eléctrodos foram feitos a partir de 0,1 mm placa de platina &quot;rondelles&quot; (grau de platina: Pt 950 / Cu 5). O conectando 0,8 milímetros wire foi isolada usando tubos de plástico. </li><li> Transferir cuidadosamente todo o explante de retina a partir do passo 2.3 para a tina (ou pequeno recipiente equivalente) usando uma pipeta de Pasteur de polietileno com a ponta cortada para adquirir o tamanho da ponta de abertura certo para o explante de retina. Evite o uso de pontas de pipeta como a retina tende a anexar ao plástico e rasgar. </li><li> Use uma pipeta de 100 mL para remover suavemente toda a 1x PBS em torno do explante retina tomando cuidado para não tocar na retina para evitar rasgar. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de plasmídeo para a cuvete para cobrir todo o explante da retina. Pressione cuidadosamente o explante de retina com uma pinça se ele flutua para cima. Use uma pinça ou eléctrodos para posicionar a lente para uma face lateral da cuvete e do nervo óptico qualquer para o fundo da tina. </li><li> Colocar o eléctrodo positivo em frente da lente e o eléctrodo negativo atrás da retina (Figura 2A), sem tocar no tecido. </li><li>Aplique o atual pressionando para baixo o pé-pedal. Verifique se há bolhas nos eletrodos indicando descarga bem sucedido. </li><li> Usar uma pipeta de 100 uL para remover toda a mistura de plasmídeo a partir da cuvete sem danificar a retina. A mistura de plasmídeo pode ser reutilizada de três a cinco vezes. </li><li> Encha-se a cuvete com pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x. Utilize uma pinça para separar suavemente o explante da retina a partir da parede da cuvete. Após a electroporação, por vezes, a retina está coberta com bolhas, o que torna aderir à parede da cuvete. </li><li> Utilizar a pipeta de Pasteur de polietileno para transferir toda a retina explante em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço. </li><li> Incubar o explante da retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO 2 durante 24 horas. A rotação é garantir o máximo de exposição ao meio e prevent adesão da retina para o fundo da placa de 24 poços. </li><li> Vá para a etapa 4. </li></ol></li><li> O tratamento de explantes de retina inteiras com reagentes químicos Nota: O tratamento químico de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2. <ol><li> Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina a partir do passo 2.3 em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço. </li><li> Incubar todo o explante de retina durante 60 minutos a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO2 antes da adição de um reagente químico ou veículo. </li><li> Preparar a solução química, por exemplo Cdk1 / 2 inibidor III, um inibidor da progressão da fase M 13, no final de umconcentração de 30 uM em DMSO. </li><li> Remova a placa de 24 poços, contendo todo o explante da retina, da incubadora celular. Adicionam-se 10 ul do reagente químico ou o veículo (DMSO) directamente ao meio da retina, o que resulta numa concentração final de 300 nM Cdk1 / 2 inibidor III em 0,01% de DMSO. Rodar manualmente a placa de 24 poços para permitir uma distribuição uniforme do reagente químico ou veículo na solução. </li><li> Incubar os explantes de retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, dentro de uma incubadora com 5% de CO 2 durante o tempo desejado (até 24 horas). </li><li> Vá para a etapa 4. </li></ol></li></ol> 4. Fixação e Congelamento de Whole Retinal Eexplants <ol><li> Remova a placa de 24 poços, que contém todo o explante da retina tratadas da incubadora celular. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio paraformaldeído a 4% em 1xPBS. Incubate em gelo durante 15 min. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 mL / poço 1xPBS geladas para lavar a retina. Incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio de sacarose a 30% em 1xPBS. Incubar em gelo durante 1-3 horas dependendo do dia embrionário da retina. Para ST20 - ST25 (E3) as retinas, incubar durante 1 hora, as retinas idosos necessitam de mais tempo de incubação em sacarose. </li><li> Use uma colher pequena para transferir todo o explante de retina para uma película de parafina contendo cerca de 500 ul congelamento cryostat meio de montagem. Remover o máximo possível de sacarose como movendo-se delicadamente o explante da retina no meio de congelamento, utilizando a pequena colher. </li><li> Transferir o explante da retina para um molde contendo a incorporação de meio de congelação. Posicione o olho para facilitar futuro seccionamento. Coloque o molde contendo a incorporação de todo o explante de retina no dry gelo até o meio é congelado. Armazenar a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commu%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li>
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<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res+Dev+brain+re%22%5BJournal%5D)">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li>
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<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+US%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+eye+re%22%5BJournal%5D)">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li>
<li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li>
<li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste trabalho, um protocolo detalhado para dissecção, eletroporação ou tratamento químico, e cultivo de explantes de retina inteiras de embriões de galinha é apresentado. Este protocolo é fácil, rápido e permite tanto uma elevada taxa de sucesso e reprodutível resultados. A electroporação de explantes de retina inteiros produz grandes áreas de células que expressam a construção de gene de interesse. É fácil de posicionar correctamente os eléctrodos e para expor uma porção...

A retina é parte do sistema nervoso central e é, com a sua relativa simplicidade e arquitetura celular bem caracterizada, um modelo popular para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso central. O olho de embrião de galinha é relativamente grande em comparação com o resto do embrião. É, portanto, facilmente acessível in ovo para manipulações experimentais, tais como injecções ou eletroporação, e serve como uma ferramenta excelente para adquirir conhecimento sobre células da retina e biologia do desenvolvimento in vivo. Apesar destas vantagens principais, a sobrevivência dos embriões pode ser baixo quando as experiências são invasivos, como com electroporations, injeções repetidas, ou manipulações experimentais combinados. A electroporação de plasmídeos de ADN para o embrião de galinha in ovo é uma técnica importante e bem estabelecido 1. Ela permite a marcação de neurónios, o rastreio de destino celular, bem como vias neuronais no centro nervous sistema e que permite a expressão ectópica de genes para analisar a função da proteína in vivo. A técnica tem sido utilizada para estudos de tubo neural 2, rombencéfalo 3, 4 e da retina. Eletroporação de retina embrionária in ovo tem algumas dificuldades experimentais que estão relacionados com a situação in vivo. A posição do olho, devido à dobragem cranial do embrião, é relativamente perto do coração. Esta proximidade aumenta o risco de paragem cardíaca após a electroporação, e o risco aumenta com a idade do embrião. Além disso, para aceder ao olho, que é necessário para abrir as membranas embrionárias, aumentando assim o risco de sangramento, malformações e subsequente viabilidade reduzida. Ao testar e otimizar um novo plasmídeo DNA, muitas vezes sem um resultado fenotípico conhecido, as limitações podem diminuir a eficácia e poder do método, mesmo para um experimentalista experiente. Conforme apresentado neste protocolo, a cultura do wfuro explante da retina, definida como toda a retina neural com o epitélio pigmentar removido, é um método eficiente em que complementa a abordagem in ovo. Injecções intra-ocular de reagentes químicos são relativamente fáceis de executar in ovo. No entanto, a concentração eficaz e exacta de reagentes injectados dentro da retina neural pode ser difícil de controlar totalmente. O volume injectado pode variar devido a fugas e o local exacto de injecção podem afetar tanto a distribuição do reagente no interior do olho e a difusão através do corpo vítreo. A variabilidade terá grandes implicações para a interpretação dos resultados, quando isto é, uma curva dose-resposta para um inibidor da enzima é determinada; particularmente se o efeito é pequeno e a janela temporal do efeito é estreita. Além disso, apenas um único olho pode ser usado de cada embrião quando realizando experiências in ovo devido a possíveis efeitos sistémicos através da corrente sanguíneapara o olho contralateral. Combinando a idade é importante quando se estuda o desenvolvimento ea variabilidade individual entre tratados e embriões de controle pode levar a variabilidade experimental adicional. Por estas razões, um ex ovo método baseado em explantes de retina de embriões de galinha foi desenvolvido, em que a retina neural pode ser exposto a uma uniforme e controlada condição experimental in vitro. O presente protocolo foi desenvolvido com base em protocolos anteriores 5-9. Explantes de retina de fase (ST) 20 (dias embrionárias [E] 3) para ST31 (E7) embriões de galinha foram dissecadas, e cultivadas a electroporação com um plasmídeo de ADN definida concentração ou expostos a um meio contendo uma concentração definida de um reagente químico. O protocolo apresentado aqui foi implementado com sucesso em publicações recentes, usando vários reagentes químicos diferentes, incluindo reguladores da via danos no DNA, tais como KU55933, SB 218078, 109555 e NSC ditosylate, e o ciclo celular, tais como Cdk1 / 2 inibidor III 10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l ponteiras de pipeta</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de plástico descartável de 1,5 ml</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Cdk1/2 III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM em 0,01% </td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td> DMSO <td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos</td><td></td><td></td> Platina, <td></td></tr><tr><td>eletro porator quadrado feito sob medida ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Meio de congelamento NEG50</td><td>Cellab, Suécia</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP expressando plasmídeo de DNA (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora umidificada</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Alemanha</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem ProLong Gold com DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Filme de parafina</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Molde de embutir Peel-A-Way&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHistone 3 (PH3)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Diluição 1/4,000</td></tr><tr><td>Eletrodos de platina (feitos sob medida a partir de "rondelles")</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Dia: 4mm, espessura de 0,1 mm</td></tr><tr><td>Eletrodos Platimun&nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Diâmetro: 4 mm</td></tr><tr><td>Pipeta de pasteur de polietileno</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Agitador rotativo</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Colher pequena</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>Ovos Leghorn brancos Fornecedor</td><td></td><td></td><td>local</td></tr><tr><td>Refrigerador de vinho</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes eletroporação e chemical

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

A retina é um bom modelo para o sistema nervoso central em desenvolvimento. O grande tamanho do olho e, mais importante a acessibilidade para manipulações experimentais em ovo / in vivo torna o frango retina embrionária um modelo experimental versátil e muito eficiente. Embora a retina da galinha é fácil de atingir in ovo por injecções intra-oculares ou electroporação, e a concentração eficaz exacta dos reagentes no interior da retina pode ser difícil de controlar totalmente. Isto pode ser devido a variações do local da injecção exacta, vazamento a partir do olho ou difusão desigual das substâncias. Além disso, a frequência de malformações e mortalidade após manipulações invasivos, tais como electroporação é bastante elevada. Este protocolo descreve uma técnica ex ovo para a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha e proporciona um método para a exposição controlada da retina para reagentes. O protocol descreve como dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura inteiros a partir de embriões de galinha. Os explantes podem ser cultivados durante cerca de 24 horas e ser submetidos a manipulações diferentes, tais como electroporação. As principais vantagens são que a experiência não é dependente a sobrevivência do embrião e que a concentração do reagente introduzido pode ser variado e controlado, a fim de determinar e optimizar a concentração eficaz. Além disso, a técnica é rápida, barata e juntamente com a sua elevada taxa de sucesso experimental, que garante reprodutível resultados. Deve-se ressaltar que ele serve como um excelente complemento para experimentos realizados in ovo.

Este protocolo descreve a preparação (Figura 1A-M) e a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha. Este protocolo foi usado com sucesso para a retina a partir de explantes de embriões inteiros de ST20 (E3) para ST31 (E7). Eletroporação de plasmídeos de DNA em explantes de retina inteiras permite a rotulagem e rastreamento de células progenitoras da retina ou a sobre-expressão de diferentes produtos de genes. Para as experiências de electroporação...

Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos.

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar experimentalmente, manipular e cultivar implantes retinianos inteiros de embriões de galinha. Isso é realizado primeiramente coletando ambos os olhos de um embrião de galinha e colocando-os em uma placa de Petri. O segundo passo consiste em remover o bulbo escleral e o epitélio pigmentar utilizando pinças finas.Em seguida, o explante retiniano inteiro é submetido à eletroporação de DNA plasmidial com eletrodos planos circulares. O passo final é incubar o explante retiniano em meio de cultura. Em uma placa de 24 poços em um incubador.No final, os implantes retinianos inteiros são fixados, seccionados por criomicrotomia e analisados por microscopia de imunofluorescência para visualizar os neurônios retinianos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como nas operações eletro OVO, é que ela é rápida, fácil de realizar e garante resultados reprodutíveis. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do desenvolvimento do sistema nervoso central, como a forma pela qual a neurogênese é afetada por reagentes químicos específicos, como inibidores enzimáticos ou produtos gênicos que visam o ciclo celu

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs)...

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de...

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina...

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens...

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An Ex-ovo Eletroporação Approach

Descrevemos os métodos para a rotulagem fluorescente de tangencialmente migração células por eletroporação e para a imagem latente de lapso de tempo do movimento de célula rotulada em uma cultura de montagem plana a fim de visualizar a migração celular comportamento no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento .

Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Descrevemos um método para obter culturas primárias de fotorreceptores de cone a partir da retina de embriões de frango e seu uso para triagem de alto conteúdo.

Culturas enriquecidas por cone da retina de embriões de frango para estudar rod a interações celulares cone

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Aprenda a dissecar, manipular e cultivar explantes de retina inteira de embriões de galinha usando eletroporação de DNA plasmidial. Este método robusto permite estudar neurogênese e testar reagentes químicos em biologia do desenvolvimento.

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

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