Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio

O infarto do miocárdio (IM) não é apenas seguido por comprometimento da função cardíaca, mas também por apoptose na amígdala, uma região do cérebro envolvida nas consequências comportamentais do IM. Este protocolo descreve como induzir IM, coletar tecido da amígdala e medir a atividade da caspase-3, um marcador de apoptose.

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade da caspase-3 na amígdala de rato após um infarto do miocárdio usando espectrofluorometria. Este método pode responder a questões-chave no campo da ciência neural comportamental, como as consequências de um infarto do miocárdio no desempenho cognitivo, saúde mental, processo de envelhecimento e sono. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, rápida e confiável.

Geralmente, os indivíduos novos nesse método teriam dificuldades porque requer destreza para cirurgia e amostragem de tecido. Demonstrando o procedimento estará Kim Gilbert, assistente de pesquisa em nosso laboratório. Após a indução da anestesia de acordo com os protocolos institucionais aprovados, confirmar a anestesia adequada através da ausência do reflexo de pinça da pata.

Intubar o rato com tubo endotraqueal e colocar o animal em decúbito ventral em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius. Conecte o tubo endotraqueal a uma máquina de anestesia que dispensa 2% de isofluorano. Em seguida, prepare o local da cirurgia com gluconato de clorexidina e álcool isopropílico.

E aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Coloque uma cortina estéril sobre o animal para criar um campo estéril ao redor do local da cirurgia. E coloque os instrumentos cirúrgicos estéreis necessários em outro campo estéril ao lado do animal.

Em seguida, faça uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi número 10 ou uma tesoura. Use uma tesoura ou uma pinça hemostática para descascar o tecido muscular. Em seguida, use uma tesoura ou uma pinça hemostática para abrir a parede torácica e posicionar o afastador torácico e abrir o pericárdio com a pinça hemostática.

Para induzir a oclusão coronária, primeiro faça um loop de uma sutura de seda de quatro zero de 360 milímetros de comprimento ao redor da artéria coronária descendente e através do tecido miocárdico contíguo. Insira ambas as extremidades da sutura de seda em um tubo de plástico de calibre 14 e 1,25 centímetro de comprimento. Puxe as duas extremidades da sutura de seda e empurre o tubo para baixo contra a artéria para ocluí-la.

Prenda a oclusão prendendo o tubo de plástico com uma pinça hemostática e mantenha a oclusão por 40 minutos. Após 40 minutos, libere a oclusão removendo a pinça hemostática e, em seguida, o tubo flexível e a sutura de seda. Feche o tórax com duas suturas zero e coloque um cateter flexível através da cavidade torácica e retire o ar do tórax com uma seringa de 10 mililitros para evitar pneumotórax.

Costure o músculo com sutura de seda de quatro zero e a pele com sutura de seda de três zeros. Antes de fechar a última sutura da pele, retire novamente o ar do tórax usando a seringa de 10 mililitros e o cateter. Termine de fechar a pele e pare o isofluorano.

Coloque o rato em uma gaiola limpa e monitore durante a recuperação da anestesia. Administre analgesia com doses repetidas a cada oito horas. Depois de decapitar humanamente o animal de acordo com os procedimentos aprovados, coloque a cabeça do rato em um prato colocado sobre gelo picado.

Use uma tesoura para abrir o crânio. Em seguida, use rongeurs para destacar as feixes ósseas sem mutilar o tecido subjacente, puxando para cima. Em seguida, coloque a lâmina plana de uma espátula entre a parte inferior do crânio e a superfície ventral posterior do cérebro e separe o cérebro do crânio empurrando suavemente a lâmina para frente, levantando o cérebro para fora do crânio.

Coloque o cérebro em sua superfície dorsal. Identifique o hipotálamo na frente do cerebelo e corte o cérebro coronalmente na frente da extremidade posterior do hipotálamo e também atrás da extremidade anterior. Identifique a amígdala bilateral como duas pequenas esferas abaixo dos lobos temporais, ao lado do hipotálamo.

Em seguida, vire o cérebro em sua extremidade frontal com a superfície dorsal longe do experimentador. Em seguida, separe os hemisférios e remova o córtex da amígdala contínua. Quando a amígdala for revelada, corte a amígdala com um bisturi.

Corte ao longo da sutura escura que atravessa a amígdala para separar as partes basolateral e medial central e, em seguida, coloque as duas partes em tubos marcados separados no gelo. Esta etapa deve ser feita o mais rápido possível para evitar a deterioração das enzimas. Depois de repetir o procedimento de dissecação com o outro hemisfério, mergulhe todos os quatro frascos em nitrogênio líquido por um minuto e depois armazene no freezer negativo de 80 graus Celsius.

Comece adicionando 150 microlitros de tampão de lise a cada cinco a 10 miligramas de amostra no gelo. Sonicar cada amostra no gelo na intensidade máxima por cinco segundos. Em seguida, incube no gelo por 30 minutos.

Durante a incubação, vórtice a amostra por cinco segundos a cada cinco minutos. Em seguida, execute três ciclos de congelamento e descongelamento colocando amostras alternadamente em nitrogênio líquido e em uma placa de aquecimento controlada termostaticamente ajustada em 37 decretos Celsius. Após o ciclo final de congelamento e descongelamento, centrifugue as amostras de tecido a 1300 Gs a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e transfira para um tubo novo no gelo. Depois de quantificar a proteína de acordo com as instruções do protocolo escrito, adicione 25 microgramas de proteína a um tubo de reação contendo 0,8 microlitro de 10 milimolares Ac-DEVD-AMC e tampão de reação para um volume final de 200 microlitros. Para amostras de reação negativa, combine 25 microgramas de proteína com um microlitro de 800 micromolares Ac-DEVD-CHO e 0,8 microlitros de 10 milimolares Ac-DEVD-AMC.

Incubar todas as amostras e controles no escuro por três horas a 37 graus Celsius. Decorrido o tempo de incubação, interromper a reação com 600 microlitros de glicina 0,4 molar e hidróxido de sódio 0,4 molar a pH 10 em cada amostra e controle. Adicione dois mililitros de água destilada a cada reação em uma cubeta de vidro.

Quantificar a fluorescência por espectrofluorometria. Leia controles e exemplos por 10 segundos com uma leitura a cada segundo. Por fim, quantifique a atividade específica em cada amostra de acordo com a fórmula agora mostrada na tela.

Este histograma mostra a atividade da caspase-3 na amígdala de ratos que sofreram infarto do miocárdio. Os dados são expressos como a porcentagem de atividade média em controles simulados definida como 100%Cada grupo consistiu em oito ratos. O asterisco indica uma diferença significativa entre os grupos com um valor de p inferior a 0,05.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete horas, excluindo o intervalo entre a cirurgia de infarto do miocárdio e a amostragem de tecido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir um infarto do miocárdio em um rato e medir a atividade da caspase-3 na amígdala do rato usando espectrofluorometria.