Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio
12 de janeiro de 2016
O infarto do miocárdio (IM) não é apenas seguido por comprometimento da função cardíaca, mas também por apoptose na amígdala, uma região do cérebro envolvida nas consequências comportamentais do IM. Este protocolo descreve como induzir IM, coletar tecido da amígdala e medir a atividade da caspase-3, um marcador de apoptose.
O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade da caspase-3 na amígdala de ratos após um infarto do miocárdio, utilizando espectrofluorometria. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da neurociência comportamental, como as consequências de um infarto do miocárdio sobre o desempenho cognitivo, a saúde mental, o processo de envelhecimento e o sono. A principal vantagem desta técnica é que ela é simples, rápida e confiável.
De modo geral, indivíduos novos neste método teriam dificuldade, pois o procedimento exige destreza cirúrgica e para coleta de amostras de tecido. O procedimento será demonstrado por Kim Gilbert, assistente de pesquisa em nosso laboratório. Após induzir anestesia de acordo com os protocolos institucionais aprovados, confirme a anestesia adequada pela ausência do reflexo de pinçamento da pata.
Intube o rato com cânula endotraqueal e posicione o animal em decúbito ventral sobre uma placa aquecida para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius. Conecte a cânula endotraqueal a um aparelho de anestesia que fornece isofluorano 2%. Em seguida, prepare o local cirúrgico com clorexidina gluconato e álcool isopropílico.
Aplicar pomada oftálmica em ambos os olhos para prevenir ressecamento. Colocar um campo estéril sobre o animal para criar uma área estéril ao redor do local cirúrgico. E colocar os instrumentos cirúrgicos estéreis necessários em outro campo estéril ao lado do animal.
Em seguida, faça uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi número 10 ou com tesoura. Use a tesoura ou uma pinça hemostática para remover o tecido muscular. Depois, use a tesoura ou uma pinça hemostática para abrir a parede torácica e posicionar o afastador torácico, e abra o pericárdio com a pinça hemostática.
Para induzir a oclusão coronariana, primeiro passe uma sutura de seda quatro zero com 360 milímetros de comprimento ao redor da artéria coronária descendente e através do tecido miocárdico adjacente. Insira ambas as extremidades da sutura de seda em um tubo plástico de calibre 14 e 1,25 centímetro de comprimento. Puxe ambas as extremidades da sutura de seda e empurre o tubo contra a artéria para ocluí-la.
Fixe a oclusão prendendo o tubo plástico com um grampo hemostático e mantenha a oclusão por 40 minutos. Após 40 minutos, libere a oclusão removendo o grampo hemostático e, em seguida, o tubo flexível e a sutura de seda. Feche a cavidade torácica com sutura zero e coloque um cateter flexível através da cavidade torácica, aspirando o ar do interior do tórax com uma seringa de 10 mililitros para prevenir pneumotórax.
Feche o músculo com sutura de seda zero quatro e a pele com sutura de seda zero três. Antes de fechar a última sutura da pele, retire novamente o ar da cavidade torácica utilizando a seringa de 10 mililitros e o cateter. Conclua o fechamento da pele e, em seguida, interrompa o isofluorano.
Coloque a rata em uma gaiola limpa e monitore durante a recuperação da anestesia. Administre analgesia com doses repetidas a cada oito horas. Após decapitar humanamente o animal de acordo com os procedimentos aprovados, coloque a cabeça da rata sobre um recipiente colocado em gelo picado.
Use uma tesoura para abrir o crânio. Em seguida, use um rongeur para remover as lâminas ósseas sem mutilar o tecido subjacente, puxando para cima. A seguir, posicione a lâmina plana de uma espátula entre a base do crânio e a superfície ventral posterior do cérebro e solte o cérebro do crânio empurrando suavemente a lâmina para frente, levantando o cérebro para fora do crânio.
Coloque o cérebro sobre sua superfície dorsal. Identifique o hipotálamo na frente do cerebelo e corte o cérebro coronalmente na frente da extremidade posterior do hipotálamo e também atrás da extremidade anterior. Identifique a amígdala bilateral como duas pequenas esferas sob os lobos temporais, logo ao lado do hipotálamo.
Em seguida, vire o cérebro com a extremidade frontal voltada para baixo, mantendo a superfície dorsal voltada para longe do pesquisador. Depois, separe os hemisférios e remova a córtex da amígdala contínua. Quando a amígdala for exposta, corte-a com uma lâmina de bisturi.
Corte ao longo da sutura escura que atravessa a amígdala para separar as partes basolateral e medial central e, em seguida, coloque as duas partes em tubos rotulados separados sobre gelo. Este passo deve ser feito o mais rápido possível para evitar a deterioração das enzimas. Após repetir o procedimento de dissecação com o outro hemisfério, imerja todos os quatro tubos em nitrogênio líquido por um minuto e depois armazene no congelador a menos 80 graus Celsius.
Adicione inicialmente 150 microlitros de tampão de lise a cada cinco a 10 miligramas de amostra mantida no gelo. Sonoque cada amostra no gelo, com intensidade máxima, durante cinco segundos. Em seguida, incube no gelo por 30 minutos.
Durante a incubação, agite a amostra em vórtex por cinco segundos a cada cinco minutos. Em seguida, realize três ciclos de congelamento-descongelamento colocando as amostras alternadamente em nitrogênio líquido e em uma placa aquecedora com controle térmico ajustada a 37 °C. Após o último ciclo de congelamento-descongelamento, centrifugue as amostras de tecido a 1300 Gs a 4 °C por 10 minutos.
Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e transfira para um tubo novo sobre gelo. Após quantificar a proteína de acordo com as instruções no protocolo escrito, adicione 25 microgramas de proteína a um tubo de reação contendo 0,8 microlitro de Ac-DEVD-AMC 10 milimolar e tampão de reação, para um volume final de 200 microlitros. Para amostras de reação negativa, combine 25 microgramas de proteína com um microlitro de Ac-DEVD-CHO 800 micromolar e 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC 10 milimolar.
Incube todas as amostras e controles no escuro por três horas a 37 graus Celsius. Após o tempo de incubação, interrompa a reação com 600 microlitros de glicina 0,4 molar e hidróxido de sódio 0,4 molar em pH 10 em cada amostra e controle. Adicione dois mililitros de água destilada a cada reação em uma cubeta de vidro.
Quantifique a fluorescência por espectrofluorometria. Leia os controles e amostras por 10 segundos com uma leitura a cada segundo. Por fim, quantifique a atividade específica em cada amostra de acordo com a fórmula agora exibida na tela.
Este histograma mostra a atividade da caspase-3 na amígdala de ratos que sofreram infarto do miocárdio. Os dados são expressos como porcentagem da atividade média nos controles simulados, definida como 100%. Cada grupo consistiu de oito ratos. O asterisco indica uma diferença significativa entre os grupos, com um valor de p inferior a 0,05.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete horas, excluindo o intervalo entre a cirurgia de infarto do miocárdio e a coleta de tecido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir um infarto do miocárdio em um rato e medir a atividade da caspase-3 na amígdala do rato utilizando espectrofluorometria.
Visão Geral
Este protocolo descreve o procedimento para medir a atividade da caspase-3 na amígdala de ratos após infarto do miocárdio (IM). O estudo investiga o impacto do IM na apoptose na amígdala, uma região cerebral associada a desfechos comportamentais.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Pesquisa cardiovascular
- Medição de apoptose
Antecedentes
- O infarto do miocárdio leva à disfunção cardíaca.
- A apoptose na amígdala pode influenciar respostas cognitivas e emocionais.
- A caspase-3 é um marcador chave da apoptose.
- Este estudo tem como objetivo elucidar a relação entre infarto do miocárdio e função cerebral.
Objetivo do Estudo
- Medir a atividade da caspase-3 na amígdala após IAM.
- Explorar as implicações comportamentais do IAM sobre o desempenho cognitivo e a saúde mental.
- Fornecer um método confiável para estudar as consequências neurais de eventos cardíacos.
Métodos Utilizados
- Indução de infarto do miocárdio em ratos.
- Coleta de tecido da amígdala para análise.
- Medição da atividade da caspase-3 utilizando espectrofluorometria.
- Protocolos detalhados de cirurgia e processamento de tecidos.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de IM e coleta de amostras da amígdala.
- Quantificação da atividade da caspase-3 indicando níveis de apoptose.
- Compreensão dos efeitos da IM na função cerebral.
- Estabelecimento de uma metodologia confiável para estudos futuros.
Conclusões
- IM tem efeitos significativos na apoptose na amígdala.
- Compreender esses efeitos pode orientar estratégias de tratamento para transtornos cognitivos e emocionais após IM.
- O protocolo serve como base para pesquisas futuras nesta área.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a medição quantitativa da atividade da caspase-3 na amígdala após infarto do miocárdio, estabelecendo uma ligação mecanicista entre lesão cardíaca e apoptose neural. A abordagem apoia a validação de alvos em pesquisas sobre comorbidades neuropsiquiátricas, fornecendo uma leitura reprodutível da sinalização apoptótica em uma região cerebral relevante para a doença. Esses dados podem auxiliar na redução de riscos de terapias direcionadas ao SNC destinadas a atenuar transtornos cognitivos e afetivos pós-infarto do miocárdio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a caspase-3 como mediadora mecanicista da perda neuronal pós-IM no sistema límbico.
- Valor Operacional: Oferece um ensaio padronizado e quantitativo para a ativação da apoptose em núcleos cerebrais discretos.
- Valor Estratégico: Apoia a triagem baseada em hipóteses de compostos que visam vias apoptóticas em indicações neuropsiquiátricas relacionadas ao estresse.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras fluorométricas proporcionais à atividade enzimática da caspase-3, permitindo a caracterização de resposta dose-dependente.
- Valor Operacional: Utiliza espectrofluorometria para detecção sensível e compatível com placas, passível de adaptação para média escala de produção.
- Valor Estratégico: Facilita a transferibilidade do ensaio entre tecidos (por exemplo, coração, rins) mediante substituição do substrato (DEVD-AMC) para perfis pan-caspase.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Correlaciona picos temporais da caspase-3 (3 dias após IAM) com déficits cognitivos/comportamentais tardios (2-3 semanas), apoiando a qualificação de biomarcadores preditivos.
- Valor Operacional: Permite delineamentos de amostragem longitudinal para avaliar os efeitos de intervenções terapêuticas na progressão da apoptose.
- Valor Estratégico: Fortalece a continuidade translacional ao vincular leituras moleculares da apoptose a desfechos funcionais em modelos de doença validados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a triagem de interação com alvos até a validação fenotípica em modelos neuropsiquiátricos relacionados ao estresse.
- Descoberta Biológica: Apoia a desmistificação mecanicista ao quantificar a atividade apoptótica direcionada ao tecido da amígdala após lesão isquêmica.
- Triagem: Permite a triagem de compostos frente à ativação da caspase-3 utilizando a clivagem de DEVD-AMC como leitura primária.
- Análises: Gera dados quantitativos de fluorescência (em relação aos controles simulados) para comparação entre grupos e análise estatística.
- Pesquisa Translacional: Conecta os sinais apoptóticos precoces a fenótipos comportamentais tardios, apoiando decisões de avanço ou interrupção baseadas em biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Adaptável a outros membros da família das caspases e a diferentes tecidos mediante troca de substrato, aumentando a utilidade da plataforma em diversos projetos de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de comorbidade entre IM e SNC ao fornecer uma leitura direta da apoptose.
- Valor Operacional: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis apesar da complexidade técnica no dissecção de tecidos e preparação de amostras.
- Valor Estratégico: Orienta a priorização de portfólios ao validar o engajamento do alvo em circuitos neurais fisiopatologicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco de compostos ativos no SNC ao vincular a modulação do alvo à recuperação funcional em modelos validados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia cardíaca de roedores, dissecção cerebral e manipulação de tecidos sob condições frias para preservar a atividade enzimática.
- Depende do acesso a espectrofluorímetros, armazenamento criogênico (-80°C) e incubadoras controladas para reações enzimáticas.
- Necessita protocolos padronizados de lise, quantificação proteica e normalização de reações entre laboratórios para comparação entre estudos.
- A adaptação a sistemas modelo alternativos (por exemplo, camundongos, primatas não humanos) exige validação dos tempos de dissecção da amígdala e da cinética do substrato.
- Limitado pelo caráter demorado da coleta de tecidos e pelo passo de incubação escura de 3 horas, o que restringe o rendimento diário sem automação.
