Purificação de embarcações do cérebro do rato
10 de novembro de 2015
Descrevemos um protocolo que permite a purificação do compartimento vascular do cérebro do camundongo. Os vasos cerebrais isolados incluem células endoteliais ligadas por junções apertadas e cercadas por uma lâmina basal contínua, pericitos, células musculares lisas vasculares, bem como membranas astrogliais perivasculares.
O objetivo geral do procedimento é purificar o compartimento vascular do cérebro de camundongo mantendo sua integridade estrutural, utilizando uma série de centrifugações e filtrações de baixa velocidade, sem necessidade de anticorpos específicos ou linhagens transgênicas. Muitos esforços foram feitos para desenvolver técnicas que permitam investigações celulares, moleculares e farmacológicas da barreira hematoencefálica. A ausência de separação, gradientes, colunas ou etapas de centrifugação de alta velocidade torna a purificação dos vasos cerebrais por este procedimento muito simples, rápida e econômica.
Os vasos cerebrais permanecerão estruturalmente intactos, com as células endoteliais seladas por junções especiais e rodeadas pelos parasitas basais em camada, células musculares lisas vasculares e membranas astrócitas perivasculares. Este protocolo pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a função do compartimento vascular do EC e permitir o estudo de sua composição molecular, demonstrando que o procedimento será realizado por um pós-doutorando da equipe de Martin Coen S. Antes de iniciar o procedimento, corte a parte inferior da seção superior rosqueável do suporte de filtro.
Em seguida, use um bisturi para incisar a pele do pescoço do camundongo até o nariz e puxe a pele para trás. Lave o crânio com PBS para remover pelos contaminantes e, em seguida, insira uma tesoura no crânio anteriormente aos bulbos olfativos. Abra a tesoura para romper o crânio em partes e remova o cérebro com a espátula.
Em seguida, dissecar o plexo coroide dos ventrículos laterais e transferir o cérebro para um béquer de 150 mililitros contendo 20 mililitros da solução B um em gelo. Depois, usar dois escalpelos para cortar vigorosamente o cérebro em fragmentos de tecido de dois milímetros e utilizar um homogeneizador automático para homogeneizar o tecido por 20 golpes a 400 RPM em gelo. Para purificar os vasos, transferir a homogeneizada para um tubo plástico de 50 mililitros e centrifugar a suspensão de tecido.
Em uma centrífuga com rotor oscilante, uma grande interface branca, composta principalmente de mielina, se formará na parte superior do pellet do vaso. Descarte o sobrenadante em 20 mililitros de solução B dois gelada e agite o tubo vigorosamente por um minuto. Após uma segunda centrifugação, a mielina formará uma camada densa e branca na superfície do sobrenadante.
Gire lentamente o tubo para permitir que a solução B dois escorra pela parede ao ser derramada e descarte a mielina com o sobrenadante. Em seguida, use uma pipeta de plástico envolta em papel absorvente para remover qualquer fluido residual das paredes do tubo. Tendo o cuidado de não tocar o pellet do vaso, vire o tubo de cabeça para baixo sobre gelo.
Em seguida, reconstitua o precipitado em um mililitro de solução B três gelada, seguido pela adição de mais cinco mililitros de solução B três, tomando o cuidado para que os vasos não formem agregados. Coloque agora um filtro de malha de náilon de 20 mícrons sobre um frasco de Becker e equilibre o filtro com 10 mililitros de solução B três gelada. Despeje a preparação dos vasos sobre o filtro e lave cuidadosamente os vasos com mais 40 mililitros de solução B três gelada.
Em seguida, utilize pinças limpas para transferir imediatamente o filtro para um béquer contendo 30 mililitros de solução B três fresca e agite suavemente os frascos com o filtro. Despeje o conteúdo do béquer em um tubo plástico de 50 mililitros. Depois de uma centrifugação, re-suspenda o precipitado em um mililitro de solução B três gelada antes da imunomarcação.
Transfira os vasos para tubos PCR de 0,2 mililitro e coloque os tubos sobre gelo até que o sedimento tecidual se deposite no fundo dos tubos. Em seguida, use ponteiras para carregamento de géis para aspirar a maior parte do líquido. A seguir, insira uma capilar de vidro silanizada de 40 micrômetros em uma ponteira de pipeta P200 e use a capilar para transferir os vasos para uma lâmina de vidro; quando os vasos tiverem sedimentado, remova cuidadosamente o líquido com um pedaço de papel absorvente.
Em seguida, coloque uma única gota de meio de montagem sobre os vasos e aplique uma lamínula em um ângulo de 45 graus, permitindo que o meio de montagem se espalhe ao longo da borda do vidro até que a lamínula esteja posicionada. Nesta imagem, pode-se observar a marcação contínua de RIN ao redor das células endoteliais neurais, confirmando a retenção da lâmina basal nos vasos purificados. Componentes das junções apertadas endoteliais, como ZO um, também são detectados nos vasos purificados.
Além disso, a marcação para NG2 e actina de músculo liso indicam, respectivamente, a retenção de parasitas intactos e de células musculares lisas vasculares. As proteínas da membrana astra glial perivascular conexina 43 e aquaporina 4 também são detectadas na superfície dos vasos purificados, demonstrando a retenção adicional das membranas de astrócitos perivasculares durante o processo de purificação. No entanto, apenas fibras positivas para GFAP dispersas e curtas são observadas nos vasos isolados, revelando que os corpos celulares dos astrócitos não são co-purificados. Apenas algumas fibras neuronais permanecem ligadas aos vasos.
Da mesma forma, células positivas para IBA um e oli dois também não são detectadas, confirmando que micróglias e oligodendrócitos não são co-purificados. Recomendamos enfaticamente remover o plexo coroide atual antes da homogeneização do cérebro, pois verificamos que ele pode ser uma fonte de contaminação, trabalhar em uma área limpa e evitar contaminação por cabelos e poeira, já que os anticorpos apresentam alta afinidade inespecífica por esses materiais.
É igualmente importante realizar sempre uma coloração nuclear. É possível remover as células sanguíneas dos vasos purificados realizando uma perfusão intracardíaca com PBS antes da extração dos vasos. Extraímos com sucesso ácidos e proteínas de vasos purificados por este procedimento, tanto de paletas de vasos recém-preparadas quanto congeladas.
Também utilizamos sondas fluorescentes e microscopia confocal para estudar a função de transporte endotelial ex vivo dos vasos. Desejamos boa sorte em seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para purificar o compartimento vascular do cérebro de camundongo preservando sua integridade estrutural. O procedimento utiliza centrifugações de baixa velocidade e filtrações, eliminando a necessidade de anticorpos específicos ou linhagens transgênicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Pesquisa sobre Barreira Hematoencefálica
Contexto
- Técnicas de purificação de vasos cerebrais são essenciais para o estudo da barreira hematoencefálica.
- Manter a integridade estrutural durante a purificação é crucial para investigações precisas.
- Métodos anteriores frequentemente envolviam procedimentos complexos que poderiam comprometer a integridade dos vasos.
- Este protocolo tem como objetivo simplificar o processo de purificação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método simples para o isolamento de vasos cerebrais.
- Facilitar o estudo da composição molecular do compartimento vascular.
- Permitir investigações sobre a função do compartimento vascular.
Métodos Utilizados
- Centrifugação de baixa velocidade
- Técnicas de filtração
- Sem uso de anticorpos específicos
- Sem necessidade de linhagens transgênicas
Resultados Principais
- Os vasos cerebrais permanecem estruturalmente intactos após a purificação.
- As células endoteliais são seladas por junções apertadas.
- Os vasos são cercados por uma lâmina basal contínua e por pericitos.
- Processo de purificação rápido e economicamente eficaz demonstrado.
Conclusões
- Este protocolo é uma ferramenta valiosa para o estudo do compartimento vascular do cérebro de camundongo.
- Permite investigações celulares, moleculares e farmacológicas.
- O método pode aprimorar a compreensão da função da barreira hematoencefálica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A purificação da vasculatura cerebral intacta permite a desmistificação mecanicista de alvos da barreira hematoencefálica (BHE) em programas de doenças neurodegenerativas e neuroinflamatórias. A manutenção da integridade estrutural das junções apertadas endoteliais, pericitos e pés terminais de astrócitos sustenta a confiança preditiva na validação de alvos e na transposição de ensaios. Esta abordagem reduz a ambiguidade biológica na fase inicial de descoberta, preservando a composição da unidade neurovascular para triagem funcional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas preservando a arquitetura da unidade neurovascular para estudos de engajamento de alvos.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da manutenção da polaridade celular e da sinalização intercelular.
- Valor Estratégico: Apoia a confiança preditiva e a triagem de portfólios ao reduzir os riscos associados aos mecanismos de penetração na barreira hematoencefálica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados com lâmina basal intacta e junções apertadas para triagem de compostos posteriores.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da preservação estrutural dos compartimentos vasculares.
- Valor Estratégico: Destaca a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma para avaliação da permeabilidade da BHE e modulação de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância da doença por meio da retenção de membranas de astrócitos perivasculares e cobertura de músculo liso em vasos purificados.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica mediante a manutenção da integridade da unidade neurovascular.
- Valor Estratégico: Aborda decisões de avanço ajustadas ao risco ao permitir a eliminação mecanicista de riscos em alvos vasculares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona o método dentro do continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, apoiando a verificação de hipóteses e a clarificação de vias na pesquisa neurovascular.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses, a clarificação de vias e a desoneração biológica da unidade neurovascular.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, reprodutibilidade e saídas quantitativas por meio de imunomarcação de marcadores de junções apertadas e lâmina basal.
- Análises: Destaca medições, resultados ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições por meio de marcação fluorescente de marcadores endoteliais, de pericitos e de astrócitos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ou o alinhamento de biomarcadores por meio da retenção de proteínas da membrana glial de astrócitos perivasculares e da aquaporina quatro.
- Reutilização Corporativa: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, para desoneração de alvos vasculares em diferentes estágios de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em estudos de penetração da BHE.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de centrifugação de baixa velocidade e filtração, sem uso de anticorpos ou linhagens transgênicas.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço/interrompimento mais precisas, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas neurovasculares.
- Impacto no Portfólio: Priorização e tomada de decisões de avanço ajustadas ao risco, com base na integridade preservada do compartimento vascular.
Considerações de Implementação
- Expertise científica necessária em dissecação neurovascular e técnicas de centrifugação de baixa velocidade.
- Os requisitos de instrumentação e infraestrutura analítica incluem centrífuga com rotor oscilante, filtros de malha de náilon e sistemas de transferência por capilaridade.
- Requisitos de padronização entre equipes para a purificação de vasos sanguíneos nas equipes de descoberta e pré-clínicas.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, observando que o protocolo é otimizado para a vasculatura cerebral de camundongo.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: co-purificação incompleta dos corpos celulares de astrócitos e possível contaminação pelo plexo coroide se não for removido previamente à homogeneização.
