Name: Purificação de embarcações do cérebro do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a purificar vasos cerebrais de camundongo preservando a integridade estrutural usando centrifugação de baixa velocidade e filtração. Este método simplificado permite investigações celulares e moleculares da barreira hematoencefálica sem anticorpos específicos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Labex MemoLife e pelo ARSEP (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en placas)

1. Soluções e Materiais <ol><li> Preparar soluções de vasos isolamento: B1, adicionar 1,5 mL de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, adicionar 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, adicionar 1 g de BSA para 100 ml de B1. </li><li> Modificar o suporte do filtro cortando o fundo fora da parte superior de enroscar. </li><li> Preparar soluções de positividade: solução de fixação, paraformaldeído a 4% em PBS pH 7,4; Permeabilização / solução de bloqueio, soro de cabra diluído a 5% e Triton X100 a 0,25% em PBS pH 7,4. Nota: Fixação depende do tipo de anticorpos primários usados. </li></ol> 2. Dissecção Nota: As condições estéreis não são requeridos, a menos que os navios são usados ​​para fins de cultura de células. <ol><li> Prepara-se uma proveta de 150 ml com 20 ml de B1. Manter em gelo e cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar. </li><li> Profundamente anestesiar o mouse sob um capuz com uma pequena toalha de papel embebido em 1 ml de isoflurano pura que é adicionado into da gaiola. A anestesia é verificada pela ausência de reacção com uma pitada do dedo do pé. Matar o rato por deslocamento cervical. NOTA: Estes passos são realizados em conformidade com os regulamentos nacionais e institucionais. </li><li> Opcional: realização de perfusão intracardíaca com 20 ml de PBS 1x para eliminar o teor de sangue 24. </li><li> Seção da pele com um bisturi do pescoço até o nariz e puxe-o para longe. Remove todos os cabelos contaminantes com PBS 1x. </li><li> Para abrir o crânio, insira primeiro tesoura anteriormente ao bulbo olfatório, e abrir a tesoura para romper o crânio em duas partes. </li><li> Retire cuidadosamente o cérebro usando uma espátula cérebro. Dissecar o plexo coróide dos ventrículos laterais, pois iria contaminar a preparação do vaso sanguíneo 38. NOTA: Opcional: A preparação final conterá parênquima e vasos meninges. Se não for desejado, meninges pode ser removida seguindo o procedimento descrito por 38. </li><li> Transfer o cérebro em o copo contendo solução B1 no gelo. Até 8 cérebros pode ser tratado em conjunto. </li></ol> 3. A homogeneização do tecido cerebral <ol><li> Usando dois bisturis, manualmente e vigorosamente bateu o cérebro na solução B1, posteriormente, obter pequenos pedaços de cerca de 2 mm. </li><li> Homogeneizar a preparação com um homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 passagens a 400 rpm. Assegure-se que o tubo de vidro é mantido em gelo e que a parte superior do douncer está em solução quando se deslocam para baixo e para cima, de modo a evitar a formação de bolsas de ar. Se várias amostras são preparadas, lavar a douncer com água ionizada entre cada homogeneização. </li></ol> 4. Purificação Vessel <ol><li> Transferir o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 ml e proceder à centrifugação a 2000 g durante 10 min a 4 ° C. Um grande interface de branco (na maior parte da mielina) irá formar na parte superior do vaso de pelete (vermelho, se não de perfusão foi realizada). </li><li> Desprezar o sobrenadante. O sedimento navio e da interface branca irá permanecer solidários juntos. Adicionar 20 ml de solução B2 gelada e agitar o tubo manualmente e vigorosamente durante 1 min. </li><li> Proceda à segunda centrifugação a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. A mielina irá agora formar uma camada branca densa na superfície do sobrenadante. </li><li> Retirar cuidadosamente a camada de mielina de as paredes do tubo, segurando o tubo e rodando-a lentamente para permitir que o sobrenadante a passar ao longo das paredes. Descartar o sobrenadante com mielina. O sedimento contendo os vasos permanece presa na parte inferior do tubo. </li><li> Seque a parede interior do tubo com um papel absorvente enrolada em torno de uma pipeta de plástico de 5 ml e remover todos os fluidos residuais, evitar tocar o sedimento navio. Manter o tubo de cabeça para baixo sobre um papel absorvente para drenar o líquido remanescente. </li><li> Suspender o sedimento em 1 ml de solução B3 gelada por pipetagem cima e para baixo com dicas de baixa ligação, keeping o tubo em gelo, em seguida, adicionar mais 5 ml de solução B3. Certifique-se de que os navios são dispersas, tanto quanto possível e não formam agregados. </li></ol> 5. Filtration <ol><li> Prepara-se uma proveta em gelo com 30 ml de solução B3 gelada. Cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar. </li><li> Colocar um filtro de malha 20 uM sobre um suporte de filtro modificado na parte superior de um frasco de Becker e equilibrar através da aplicação de 10 ml de solução B3 gelada. </li><li> Verter a preparação navio no filtro e lavar os vasos com 40 ml de solução B3 gelada. </li><li> Recuperar o filtro usando uma pinça limpa e mergulhe-o imediatamente no copo contendo a solução B3. Retire os navios do filtro sacudindo-o suavemente. </li><li> Verter o conteúdo do copo num tubo de plástico de 50 ml e centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Nota: Como alternativa, a suspensão dos vasos cerebrais &#39;a partir do passo 4.6 pode ser filtrado sobre um filtro de malha 100 micrometros de.Neste caso, navios maiores são preferencialmente retidos no filtro enquanto o fluxo através contém principalmente microvasos (capilares), que são, em seguida, filtrada através de um filtro de 20 fim mesh como acima. </li><li> Ressuspender o sedimento de microvasos em 1 ml de solução B3 gelada e transferi-lo, pipetando-o para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 6. Fixação, permeabilização e bloqueio <ol><li> Vasos de transferência por pipetagem em tubos de PCR de 0,2 ml contendo PBS usando um 1,0 ml baixa ponta de ligação. Tenha cuidado para não tocar os vasos, pois podem aderir à parte exterior da ponta. Executar todas as etapas a seguir em um microscópio binocular. </li><li> Para cada um dos seguintes mudanças de meio, deixar os tubos em gelo até os vasos ter atingido o fundo, e pipetar a maior parte dos líquidos usando longos e coisa gel de carregamento de pontas de pipeta. </li><li> Remover a maior parte do PBS e adicionar 200 ul de solução fixadora.Suspender os vasos agitando suavemente e incuba-se durante 20 min à TA. </li><li> Pipeta a solução fixadora e substituí-la por 200 mL de 1x PBS (primeira lavagem), incubar durante 5 min a RT e repita esta etapa 3 vezes. Cada vez, verificar que os navios tenham correctamente depositada no fundo dos tubos e pipeta fora 1x PBS, garantindo os vasos não são tocados. </li><li> Após a última lavagem, substitua por PBS 1x / solução de permeabilização de bloqueio e incubar 1 hora à TA, ressuspensão dos vasos, agitando suavemente ao longo do tempo. </li></ol> 7. Immunostaining <ol><li> Substitua o / bloqueio solução de permeabilização com a mistura de anticorpos primários (ver referências dos anticorpos usados ​​aqui e diluições na tabela modelo de Materiais) diluído na / solução de bloqueio permeabilização, e incubar a 4 ° CO / N. </li><li> Após 3 lavagens em PBS, à TA, incubar os vasos com a mistura de anticorpos secundários diluído em PBS durante 2 hà TA. </li><li> Nota: recomendamos a realização de coloração nuclear com Hoechst (1: 2.000) ou DAPI (1: 2.000), a fim de distinguir os navios de possíveis contaminantes cabelos ou poeiras sob o microscópio. </li><li> Após 3 lavagens em PBS, ressuspender os vasos em 50 ul de PBS. </li></ol> 8. Montagem e Observação <ol><li> Prepare uma ponta com um capilar de vidro siliconizada: cortar uma ponta de pipeta P200 utilizando um bisturi e ajustar o capilar no interior. O volume aproximado do tubo capilar é de 40 ul. </li><li> Transferir os recipientes para uma lâmina de vidro usando o capilar de vidro siliconizada e cuidadosamente remover o líquido com um pedaço de papel absorvente. </li><li> Aplicar uma única gota de meio de montagem para os navios e mantenha uma lamela a 45º permitindo que a gota espalhar-se ao longo da borda do deslizamento. Vamos sair da lamela e permitir meio para espalhar lentamente. Deixá-lo seco O / N à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Os navios podem ser observados sob uma fluoresmicroscópio confocal ent. </li></ol>

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<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A barreira sangue-cérebro regula a passagem de substâncias fisiológicas dentro e fora do sistema nervoso central e o protege contra substâncias potencialmente nocivas presentes no sangue. Ele está envolvido em várias patologias do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas 2 e tumores cerebrais 28. A baixíssima permeabilidade da certificação também dificulta a passagem de agentes terapêuticos que visam células neurais e ao desenvolvimento de métodos que pretendem abrir reversível a certificação sem ...

O funcionamento adequado do sistema nervoso central (SNC) requer um ambiente extracelular altamente regulada, e as demandas metabólicas são enormes em comparação com outros órgãos 1. O SNC também é extremamente sensível a uma vasta gama de produtos químicos, geralmente inofensivo para órgãos periféricos, mas a ela, neurotóxica. Para assegurar um funcionamento correcto, a maior parte do &quot;vasculatura SNC forma uma barreira endotelial; a barreira sangue-cérebro (BBB), que controla o fluxo de moléculas e iões, bem como a passagem de células do sistema imunológico entre o sangue e o cérebro, mantendo assim a homeostase devida 2, mas também limitar a entrada de drogas terapêuticas, os tratamentos que impedem assim de distúrbios neurológicos 3. Ao nível celular, a certificação é sustentada principalmente por extensos junções apertadas entre as células endoteliais, expressão polarizada de transportadores de efluxo e uma taxa muito baixa transcitose 4. Propriedades e as funções da certificação são principalmente induzida por NEcélulas ighboring 4. Em particular, pericitos desempenhar um papel importante na indução e manutenção da certificação 5,6. Sendo células contrácteis, pericitos também regular o fluxo sanguíneo como fazem os 7 células de músculo liso circundantes grandes vasos. Finalmente, astrócitos, as principais células gliais do cérebro, enviar grandes processos chamados endfeet em torno da maioria da vasculatura cerebral 8 e modula a certificação integridade e quiescência imune 9, a transferência de metabolitos para neurónios de 10, e induzir o acoplamento apertado entre a actividade neuronal e o fluxo de sangue 11,12. A capacidade para estudar as propriedades moleculares e celulares do sistema vascular cerebral é crucial para caracterizar melhor a sua contribuição para a fisiologia do cérebro e fisiopatologia. Para fazer face a esta questão, as estratégias para isolar sistema vascular cerebral do cérebro têm sido desenvolvidos, que permitem a preparação de fragmentos de vasos cerebrais intactas. Cerebral navio purification foi inicialmente descrita usando cérebros de bovinos 13 e melhorado e adaptado para outras espécies, em particular roedores 14. Neste último estudo, a utilização de filtros de tamanho variável foi introduzido para separar vasos cerebrais em fracções enriquecidas em recipientes de diferentes diâmetros. Curiosamente, em tais preparações, as células endoteliais mantiveram suas propriedades metabólicas 15, funcionalidade transportador 16 e 17 de polarização. Aqui, descrevemos detalhadamente este protocolo e ainda demonstrar que os navios isolados reter a maior parte de seu em estruturas in situ. As células endoteliais permanecem ligados por junções apertadas e rodeado por uma lâmina basal contínua. Pericitos e células musculares lisas permanecem ligadas à camada endotelial, bem como as membranas de astrócitos perivasculares. No entanto, astrócitos, células microgliais, neurónios e os oligodendrócitos são eliminados. Finalmente, descreve-se um procedimento para executar imunocoloração em vasos cerebrais isoladas. </p&gt; Até agora a maioria dos estudos moleculares e celulares relacionadas com o sistema cerebrovascular foram realizados em células dos vasos cerebrais purificados dissociadas utilizando estirpes repórter do mouse específicos de células ou procedimentos baseados imunocoloração 18,19 classificando-célula. Embora estas técnicas permite o isolamento de populações de células vasculares cerebrais quase puros, células isoladas perder completamente a sua morfologia in situ e interacções, que por sua vez, afecta grandemente as suas propriedades moleculares e celulares. O protocolo aqui descrito, permitindo o isolamento de fragmentos cerebrovasculares inteiras sem a necessidade de anticorpos específicos ou manchas de ratinhos transgénicos, oferece uma boa alternativa, a estrutura global dos vasos cerebrais isoladas é conservada, assim, diminuir repercussões sobre as suas propriedades moleculares. Isolado navios poderiam, então, ser usado para estudar a atividade do gene, a síntese de proteínas e regulação no BBB, como recentemente descrita 20,21 </sup&gt;. Finalmente, em relação ao laser captura microdissection 22,23 o presente protocolo é barato, fácil de executar e rapidamente adaptável em qualquer laboratório.

<table><tbody><tr><td>Moedor de Tecidos Tamanho C</td><td>Centrífuga Thomas scientific</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>5415&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio modular de alto desempenho</td> O sistema compacto <td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>fornece Leica LED1000 de alta qualidade</td><td>Leica</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>pontas de baixa ligação (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm porta-filtro PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Disco de filtro de rede de nylon Hidrofílico 20 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Disco de filtro de rede de nylon Hidrofílico 100 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Borosilicato de Parede Padrão</td><td>Instrumento Sutter</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas, Espessura 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de parede fina de 0,2 ml e tampa abobadada</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PARAFILM M (tamanho do rolo 4 pol. &vezes; 125 pés)</td> <td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol</td><td>Tecnologia de vida</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Tecnologia de vida</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp. Sr. ~70.000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldeído (p/v), sem metanol&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimida H 33342 tricloridrato (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4 De Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugado; Diluição 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (coelho); diluição 1/400</td><td>gentilmente cedida pelo Dr. Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td> <td>Life technology</td><td>33-9100</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td> <td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp; diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp; diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (coelho)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp; diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (camundongo, Clone&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp; diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti Olig2 (coelho)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp; diluição 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (camundongo)</td> <td>fornecido pelo Dr. Beat M. Riederer, Universidade de Lausanne, Suíça.</td><td>&nbsp; diluição 1:10</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1 (coelho)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>&nbsp; diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technology</td><td>A11029</td><td>&nbsp; diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Tecnologia de vida</td><td>A11034</td><td>&nbsp; diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technology</td><td>A21424</td><td>&nbsp; diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 555</td><td>Tecnologia de vida</td><td>A21429</td><td>&nbsp; diluição 1:2.000</td></tr></tbody></table>

purificação de embarcações do cérebro do rato

Purification of Mouse Brain Vessels

No cérebro, a maior parte do sistema vascular consiste de uma barreira selectiva, a barreira sangue-cérebro (BBB) ​​que regula a permuta de moléculas e células do sistema imunológico entre o cérebro e o sangue. Além disso, a enorme demanda metabólica neuronal requer um regulamento momento-a-momento de fluxo sanguíneo. Notavelmente, anormalidades destes regulamentos são características etiológicos da maioria das patologias cerebrais; incluindo o glioblastoma, acidente vascular cerebral, edema, epilepsia, doenças degenerativas (ex: doença de Parkinson, doença de Alzheimer), tumores cerebrais, bem como das condições inflamatórias tais como esclerose múltipla, meningite e disfunções cerebrais induzidas por sepsia. Assim, a compreensão dos eventos de sinalização que modulam a fisiologia vascular cerebral é um grande desafio. Muito conhecimento sobre as propriedades moleculares e celulares de vários tipos de células que compõem o sistema vascular cerebral pode ser adquirida a partir da cultura primária ou separação de células a partir de tecido cerebral dissociado recentemente. Contudo,Propriedades tais como polaridade celular, a morfologia e as relações intercelulares não são mantidos em tais preparações. O protocolo que se descrevem aqui é concebido para purificar fragmentos dos vasos do cérebro, ao mesmo tempo manter a integridade estrutural. Mostra-se que os vasos isolados são constituídos por células endoteliais seladas por junções apertadas, que são rodeadas por uma lâmina basal contínua. Pericitos, células musculares lisas, bem como as membranas de astrócitos endfeet perivasculares permanecem ligados à camada endotelial. Finalmente, nós descrevemos como a realização de experimentos de positividade em vasos cerebrais purificados.

Aqui, descrevemos um protocolo permitindo o isolamento mecânica dos vasos cerebrais 14. Figura 1 resume as principais etapas desta técnica. A arquitetura dos vasos cerebrais é complexa e inclui vários tipos de células, isto é, células endoteliais seladas por junções apertadas e pericitos, rodeados por células de músculo liso, e os processos de astrócitos do pé 9. Assim, após o isolamento dos vasos cerebrais, que teve como objetivo caracterizar a estrutura dos vasos purific...

Descrevemos um protocolo que permite a purificação do compartimento vascular do cérebro do camundongo. Os vasos cerebrais isolados incluem células endoteliais ligadas por junções apertadas e cercadas por uma lâmina basal contínua, pericitos, células musculares lisas vasculares, bem como membranas astrogliais perivasculares.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

O objetivo geral do procedimento é purificar o compartimento vascular do cérebro de camundongo mantendo sua integridade estrutural, utilizando uma série de centrifugações e filtrações de baixa velocidade, sem necessidade de anticorpos específicos ou linhagens transgênicas. Muitos esforços foram feitos para desenvolver técnicas que permitam investigações celulares, moleculares e farmacológicas da barreira hematoencefálica. A ausência de separação, gradientes, colunas ou etapas de centrifugação de alta velocidade torna a purificação dos vasos cerebrais por este procedimento muito simples, rápida e econômica.Os vasos cerebrais permanecerão estruturalmente intactos, com as células endoteliais seladas por junções especiais e rodeadas pelos parasitas basais em camada, células musculares lisas vasculares e membranas astrócitas perivasculares. Este protocolo pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a função do compartimento vascular do EC e permitir o estudo de sua composição molecular, demonstrando que o procedimento será realizado por um pós-doutorando da equipe de Martin Coen S. Antes de iniciar o procedimento, corte a parte inferior da seção superior rosqueável do suporte de filtro.Em seguida, use um bisturi para incisar a pele do pescoço do camundongo até o nariz e puxe a pele para trás. Lave o crânio com PBS para remover pelos contaminantes e, em seguida, insira uma tesoura no crânio anteriormente aos bulbos olfativos. Abra a tesoura para romper o crânio em partes e remova o cérebro com a espátula.Em seguida, dissecar o plexo coroide dos ventrículos laterais e transferir o cérebro para um béquer de 150 mililitros contendo 20 mililitros da solução B um em gelo. Depois, usar dois escalpelos para cortar vigorosamente o cérebro em fragmentos de tecido de dois milímetros e utilizar um homogeneizador automático para homogeneizar o tecido por 20 golpes a 400 RPM em gelo. Para purificar os vasos, transferir a homogeneizada para um tubo plástico de 50 mililitros e centrifugar a suspensão de tecido.Em uma centrífuga com rotor oscilante, uma grande interface branca, composta principalmente de mielina, se formará na parte superior do pellet do vaso. Descarte o sobrenadante em 20 mililitros de solução B dois gelada e agite o tubo vigorosamente por um minuto. Após uma segunda centrifugação, a mielina formará uma camada densa e branca na superfície do sobrenadante.Gire lentamente o tubo para permitir que a solução B dois escorra pela parede ao ser derramada e descarte a mielina com o sobrenadante. Em seguida, use uma pipeta de plástico envolta em papel absorvente para remover qualquer fluido residual das paredes do tubo. Tendo o cuidado de não tocar o pellet do vaso, vire o tubo de cabeça para baixo sobre gelo.Em seguida, reconstitua o precipitado em um mililitro de solução B três gelada, seguido pela adição de mais cinco mililitros de solução B três, tomando o cuidado para que os vasos não formem agregados. Coloque agora um filtro de malha de náilon de 20 mícrons sobre um frasco de Becker e equilibre o filtro com 10 mililitros de solução B três gelada. Despeje a preparação dos vasos sobre o filtro e lave cuidadosamente os vasos com mais 40 mililitros de solução B três gelada.Em seguida, utilize pin&ccedil;as limpas para transferir imediatamente o filtro para um b&eacute;quer contendo 30 mililitros de solu&ccedil;&atilde;o B tr&ecirc;s fresca e agite suavemente os frascos com o filtro. Despeje o conte&uacute;do do b&eacute;quer em um tubo pl&aacute;stico de 50 mililitros. Depois de uma centrifuga&ccedil;&atilde;o, re-suspenda o precipitado em um mililitro de solu&ccedil;&atilde;o B tr&ecirc;s gelada antes da imunomarca&ccedil;&atilde;o.Transfira os vasos para tubos PCR de 0,2 mililitro e coloque os tubos sobre gelo até que o sedimento tecidual se deposite no fundo dos tubos. Em seguida, use ponteiras para carregamento de géis para aspirar a maior parte do líquido. A seguir, insira uma capilar de vidro silanizada de 40 micrômetros em uma ponteira de pipeta P200 e use a capilar para transferir os vasos para uma lâmina de vidro; quando os vasos tiverem sedimentado, remova cuidadosamente o líquido com um pedaço de papel absorvente.Em seguida, coloque uma única gota de meio de montagem sobre os vasos e aplique uma lamínula em um ângulo de 45 graus, permitindo que o meio de montagem se espalhe ao longo da borda do vidro até que a lamínula esteja posicionada. Nesta imagem, pode-se observar a marcação contínua de RIN ao redor das células endoteliais neurais, confirmando a retenção da lâmina basal nos vasos purificados. Componentes das junções apertadas endoteliais, como ZO um, também são detectados nos vasos purificados.Além disso, a marcação para NG2 e actina de músculo liso indicam, respectivamente, a retenção de parasitas intactos e de células musculares lisas vasculares. As proteínas da membrana astra glial perivascular conexina 43 e aquaporina 4 também são detectadas na superfície dos vasos purificados, demonstrando a retenção adicional das membranas de astrócitos perivasculares durante o processo de purificação. No entanto, apenas fibras positivas para GFAP dispersas e curtas são observadas nos vasos isolados, revelando que os corpos celulares dos astrócitos não são co-purificados. Apenas algumas fibras neuronais permanecem ligadas aos vasos.Da mesma forma, células positivas para IBA um e oli dois também não são detectadas, confirmando que micróglias e oligodendrócitos não são co-purificados. Recomendamos enfaticamente remover o plexo coroide atual antes da homogeneização do cérebro, pois verificamos que ele pode ser uma fonte de contaminação, trabalhar em uma área limpa e evitar contaminação por cabelos e poeira, já que os anticorpos apresentam alta afinidade inespecífica por esses materiais.É igualmente importante realizar sempre uma coloração nuclear. É possível remover as células sanguíneas dos vasos purificados realizando uma perfusão intracardíaca com PBS antes da extração dos vasos. Extraímos com sucesso ácidos e proteínas de vasos purificados por este procedimento, tanto de paletas de vasos recém-preparadas quanto congeladas.Também utilizamos sondas fluorescentes e microscopia confocal para estudar a função de transporte endotelial ex vivo dos vasos. Desejamos boa sorte em seus experimentos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste artigo, apresentamos uma técnica simples e prática para a fundição cerebrovascular que é fácil de executar e pode ser utilizado para a imagem da árvore vascular do cérebro do rato adulto.

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Este vídeo demonstra o isolamento de vasos intactos do cérebro de um camundongo que constituem a barreira hematoencefálica (BBB) junto com neurônios e células gliais. Os vasos isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar seu papel na manutenção da homeostase cerebral.

Isolando vasos cerebrais de camundongos: um protocolo para isolar vasos intactos de amostras de cérebro murino

Este vídeo demonstra o isolamento dos capilares de cérebros suínos frescos. O processo envolve a remoção das meninges, isolando a substância cinzenta do tecido cerebral, homogeneizando e filtrando a substância cinzenta para isolar os capilares e, finalmente, usando a digestão enzimática para purificar ainda mais os capilares.

Purificando capilares de um cérebro suíno

Este vídeo demonstra um método para isolar pericitos cerebrais de um cérebro de camundongo. As células isoladas são cultivadas em meios específicos de pericitos para promover a proliferação de pericitos.

Isolando e cultivando pericitos cerebrais de camundongos

Este vídeo demonstra um método para isolar os tubos endoteliais do parênquima cerebral de camundongos. Por meio de uma combinação de digestão enzimática e dissociação mecânica, o processo produz um tubo intacto com células endoteliais.

Preparando tubos endoteliais cerebrais a partir de arteríolas parenquimatosas de camundongos

As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) são interconectadas por proteínas juncionais específicas formando uma barreira altamente regulada que separa o sangue e o sistema nervoso central (SNC), a chamada barreira hematoencefálica (BBB). O isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais murinas primárias, conforme discutido neste protocolo, permite estudos in vitro detalhados da BHE.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

Descrevemos aqui um protocolo reproduzível para isolar o círculo de Willis do camundongo.

Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Demonstramos a indução química da dilatação de grandes vasos sanguíneos em camundongos como um modelo para investigar a disfunção cerebrovascular, que pode ser usada para modelagem de demência vascular e doença de Alzheimer. Também demonstramos a visualização da vasculatura injetando composto de borracha de silicone e fornecendo orientação visual clara para medir as mudanças no tamanho dos vasos sanguíneos.

Uma abordagem visual para induzir dolicoectasia em camundongos para modelar disfunção cerebrovascular mediada por grandes vasos

Aprenda a purificar vasos cerebrais de camundongo preservando a integridade estrutural usando centrifugação de baixa velocidade e filtração. Este método simplificado permite investigações celulares e moleculares da barreira hematoencefálica sem anticorpos específicos.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

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