Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

O objetivo geral do experimento a seguir é permitir medições repetidas da condutividade hidráulica ou permeabilidade à água das paredes de microvasos Ular no mesentério de rato sob condições experimentais controladas. Isso é conseguido por meio da canulação de microvasos Ular, o que permite ajustar as pressões oncótica e hidrostática na luz do vaso e controlar com precisão a composição química do fluido perfundido e do fluido intersticial. Em seguida, o vaso é ocluído e os glóbulos vermelhos suspensos no fluido perfundido, que atuam como marcadores de fluxo, podem ser observados se movendo na luz do vaso como indicadores da troca transvascular de fluidos.

Então, a posição e a velocidade das células marcadoras vermelhas são registradas, seja em direção ao local da oclusão, seja afastando-se do local da oclusão. Por fim, a oclusão é liberada e repetida para medições adicionais ou o vaso é recanalizado. O cateterismo é repetido e as medições são realizadas novamente sob condições alteradas.

Em última análise, podem ser realizadas medições pareadas de condutividade hidráulica em condições de controle e teste, permitindo a investigação mais direta dos fatores que regulam a permeabilidade dos microvasos. Uma vantagem da técnica de Landis modificada para investigar a regulação da permeabilidade capilar é a etapa de perfusão. A microperfusão permite que a permeabilidade da parede dos microvasos seja medida em condições nas quais a composição do PERFUSE eight, a área superficial para troca e a pressão dos microvasos são diretamente controladas.

Este método pode abordar questões relativas aos mecanismos celulares e moleculares da regulação da permeabilidade em microvasos que são representativos de órgãos intactos, e pode fornecer comparação com resultados obtidos de monocamadas endoteliais cultivadas, que frequentemente são usadas para investigar os detalhes dos mecanismos moleculares. Demonstrando nosso protocolo está Joyce Clark, nossa gerente de laboratório. Joyce tem sido responsável por muitas das melhorias neste protocolo durante seu tempo conosco como gerente do laboratório.

Para começar, utilize um puxador eletrônico para moldar vários tubos capilares de vidro borossilicato em metades afiladas, cada um com um comprimento de ponta de aproximadamente um centímetro, usando uma mola abrasiva acionada a ar e um papel abrasivo de 0,5 mícron banhado em água e um suporte de micropipeta ajustado em um ângulo de 30 graus em relação à biselagem horizontal, as micropipetas. Após lavar e secar as micropipetas de acordo com o protocolo descrito, selecione micropipetas com uma abertura de cerca de 50 mícrons de comprimento e uma proporção entre comprimento e largura da bisel entre 3,1 e 3,5. Elas também devem apresentar uma ponta fortemente afilada, o que auxilia na penetração nas fibras colágenas resistentes do mesentério.

Para fabricar restringidores, segure brevemente uma capilar de vidro puxada sem bisel próximo a uma chama microscópica para formar uma extremidade romba. Repita o procedimento para produzir vários restringidores e armazene-os em uma caixa livre de poeira. Em seguida, prepare os oclusores microscópicos segurando um tubo capilar puxado sem bisel em um ângulo sob uma chama microscópica e utilize um adaptador de tubo ou uma micropipeta quebrada para dobrar suavemente o tubo a cerca de quatro milímetros da ponta, em um ângulo próximo a 120 graus.

Em relação ao eixo, é importante que a ponta não seja selada na chama nem quebrada. Após anestesiar uma rata e posicionar o tecido mesentérico e o intestino de acordo com o protocolo descrito no texto, coloque a bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério fique visível através das oculares. Posicione uma linha de gotejamento por gravidade com solução de Ringer de mamífero para superperfusão contínua.

O mesentério então utiliza compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter umidade e absorver o excesso de Ringer da superfície, ajusta o fluxo e aspira o efluente para manter uma camada constante de suse oito, identifica microvasos-alvo flar, que são segmentos não ramificados a jusante do fluxo convergente e uma ou duas ramificações distais aos capilares verdadeiros. Encontre um vaso não ramificado com fluxo sanguíneo rápido e livre de células brancas aderidas à parede do vaso. Possua. Posicione os microvasos-teste no centro do campo do microscópio e mova o restritor para perto do local escolhido para canulação.

Para preencher a micropipeta, aspire o perfusato oito e lave os eritrócitos em uma seringa preparada de acordo com o protocolo descrito no texto, certificando-se de que não haja bolhas no tubo. Avance o tubo até a extremidade larga da micropipeta até que atinja a região cônica. Aplique um empurrão suave e rápido no êmbolo da seringa para preencher a ponta da micropipeta.

Um filete ou gota minúscula aparecerá na ponta quando estiver cheio. Ao retirar a tubulação, pressione suavemente o êmbolo para preencher o corpo da micropipeta. Em seguida, remova as bolhas pequenas do corpo dando leves batidas nele.

Em seguida, coloque a micropipeta em um suporte de pipeta com um orifício lateral que permite uma conexão contínua de fluido com um manômetro de água. Certifique-se de que o suporte, que está preso a um acionador hidráulico e um micromanipulador, esteja posicionado em um leve ângulo horizontal para que a borda da ponta cônica da micropipeta não atinja o intestino ou a bandeja. Usando uma seringa ou uma bomba de borracha cheia de água, ajuste a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta alterando a altura do fluido na coluna de água do manômetro para cerca de 40 centímetros de água acima do mesentério.

Antes de posicionar a micropipeta cheia sob o microscópio, pressione suavemente o restringidor sobre o tecido próximo aos microvasos, aplicando força suficiente para segurar o tecido, depois puxe levemente o restringidor para trás, esticando o tecido ao longo dos microvasos, de modo que as tensões nas fibras colágenas mesentéricas fiquem alinhadas com o vaso. Alinhe a micropipeta com o vaso e abaixe-a até que entre no campo de visão através das oculares. Posicione a ponta logo a montante do local escolhido para canulação e abaixe-a sobre o tecido de forma que ela obstrua parcialmente o fluxo dentro do vaso, mas sem o ocluir.

Usando a unidade hidráulica, canule o vaso inserindo lentamente a ponta da pipeta na luz do vaso, tomando cuidado para não atravessar o outro lado do vaso. À medida que a micropipeta entra na luz, o fluido de perfusão rapidamente lavará o sangue da luz do vaso e entrará na circulação. Reduza a pressão de perfusão ajustando o manômetro até que as células vermelhas oscilem suavemente na luz do vaso.

Isso determina a pressão de equilíbrio, que mede a pressão hidrostática nos microvasos ou PC na extremidade distal do segmento dos microvasos. Mantenha a perfusão do vaso acima dessa pressão de equilíbrio para realizar a microoclusão. Posicione o bloqueador acima do vaso perfundido próximo à borda inferior do campo do microscópio utilizando vídeo e áudio.

Registre verbalmente a localização do local de bloqueio conforme visto no fragmento vermelho I. O local de bloqueio é 57, com a ponta do bloqueador posicionada logo acima do microvaso. Use o controle Z fino do micromanipulador para abaixar suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso seja ocluído.

Use o áudio para anotar a pressão do manômetro. A pressão é 50. Em seguida, aplique a oclusão por três a 10 segundos e libere.

Para restaurar a perfusão livre, mova o local do bloqueio ao longo do vaso em direção à ponta da pipeta em etapas de cinco a dez mícrons, realizando não mais do que três a cinco oclusões em cada local para evitar danos à parede do vaso no local do bloqueio. Analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Este curso temporal mede as alterações na condutividade hidráulica ou LP. Em microvasos urinários de rato, com sucesso na cânulação e com oito perfusões.

A magnitude da LP em pressão constante foi utilizada para medir alterações em microvasos. A permeabilidade da parede quando perfundida com BSA 1% como controle versus 10 molar do agente inflamatório Bradyquinina ou bk. Como mostrado aqui, bk causou um aumento transitório na LP que retornou aos níveis de controle dentro de 10 a 15 minutos.

Após restabelecer os níveis basais com BSA 1% 10 nanomolar, a BK foi reperfundida juntamente com um micromolar de pH sensível à fosfato ou S1P. Os resultados indicam que a S1P atenuou significativamente a resposta à BK. Para alguns delineamentos experimentais, é importante estimar tanto o coeficiente de reflexão do soluto para uma macromolécula quanto o Lp.

Isso é realizado melhor medindo-se JV em múltiplas pressões em cada vaso microscópico individual. Este experimento estimou tanto LP quanto a pressão oncótica efetiva da albumina a 5% no PERFUSE oito, quando não havia albumina nos tecidos ao redor dos vasos microscópicos. JV sobre S foi medido em três pressões diferentes e plotado aqui.

O LP é a inclinação da relação entre JV sobre S e a pressão, e o intercepto no eixo da pressão é a diferença efetiva de pressão oncótica através da parede do vaso. Quando combinado com outras técnicas, como marcação por imunofluorescência e microscopia confocal, ou mesmo microscopia eletrônica de transmissão, o microperfusão fornece uma análise poderosa do endotélio microvascular e da função, utilizando vasos de permeabilidade conhecida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar medições repetidas da condutividade hidráulica ou permeabilidade à água de microvasos ulares no mesentério de rato sob condições experimentais controladas.

Você pode usar esta abordagem em modelos de rato atualmente disponíveis, mas tenho especial interesse na possibilidade de ela ser utilizada em novos ratos geneticamente modificados que estarão disponíveis com a tecnologia CRISPR Cas nine, e espero que seja estendida dessa forma.