Name: Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprenda a técnica de microperfusão modificada de Landis para medir a condutividade hidráulica de microvasos no mesentério de ratos. Este método permite investigar a permeabilidade vascular e a troca transvascular em condições controladas.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenções HL44485 e HL28607.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional. 1. Fabricação preliminar de Micropipetas, contenção e bloqueadores <ol><li> Puxar vários tubos capilares de vidro de borosilicato limpas ao meio usando um extractor de electrónica ajustada de modo que, quando puxado, a parte alongada do tubo é de cerca de 1 cm de comprimento e as duas metades são um tanto simétrica. Certifique-se de que a vela é coerente com as dimensões em Figura 1. Use as duas metades para micropipetas, limitadores e bloqueadores. <ol><li> Bevel as micropipetas usando um rebolo ar impulsionado 30 com 0,5 um papel abrasivo banhado com água. Definir o ângulo do suporte de micropipeta de modo que é cerca de 30 graus a partir da horizontal. </li><li> Lave e seque as micropipetas usando sucção para puxar acetona limpa através da ponta e até o eixo. Inspecionar as micropipetas (Figura 1A), utilizando um pequeno microscópio vertical com 4 × 40 × objectivos e equipados com um titular micropipeta jacaré e um retículo ocular. </li><li> Seleccione micropipetas com abertura da ponta cerca de 50 um longo com um chanfro cuja relação comprimento / largura é de entre 3,1 e 3,5 e com um ponto agudamente afilada o que ajuda a penetrar nas fibras de colágeno difíceis no mesentério. </li><li> Armazenar 15-20 micropipetas de tamanhos ligeiramente diferentes em uma caixa livre de poeira. </li></ol></li><li> Faça limitadores utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segurar um tubo capilar de vidro removido brevemente perto de uma microflame para formar uma extremidade romba (Figura 1B). Armazenar vários em uma caixa livre de poeira. </li><li> Faça microoccluders utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segure um tubo capilar puxado sob uma microflame e dobre (usando um adaptador de tubulação, por exemplo., 23G), a ponta fina (cerca de 4 mm a partir da ponta) para fazer um ângulo de cerca de 120 graus para o eixo ( <sTrong&gt; Figura 1C). Fazer e armazenar vários. </li></ol> 2. Preparação animal e Cirurgia <ol><li> Anestesiar ratos fêmea Sprague-Dawley macho (350-450 g) ou (200-300 g) com pentobarbital de sódio (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761), por injecção subcutânea; proteger o mesentério, não utilizando injecção intraperitoneal. </li><li> Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, manter a anestesia por injecções suplementares (30 mg / kg), conforme necessário. Determinar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé ou reflexo da córnea. Após a conclusão do procedimento experimental, a eutanásia através de sobredosagem de pentobarbital de rato ou injecção intra-cardíaca de cloreto de potássio saturado, sob anestesia. </li></ol> 3. Prepare Soluções e Erythrocytes para uso como marcadores de fluxo <ol><li> Preparar a solução de Ringer de mamífero para a solução de controlo e superfusate perfusato (solução de Ringer contendo 10 mg / ml de ácido gordo de mamífero normalmentealbumina livre de soro bovino, BSA). <ol><li> Perfusato filtro através de 0.2 mm filtros de seringa para remover partículas minúsculas que podem bloquear a ponta micropipeta; filtrar para pequeno recipiente limpo. </li></ol></li><li> Prepare eritrócitos por tiragem de cerca de 0,2 ml de sangue a partir da veia da cauda do rato anestesiado em uma agulha 20G num pequeno seringa contendo 0,05 ml de heparina (1000 U / ml) e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo cerca de 14 ml de mamífero solução de solução de Ringer . <ol><li> Centrifugar para embalar suavemente as células vermelhas (cerca max 200 x g durante 7 min). Empate fora o sobrenadante e re-suspender as células vermelhas em solução de Ringer. </li><li> Após centrifugação e remoção do sobrenadante, três vezes deixar os glóbulos vermelhos no fundo do tubo para uso posterior. Note-se que este processo reduz as plaquetas em perfusatos finais para menos do que 0,1% dos níveis normais de 31. </li></ol></li></ol> 4. Organizar o tecido no animalBandeja <ol><li> Raspar o abdome do rato anestesiado abaixo do umbigo ao apêndice xifóide. Assegure-se que a área raspada se estende em torno do lado direito (para o rato colocado no lado direito), de modo que o cabelo não se forma um pavio para desenhar o superfusate fora do tecido bem. Remover cabelos cortados com uma gaze molhada ou tecido. <ol><li> Segurar a pele com uma pinça sem corte serrilhada e fazer uma incisão no centro da linha (2-3 cm de comprimento) através da pele utilizando uma tesoura resistentes. Usando uma multa (íris) tesoura fazer uma incisão semelhante através da linha alba, levantando a parede abdominal com uma pinça serrilhada para evitar danos ao intestino. </li><li> Com o animal em seu lado na bandeja do animal, puxe cuidadosamente o intestino a partir da cavidade abdominal utilizando aplicadores com ponta de algodão (vara de madeira) embebidos em solução de Ringer e uma pinça sem corte serrilhadas. Organizar o intestino no tecido bem para que o mesentério é estendida sobre o pilar para visualização através do microscópio tendo o cuidado de evitar tocar o mesentério (potentially danificar microvasos), quer com fórceps ou algodão. Nota: O tabuleiro do animal (Figura 2A) pode ser construído a partir de Plexiglas e requer um tecido bem (aproximadamente 3 mm de profundidade), uma coluna opticamente transparente (por exemplo, quartzo polido cerca de 2 cm de diâmetro e 5 mm de altura.), E uma almofada de aquecimento ajustada para manter a temperatura do animal. A espessura do pilar não deve exceder a distância de trabalho do objectivo. </li></ol></li><li> Posição da bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério é visível através das oculares. </li><li> Posicione uma linha de gotejamento alimentado por gravidade para superfuse continuamente o mesentério com solução de Ringer de mamífero mantida a 35-37 ° C. Use compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter a umidade, e pavio excesso de solução de Ringer fora da superfície. Ajustar o fluxo e aspirar o efluente para manter uma espessura superfusate consistente. </li><li> Identificar alvo microvasos venulares, que sãonão ramificados segmentos a jusante do fluxo convergente, um ou dois ramos distais aos verdadeiros capilares. Encontrar um vaso não ramificada (de preferência, 600 a 1000 um de comprimento) com o fluxo de sangue livre e rápida de células brancas que furam na parede do vaso. </li><li> Posicionar o teste de microvasos no centro do campo do microscópio e mover o limitador para a posição perto do sítio de canulação escolhido. </li></ol> 5. Preencha Micropipeta e Monte em Detentor <ol><li> Pouco antes da canulação, suspender as células vermelhas no perfusato. Adicionar 7 ul de eritrócitos a 0,5 ml de perfusato em um tubo de ensaio limpo borosilicato. Nota: hematócritos de 1-3% pode ser usado, mas hematócrito consistente levará a concentrações de perfusão consistente de qualquer substâncias libertadas a partir das células vermelhas. </li><li> Caber numa seringa de 1 ml com um adaptador de tubulação de 23G e PE 50 tubos (5-15 cm de comprimento). Desenha-se a mistura de células do perfusato / vermelho para dentro da seringa. Inverta a seringa para misturar e expulsar todas as bolhas de tubulação eadaptador. Para maior eficiência, ajuste tubulação para várias seringas antes do experimento começa e mantê-los em uma caixa livre de poeira ou saco plástico. </li><li> Encher a micropipeta com o avanço do tubo na extremidade mais larga da micropipeta até a mesma se encostar a região cónica. Aplicar um empurrão rápido suave sobre o êmbolo da seringa para encher a ponta da micropipeta. Nota: Um pequeno córrego ou uma gota deve ser visível na ponta para comprovar o preenchimento completo. </li><li> Retirar o tubo enquanto empurrando suavemente o êmbolo para preencher a parte mais larga do eixo micropipeta. Remover pequenas bolhas no grande eixo sacudindo cuidadosamente o eixo micropipeta. Nota: Um procedimento semelhante foi ilustrado 32. </li><li> Coloque a micropipeta em um suporte da pipeta com uma porta lateral que permite uma ligação de fluido contínuo a um manómetro de água. Assegure-se que o suporte, o qual está ligado a um accionamento hidráulico usado para controlar o avanço muito fina da micropipeta, é com um ligeiro ângulo (15-25 °)com a horizontal, de modo que a aresta do cone micropipeta não atingiu o intestino ou o tabuleiro. </li><li> Montar a unidade hidráulica de um micromanipulador móvel, que tem x, y, z e unidades para permitir alinhamento próximo ao recipiente de ensaio (Figura 2). </li><li> Ajustar a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta com uma seringa ou ampola de borracha cheio de água, para alterar a altura do fluido na coluna de água do manómetro de cerca de 40 cm H 2 O acima do mesentério. </li><li> Canular o de microvasos, logo que possível depois de encher a pipeta; células vermelhas assentar no fundo da pipeta, de modo que após cerca de 40 min muito poucas células vermelhas irá fluir para o vaso. </li></ol> 6. Microcannulation e microvasculares Medição Pressão <ol><li> Antes de posicionar a micropipeta preenchido sob o microscópio, pressione suavemente a restrição sobre o tecido perto do microvasos aplicar força suficiente para segurar o tecido. Desenhe olimitador de volta, que se estende ligeiramente o tecido de acordo com o de microvasos, de modo que as tensões nas fibras de colagénio mesentéricos são alinhados com o navio. <ol><li> Alinhe a micropipeta com a embarcação e abaixe-o na vista através das oculares. Colocar a ponta imediatamente a montante do sítio de canulação escolhido e colocá-la sobre o tecido, de modo que possa obstruir parcialmente o fluxo no interior do recipiente, mas isso não ocluir. </li></ol></li><li> Canular o navio dirigindo a ponta da pipeta lentamente para o lúmen do vaso usando a unidade hidráulica. Ter cuidado para não apertar através do lado inferior do recipiente. Observação: Como a micropipeta entra no lúmen, o perfusato lava-se rapidamente o sangue no vaso para fora do lúmen e flui livremente perfusato em circulação distal do animal ao teste de microvasos, deslocando algumas das perfusão normal do sangue nos vasos jusante. </li><li> Diminuir a pressão de perfusão, ajustando o manómetro até que o sangue (conforme indicadopelas células vermelhas do animal) é atraído de volta para o segmento de perfusão; esta determina a pressão de equilíbrio onde os glóbulos vermelhos oscilar suavemente no lúmen do vaso e mede a pressão hidrostática de microvasos (P C) na extremidade distai do segmento de microvasos. Manter a perfusão navio em todas as pressões acima essa pressão equilíbrio. </li></ol> 7. Microocclusion e Coleta de Dados <ol><li> Passo opcional: Antes de usar o micro-oclusor para bloquear o recipiente, que pressiona para o tecido numa zona não utilizada de mesentério longe de qualquer recipiente de modo que a ponta se acumula uma fina camada de tecido que protege o recipiente experimental durante micro repetido oclusões. </li><li> Colocar o bloqueador de cima do vaso perfundido perto da borda inferior do campo do microscópio. </li><li> Grave o seguinte com vídeo e áudio. <ol><li> Verbalmente registar a localização do sítio de bloqueio e o bordo inferior da tela, como visto no retículo ocular. </li><li> Com a pontado bloqueador colocado imediatamente acima do de microvasos, utilizar o controlo Z fina do micromanipulador para diminuir suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso está ocluso. Observe a pressão do manômetro (P c) em áudio. Aplicar oclusão normalmente para 3-10 segundos e solte, restaurando a perfusão livre. Mover o site quadra até o navio em direção à ponta da pipeta em 5-10 mm etapas com base no tempo (&gt; 5 min após o bloco inicial em um site), número de oclusões (3-5), para evitar danos da parede do vaso no local bloco . </li></ol></li></ol> 8. Análise de Dados e Medição da L p (de água) <ol><li> Durante a reprodução de vídeo, determinar a distância inicial (ℓ 0) a partir de um marcador de células vermelhas para o local de oclusão através da utilização de uma imagem de um micrómetro de plataforma e as posições conhecidas sobre as imagens. Determinar a velocidade inicial (dl / dt) da célula de marcador a partir da sua posição em vários quadros durante a 3-10 segundos de imagens gravadas. Dissuadirmina o raio do vaso (r) a partir das imagens captadas durante a oclusão (Figura 3). </li><li> Calcular J v / S para cada oclusão como (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcular G P a uma pressão constante como (J v / S) dividida pela pressão de condução (microvasos pressão - a pressão osmótica colóide eficaz; ver discussão). </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Detalhes dos cálculos de L p. Embora o movimento fluido transvascular ocorre enquanto o navio é perfundido livremente, essa troca é pequena demais para ser medido durante a perfusão livre porque é tipicamente menor do que 0,01% da taxa de perfusão navio. No entanto, quando a perfusão é transitoriamente interrompido por oclusão da micro-vasos, o fluxo transvascular (isto é, por filtração) é medido a partir do movimento das células marcador vermelho no lúmen que a coluna de líquido entre uma c...

Microperfusão na vasculatura inclui estabelecer um fluxo de perfusato artificial de composição conhecida controlada através de uma micropipeta em um vaso sanguíneo geralmente menos de 40 um de diâmetro. O recipiente continua a ser perfundido no seu ambiente de tecido normal e é perfundido com sangue do animal até ao momento da punção. Quando usado em conjunto com uma série de imagens de vídeo ou técnicas fluorométricos, em microperfusão situ permite a medição de fluxos de água e de solutos através das paredes de microvasos em condições onde as forças de condução para estes fluxos são conhecidos e as propriedades de permeabilidade da parede vascular podem ser avaliada diretamente. Além disso, por controlo da composição do líquido que rodeia o de microvasos no tecido (perfusado e superfusate), a regulação da permeabilidade microvascular e podem ser investigadas de câmbio, permitindo que as células endoteliais que formam a parede de microvasos para ser exposta a uma variedade de econdições Xperimental (agonistas, condições de perfusão modificados, indicadores fluorescentes para medir a composição e sinalização intracelular) por períodos precisamente medidas de tempo (seg a hr). Além disso, as avaliações ultra-estruturais ou citoquímicos de estruturas moleculares celulares chave que regulam a barreira pode ser investigadas no mesmo microvasos em que a permeabilidade está diretamente medidos. A abordagem assim, forma uma ponte entre a investigação dos mecanismos celulares e moleculares para modificar a função de barreira endotelial em monocamadas de células endoteliais cultivadas e investigação em microvasos intactas. Consulte os seguintes comentários para uma avaliação mais aprofundada 1-6. Uma limitação de microperfusão é que ela só pode ser utilizada em leitos microvasculares que são finas, transparentes e possuem integridade estrutural suficiente para permitir a canulação com uma micropipeta de vidro. Enquanto as primeiras investigações usado microvasos rã no mesentério e fino cutânea pectoris muscle 7,8, de longe, a preparação mais utilizada em modelos de mamíferos é o mesentério de rato 9-15. A maioria das investigações concentraram-se em alterações agudas na permeabilidade vascular estudado ao longo de períodos de 1-4 horas, mas as investigações mais recentes foram estendidos para medições em navios individuais 24-72 horas após uma perfusão inicial 12,16. A tecnologia CRISPR recentemente desenvolvido, que promete tornar mais modelos de ratos geneticamente modificados disponível para estudar regulação da permeabilidade vascular 17 deverá permitir que os métodos descritos na presente comunicação a ser aplicado em microvasos venulares do mesentério nestes novos modelos importantes de ratos. O método requer um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio construído sob encomenda suficientemente grande para conter tanto a preparação dos animais e, pelo menos, três micromanipuladores usadas para microferramentas posição próxima do vaso e perfundidos para alinhar uma micropipeta de perfusão com o naviolúmen. Por exemplo, uma plataforma personalizada para um estágio de microscópio XY (cerca de 90 × 60 cm) pode ser fabricada a partir de uma chapa de aço de 1 cm de espessura com um revestimento à prova de ferrugem. O palco está ligado a uma tabela de índice de engenharia ou duas lâminas de cauda de andorinha montados em ângulos retos e apoiados em pilares de teflon ou transferências bola para o movimento no plano horizontal. Um equipamento típico (ver Figura 2) tem muito em comum com o microscópio e microposicionamento equipamento utilizado para uma série de experimentos microcirculação intravital tais como aqueles para medir o fluxo único dos vasos sanguíneos e hematócrito, entrega local de oxigênio pelo sangue perfusão microvasos, regulação da liso vascular tônus ​​muscular, eo acúmulo microvascular local dos marcadores fluorescentes injetadas em toda a circulação 18-26. O aspecto fundamental da técnica é a medição do volume do caudal (J v) através de uma área de superfície definido (S) da parede de microvasos. Cumpriresta via a técnica Landis modificado aqui descrito um microscópio invertido simples é adequada. Uma pequena câmara de vídeo está montado na porta e o sinal de imagem de vídeo, com uma base de tempo adicional, é apresentada num monitor de video e registadas na forma digital num computador ou como um sinal digital ou analógico de um gravador de vídeo. Uma vez que a microvasculatura é canulada a porção do microvasos visível para a câmara pode ser alterado movendo o palco e manipuladores como uma unidade, sem perturbar a canulação. Medição dos fluxos transvascular pode também ser combinado com investigações mais detalhadas, utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados sofisticados, tais como sondas utilizadas para as medições de permeabilidade soluto, fluorescente monitorização relação de cálcio citoplasmático ou outros mecanismos celulares, e imagiologia confocal 6,12,13, 27. Uma das principais vantagens de todas as abordagens microperfusão é a capacidade de fazer medidas repetidas, no mesmo navio, Sob a mudança controlada de força motriz, tais como pressões hidrostática e oncótica, ou mudança induzida em respostas dos vasos para condições inflamatórias. O design mais comum é uma comparação pareada da condutividade hidráulica medida (L p) no mesmo navio com o primeiro recipiente de perfusão através de uma micropipeta preenchido com um perfusato controle e suspensão de eritrócitos para estabelecer um estado permeabilidade da linha de base, em seguida, com uma segunda pipeta com o agente de teste adicionado ao perfusado. Várias cânulas são possíveis com o ciclo repetido após reperfusão, com a pipeta de controle. O presente protocolo demonstra a canulação e microperfusão de um navio venular em mesentério de rato para gravar fluxos de água através da parede de microvasos e medir a G P da parede do vaso, um índice útil da permeabilidade da via comum para a água e os solutos através da intacta barreira endotelial. O procedimento é chamado de techniq Landis modificadoue porque o princípio original Landis de utilizar o movimento relativo de células vermelhas como uma medida de troca de fluido transvascular após perfusão é bloqueado é preservada 28, mas a gama de condições experimentais (por exemplo, as diferenças de pressão oncótica hidrostáticas e albumina através da parede de microvasos) disponível depois de microperfusão é muito maior do que no sangue perfusão microvasos canulados 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCÓPIO, MESA E PALCO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido (tipo metalúrgico) com cabeça trinocular para vídeo: exemplo</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>tente colocar oculares mais altas em relação ao palco - você tem que olhar através das oculares enquanto alcança o topo do palco sobre micromanipuladores intervenientes</td></tr><tr><td>microscópio invertido (tipo metalúrgico) com cabeça trinocular para vídeo: exemplo</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>tenta colocar oculares mais alto em relação ao palco - você tem que olhar através das oculares enquanto alcança o topo do palco sobre micromanipuladores intervenientes</td></tr><tr><td>diâmetro estreito, objetivo de longa distância de trabalho: exemplo</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10 &vezes; / 0,25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>plataforma de palco - 1/2 polegada ou 1 cm</td><td>oficina</td><td></td> de soldagem de chapa de aço <td>isso deve ser pesado para reduzir a vibração</td></tr><tr><td>Mesa Unislide x-y: corrediças de cauda de pomba</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO Câmera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de vídeo CCD: exemplo</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (não mais disponível)</td> <td>sem necessidade de cor</td></tr><tr><td>sistema de captura de vídeo com áudio -</td> sistema de reprodução de vídeo genérico <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(quadro completamente estático, movimento de quadro único)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pequeno microfone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULADORES, SUPORTES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (não mais disponível)</td><td></td><td>procure por Z fino, e maior alcance de deslocamento em acionamentos grosseiros para facilitar o posicionamento do</td></tr><tr><td>acionamento da sonda hidráulica, unidirecional</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>precisa comprar acionamento manual ou acionamento eletrônico</td></tr><tr><td>acionamento manual do tambor&nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>ou acionamento hidráulico, 3 vias</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1 via) ou MX630 (3 vias)</td> <td>ótimo para braços curtos, cheio de água e deve ser enviado de volta para recarga ~ a cada 2 anos</td></tr><tr><td>conectores / hastes / suportes</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>torno de pino</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>para segurar</td></tr> o <tr><td>suporte de pipeta</td> de retenção Manômetro de água <td>MPH3</td><td></td>da <td>World Prescision Instruments</td></tr><tr><td>~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BANDEJA DE</td><td></td><td></td><td></td>MICROSCÓPIO</tr><tr><td>Plexiglas transparente para bandeja de microscópio para animais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco de quartzo polido de 3/4 de polegada ~1/4 de polegada de altura</td><td>Quartzo Científico Inc.</td><td>personalizado</td><td>&nbsp;( ou plexiglass polido, vidro); certifique-se de que a altura seja menor que a distância de trabalho da objetiva</td></tr><tr><td>Cola de acrílico (solda 4: CUIDADO CARCINOGÊNIO)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>adesivo médico para poço de tecido</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>Tapete térmico de borracha de silicone multiuso, 5" L x 2" W</td><td>Aquecedor Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>para bandeja de microscópio - precisa de cabo e controlador - versão 240V disponível</td></tr><tr><td>Adaptador de Cabo de Alimentação para Aquecedores e Kits Kapton, 6 pés, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Controlador de Tensão Variável, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>FABRICAÇÃO</td><td></td><td></td><td></td>DE PIPETAS</tr><tr><td>EXTRATOR DE PIPETAS VERTICAL</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 com filamento</td><td></td>de nicromo</tr><tr><td>1.5 mm OD tubo capilar de parede fina</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>moedor de pipeta pedra de ar e microscópio de dissecação - veja a referência no texto</td><td></td><td></td><td>ou compre um pacote da Sutter Instruments ou World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Alternativa de máquina</td><td>para pedra de ar, use com um microscópio de dissecação montado em ângulo</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; com disco de afiação de cerâmica</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>use "como está" ou anexe</td></tr><tr><td>folhas de filme de lapidação de filme de lapidação, 0,3 ou 0,5 um 3M</td><td></td><td>part no. 051144 80827</td><td>268X Folhas de filme de lapidação imperiais com adesivo de volta - pode ser comprado na Amazon</td></tr></tbody></table>

microperf técnica para investigar regulamento de microvasos permeabilidade de rat mesentery

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

As experiências para medir as propriedades de permeabilidade dos microvasos perfundidos individualmente fornecer uma ponte entre a investigação dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a permeabilidade vascular em monocamadas de células endoteliais em cultura e as propriedades de leitos microvasculares inteiros câmbio funcionais. Um método para canular e perfundir microvasos venulares de mesentério de ratos e medir a condutividade hidráulica da parede de microvasos é descrito. O principal equipamento necessário inclui um microscópio intravital com um palco modificado grande que suporta micromanipuladores para posicionar três microtools diferentes: (1) uma micropipeta de vidro chanfrado de canulação e perfundem o microvasos; (2) um micro-vidro oclusor para bloquear temporariamente a perfusão e permitir a medição de transvascular movimento fluxo de água a uma pressão hidrostática medida, e (3) uma vareta de vidro fechado para estabilizar o tecido mesentérico ao sítio de canulação. A Landis micro-oclusão techniq modificadoue utiliza células vermelhas suspensas no perfusato artificial como marcadores de circulação de fluido transvascular, e também permite medições repetidas destes fluxos condições experimentais são alteradas e diferença de pressão osmótica e hidrostática colóide através dos microvasos são cuidadosamente controlados. As medições de condutividade hidráulica primeiro usando um perfusado de controlo, em seguida, após a re-canulação da mesma microvasos com os perfusatos teste permitir comparações de resposta de microvasos sob estas condições bem controladas emparelhado. As tentativas para alargar o método de microvasos no mesentério de ratos com modificações genéticas que se espera modificar a permeabilidade vascular foram severamente limitada, devido à ausência de microvasos compridas rectas e não ramificados no mesentério do rato, mas a recente disponibilidade dos ratos com modificações genéticas semelhantes usando CRISPR tecnologia / Cas9 deverá abrir novas áreas de investigação onde os métodos aqui descritos podem ser aplicados. </p&gt;

A Figura 4 mostra os resultados da medição do curso de tempo das alterações no G P num rato venular microvasos canulada sucessivamente com quatro perfusatos. 33 A magnitude de L p calculado a uma pressão constante foi usada como uma medida de mudanças na microvasos permeabilidade da parede, primeiro no estado de controlo com um perfusato contendo 1% de albumina de soro bovino, em seguida, quando o recipiente foi exposta ao agente inflamatório bradicinina (BK) através de ...

A técnica de Landis modificada permite a medição pareada da condutividade hidráulica de microvasos individuais no mesentério de ratos normais e geneticamente modificados sob condições de controle e teste usando técnicas de microperfusão. Ele fornece um método conveniente para avaliar os mecanismos que regulam a permeabilidade dos microvasos e a troca transvascular em condições fisiológicas.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

O objetivo geral do experimento a seguir é permitir medições repetidas da condutividade hidráulica ou permeabilidade à água das paredes de microvasos Ular no mesentério de rato sob condições experimentais controladas. Isso é conseguido por meio da canulação de microvasos Ular, o que permite ajustar as pressões oncótica e hidrostática na luz do vaso e controlar com precisão a composição química do fluido perfundido e do fluido intersticial. Em seguida, o vaso é ocluído e os glóbulos vermelhos suspensos no fluido perfundido, que atuam como marcadores de fluxo, podem ser observados se movendo na luz do vaso como indicadores da troca transvascular de fluidos.Então, a posição e a velocidade das células marcadoras vermelhas são registradas, seja em direção ao local da oclusão, seja afastando-se do local da oclusão. Por fim, a oclusão é liberada e repetida para medições adicionais ou o vaso é recanalizado. O cateterismo é repetido e as medições são realizadas novamente sob condições alteradas.Em última análise, podem ser realizadas medições pareadas de condutividade hidráulica em condições de controle e teste, permitindo a investigação mais direta dos fatores que regulam a permeabilidade dos microvasos. Uma vantagem da técnica de Landis modificada para investigar a regulação da permeabilidade capilar é a etapa de perfusão. A microperfusão permite que a permeabilidade da parede dos microvasos seja medida em condições nas quais a composição do PERFUSE eight, a área superficial para troca e a pressão dos microvasos são diretamente controladas.Este método pode abordar questões relativas aos mecanismos celulares e moleculares da regulação da permeabilidade em microvasos que são representativos de órgãos intactos, e pode fornecer comparação com resultados obtidos de monocamadas endoteliais cultivadas, que frequentemente são usadas para investigar os detalhes dos mecanismos moleculares. Demonstrando nosso protocolo está Joyce Clark, nossa gerente de laboratório. Joyce tem sido responsável por muitas das melhorias neste protocolo durante seu tempo conosco como gerente do laboratório.Para começar, utilize um puxador eletrônico para moldar vários tubos capilares de vidro borossilicato em metades afiladas, cada um com um comprimento de ponta de aproximadamente um centímetro, usando uma mola abrasiva acionada a ar e um papel abrasivo de 0,5 mícron banhado em água e um suporte de micropipeta ajustado em um ângulo de 30 graus em relação à biselagem horizontal, as micropipetas. Após lavar e secar as micropipetas de acordo com o protocolo descrito, selecione micropipetas com uma abertura de cerca de 50 mícrons de comprimento e uma proporção entre comprimento e largura da bisel entre 3,1 e 3,5. Elas também devem apresentar uma ponta fortemente afilada, o que auxilia na penetração nas fibras colágenas resistentes do mesentério.Para fabricar restringidores, segure brevemente uma capilar de vidro puxada sem bisel próximo a uma chama microscópica para formar uma extremidade romba. Repita o procedimento para produzir vários restringidores e armazene-os em uma caixa livre de poeira. Em seguida, prepare os oclusores microscópicos segurando um tubo capilar puxado sem bisel em um ângulo sob uma chama microscópica e utilize um adaptador de tubo ou uma micropipeta quebrada para dobrar suavemente o tubo a cerca de quatro milímetros da ponta, em um ângulo próximo a 120 graus.Em relação ao eixo, é importante que a ponta não seja selada na chama nem quebrada. Após anestesiar uma rata e posicionar o tecido mesentérico e o intestino de acordo com o protocolo descrito no texto, coloque a bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério fique visível através das oculares. Posicione uma linha de gotejamento por gravidade com solução de Ringer de mamífero para superperfusão contínua.O mesent&eacute;rio ent&atilde;o utiliza compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter umidade e absorver o excesso de Ringer da superf&iacute;cie, ajusta o fluxo e aspira o efluente para manter uma camada constante de suse oito, identifica microvasos-alvo flar, que s&atilde;o segmentos n&atilde;o ramificados a jusante do fluxo convergente e uma ou duas ramifica&ccedil;&otilde;es distais aos capilares verdadeiros. Encontre um vaso n&atilde;o ramificado com fluxo sangu&iacute;neo r&aacute;pido e livre de c&eacute;lulas brancas aderidas &agrave; parede do vaso. Possua. Posicione os microvasos-teste no centro do campo do microsc&oacute;pio e mova o restritor para perto do local escolhido para canula&ccedil;&atilde;o.Para preencher a micropipeta, aspire o perfusato oito e lave os eritrócitos em uma seringa preparada de acordo com o protocolo descrito no texto, certificando-se de que não haja bolhas no tubo. Avance o tubo até a extremidade larga da micropipeta até que atinja a região cônica. Aplique um empurrão suave e rápido no êmbolo da seringa para preencher a ponta da micropipeta.Um filete ou gota minúscula aparecerá na ponta quando estiver cheio. Ao retirar a tubulação, pressione suavemente o êmbolo para preencher o corpo da micropipeta. Em seguida, remova as bolhas pequenas do corpo dando leves batidas nele.Em seguida, coloque a micropipeta em um suporte de pipeta com um orifício lateral que permite uma conexão contínua de fluido com um manômetro de água. Certifique-se de que o suporte, que está preso a um acionador hidráulico e um micromanipulador, esteja posicionado em um leve ângulo horizontal para que a borda da ponta cônica da micropipeta não atinja o intestino ou a bandeja. Usando uma seringa ou uma bomba de borracha cheia de água, ajuste a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta alterando a altura do fluido na coluna de água do manômetro para cerca de 40 centímetros de água acima do mesentério.Antes de posicionar a micropipeta cheia sob o microscópio, pressione suavemente o restringidor sobre o tecido próximo aos microvasos, aplicando força suficiente para segurar o tecido, depois puxe levemente o restringidor para trás, esticando o tecido ao longo dos microvasos, de modo que as tensões nas fibras colágenas mesentéricas fiquem alinhadas com o vaso. Alinhe a micropipeta com o vaso e abaixe-a até que entre no campo de visão através das oculares. Posicione a ponta logo a montante do local escolhido para canulação e abaixe-a sobre o tecido de forma que ela obstrua parcialmente o fluxo dentro do vaso, mas sem o ocluir.Usando a unidade hidráulica, canule o vaso inserindo lentamente a ponta da pipeta na luz do vaso, tomando cuidado para não atravessar o outro lado do vaso. À medida que a micropipeta entra na luz, o fluido de perfusão rapidamente lavará o sangue da luz do vaso e entrará na circulação. Reduza a pressão de perfusão ajustando o manômetro até que as células vermelhas oscilem suavemente na luz do vaso.Isso determina a pressão de equilíbrio, que mede a pressão hidrostática nos microvasos ou PC na extremidade distal do segmento dos microvasos. Mantenha a perfusão do vaso acima dessa pressão de equilíbrio para realizar a microoclusão. Posicione o bloqueador acima do vaso perfundido próximo à borda inferior do campo do microscópio utilizando vídeo e áudio.Registre verbalmente a localização do local de bloqueio conforme visto no fragmento vermelho I. O local de bloqueio é 57, com a ponta do bloqueador posicionada logo acima do microvaso. Use o controle Z fino do micromanipulador para abaixar suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso seja ocluído.Use o áudio para anotar a pressão do manômetro. A pressão é 50. Em seguida, aplique a oclusão por três a 10 segundos e libere.Para restaurar a perfusão livre, mova o local do bloqueio ao longo do vaso em direção à ponta da pipeta em etapas de cinco a dez mícrons, realizando não mais do que três a cinco oclusões em cada local para evitar danos à parede do vaso no local do bloqueio. Analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Este curso temporal mede as alterações na condutividade hidráulica ou LP. Em microvasos urinários de rato, com sucesso na cânulação e com oito perfusões.A magnitude da LP em pressão constante foi utilizada para medir alterações em microvasos. A permeabilidade da parede quando perfundida com BSA 1% como controle versus 10 molar do agente inflamatório Bradyquinina ou bk. Como mostrado aqui, bk causou um aumento transitório na LP que retornou aos níveis de controle dentro de 10 a 15 minutos.Após restabelecer os níveis basais com BSA 1% 10 nanomolar, a BK foi reperfundida juntamente com um micromolar de pH sensível à fosfato ou S1P. Os resultados indicam que a S1P atenuou significativamente a resposta à BK. Para alguns delineamentos experimentais, é importante estimar tanto o coeficiente de reflexão do soluto para uma macromolécula quanto o Lp.Isso é realizado melhor medindo-se JV em múltiplas pressões em cada vaso microscópico individual. Este experimento estimou tanto LP quanto a pressão oncótica efetiva da albumina a 5% no PERFUSE oito, quando não havia albumina nos tecidos ao redor dos vasos microscópicos. JV sobre S foi medido em três pressões diferentes e plotado aqui.O LP é a inclinação da relação entre JV sobre S e a pressão, e o intercepto no eixo da pressão é a diferença efetiva de pressão oncótica através da parede do vaso. Quando combinado com outras técnicas, como marcação por imunofluorescência e microscopia confocal, ou mesmo microscopia eletrônica de transmissão, o microperfusão fornece uma análise poderosa do endotélio microvascular e da função, utilizando vasos de permeabilidade conhecida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar medições repetidas da condutividade hidráulica ou permeabilidade à água de microvasos ulares no mesentério de rato sob condições experimentais controladas.Você pode usar esta abordagem em modelos de rato atualmente disponíveis, mas tenho especial interesse na possibilidade de ela ser utilizada em novos ratos geneticamente modificados que estarão disponíveis com a tecnologia CRISPR Cas nine, e espero que seja estendida dessa forma.

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

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A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

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In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

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Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

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Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

Aprenda a técnica de microperfusão modificada de Landis para medir a condutividade hidráulica de microvasos no mesentério de ratos. Este método permite investigar a permeabilidade vascular e a troca transvascular em condições controladas.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

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