VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a composição clonal de amostras de linfoma para a identificação de padrões de evolução clonal no recidiva do linfoma. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de linfoma, como a forma pela qual tumores recidivados se originam dos tumores originais. A principal vantagem deste protocolo é que ele adapta a mais recente tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, permitindo um mapeamento mais abrangente das semelhanças entre linfomas.

Neste protocolo, o DNA será extraído de cortes finos de tecidos normais ou malignos congelados em OCT, bem como de tecidos fixados em parafina e formalina, para extrair DNA de tecidos congelados em OCT. Primeiro, digira de 10 a 30 cortes finos em quatro mililitros de tampão de lise de ácidos nucleicos com protease K e SDS 0,625% em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione um mililitro de cloreto de sódio saturado 5 molar à mistura de digestão e agite vigorosamente por 15 segundos, em seguida centrifugue a 1.100 ×g por 15 minutos.

À temperatura ambiente, transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Adicione dois volumes de etanol a 100% e misture invertendo o tubo de seis a oito vezes; centrifugue a 5.000 × g durante 60 minutos a quatro graus Celsius. Para coletar o DNA precipitado, lave o pellet de DNA duas vezes com etanol a 70%, centrifugando a 5.000 × g durante 15 minutos a cada vez.

Para coletar o pellet, dissolva o pellet de DNA em 100 a 400 microlitros de tampão TE à temperatura ambiente em agitador durante a noite para extrair o DNA de cortes finos de tecido embutido em parafina fixado com formol. Primeiro, desparafine incubando os cortes de parafina em um mililitro de xilol duas vezes à temperatura ambiente, por 10 minutos cada vez. Colete os cortes de tecido centrifugando a 13.000 × g por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova os resíduos de eluente incubando as seções em um mililitro de Etanol 100% duas vezes, à temperatura ambiente, durante 10 minutos cada vez. Colete as seções de tecido centrifugando a 13.000 ×g durante cinco minutos. À temperatura ambiente, seque as seções ao ar por 10 a 15 minutos.

Adicione uma solução fresca de protease K aos exemplos em um volume final de 50 a 100 microlitros e incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos para inativar a proteinase K. O rendimento de DNA das extrações demonstradas no segmento anterior é de cinco a 200 microgramas, dependendo do tamanho do tecido.

O próximo passo é avaliar a qualidade de cada amostra de DNA em uma mistura de tubos de PCR. Adicione 25 microlitros de polimerase TDNA a 45 microlitros de mistura mestra proveniente de um kit comercial de marcadores moleculares. Adicione cinco microlitros de DNA ao tubo de PCR e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos cinco vezes.

Amplifique o DNA seguindo as condições detalhadas no texto do protocolo. Em seguida, misture 20 microlitros da reação de PCR com quatro microlitros de corante carregador 6x e carregue em um gel de agarose 2%. Quando a eletroforese estiver completa, corar o gel de agarose com brometo de etídio e detectar os produtos de PCR.

Com um sistema de imagem de gel, as amostras que produzirem cinco produtos de PCR com tamanhos de 100, 200, 300, 400 e 600 pares de bases serão utilizadas exclusivamente para gerar amplicons VDJ. Neste vídeo, será demonstrada a amplificação do segmento I-G-H-V-D-J recombinado a partir da região estrutural um ou IGV HFR um. A amplificação do segmento I-G-H-B-D-J recombinado a partir da região estrutural dois segue um procedimento semelhante e é descrita no texto do protocolo em uma mistura em tubo de PCR.

45 microlitros da mistura mestra do tubo rotulado como mistura dois de um kit comercial de detecção em gel para ensaio de HIPERMUTAÇÃO SOMÁTICA IGH, 25 microlitros da DNA polimerase TAC e cinco microlitros de DNA da amostra para amplificar o DNA, seguindo as condições descritas no texto do protocolo. Para amplificar em condições subótimas de PCR de DNA, pode-se ajustar o tempo de alongamento ou aumentar o número de ciclos de amplificação. Resolva todos os produtos de PCR por eletroforese em um gel de AGROSE 2%, corado com solução de brometo de etídio a 0,5 microgramas por mililitro e detecte os produtos de PCR.

Com um sistema de imagem de gel, espera-se um amplicon monoclonal na faixa de tamanho de 310 a 380 pares de bases. Recorte a porção do gel contendo o amplicon monoclonal. Posteriormente, purifique o DNA do fragmento recortado do gel utilizando um kit padrão de extração de gel, conforme o protocolo do fabricante.

Para iniciar este procedimento, transfira o produto purificado V-D-J-P-C-R para um tubo de PCR e adicione o tampão de suspensão Resus do kit de preparação de amostras de DNA para completar o volume até 60 microlitros. Adicione 40 microlitros da mistura de reparo de extremidades do kit de preparação de amostras de DNA, homogeneíze bem e incube a reação a 30 graus Celsius por 30 minutos em um termociclador pré-aquecido com tampa pré-aquecida a 100 graus Celsius. Em seguida, misture 136 microlitros de microesferas magnéticas e 24 microlitros de água grau PCR em um tubo de 1,5 mililitro e transfira toda a reação de reparo de extremidades para o tubo, misturando bem com a solução de microesferas.

Coloque os tubos em um suporte magnético por dois minutos para permitir a separação das microesferas da solução. Aspire o sobrenadante e lave as microesferas duas vezes com etanol a 80% recém-preparado. Aspire completamente a solução de etanol e deixe as microesferas secarem ao ar por 15 minutos à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, retire os tubos do suporte magnético e re-suspenda as microesferas em 17,5 microlitros de Tampão de Re-suspensão. Coloque os tubos novamente no suporte magnético por dois minutos para separar as microesferas do Tampão de Re-suspensão. Transfira o Tampão de Re-suspensão, que agora contém o produto de reparo final, para um tubo de PCR limpo.

O próximo passo é adicionar uma cauda A ao produto da reparação de extremidades. Adicione 12,5 µL da mistura de adição de cauda A ao tubo de PCR contendo o produto da reparação de extremidades e misture bem. Incube os tubos de PCR a 37 °C por 30 minutos em um termociclador pré-aquecido com tampa pré-aquecida a 100 °C.

Para a ligação do adaptador, adicione 2,5 microlitros de tampão de re-suspensão, 2,5 microlitros de mistura de ligação e 2,5 microlitros de índice do adaptador de DNA à reação de adição de cauda A. Incube a reação a 30 graus Celsius por 30 minutos em um termociclador pré-aquecido com tampa pré-aquecida a 100 graus Celsius. Após 30 minutos, adicione cinco microlitros de tampão de parada da ligação a cada reação e misture completamente.

Adicione 42,5 microlitros de esferas magnéticas bem misturadas a cada reação e lave com etanol a 80%, conforme mostrado anteriormente. Adicione 50 microlitros de tampão de suspensão Resus para eluir o produto ligado ao adaptador. Limpe o produto ligado ao adaptador uma segunda vez utilizando 50 microlitros de esferas Ampu XP bem misturadas e elua o produto em 25 microlitros de Tampão de Suspensão Resus em um tubo de PCR limpo.

Para amplificar o Amplicon VDJ, adicione cinco microlitros do coquetel de iniciadores de PCR e 25 microlitros do mix mestre de PCR ao tubo de PCR contendo o produto com ligação de adaptador e misture bem; realize a amplificação em um termociclador com as condições descritas no texto do protocolo. Quando a amplificação estiver concluída, purifique a reação utilizando 50 microlitros de esferas magnéticas bem misturadas e elua o produto final em 30 microlitros de Tampão Resus. A biblioteca de Amplicon VTJ é posteriormente validada, agrupada e sequenciada conforme descrito no texto do protocolo.

Como a complexidade da biblioteca de sequenciamento VVG é baixa, recomendamos adicionar de 20 a 50% de FI de espaciamento em amostras de sequenciamento aprovadas para permitir uma chamada de base precisa. Essas imagens representativas em gel mostram os produtos de amplicon V-D-J-P-C-R obtidos a partir de DNA extraído de amostras de pacientes com linfoma. A qualidade do amplicon V-D-J-P-C-R antes e após a construção da biblioteca foi avaliada por meio de um bioanalisador.

O deslocamento no tamanho de 334 pares de bases para 459 pares de bases indica a adição do adaptador para rastrear a evolução clonal de um caso de recidiva de linfoma difuso de grandes células B. Análise filogenética dos perfis de mutação hiper somática ou SHM das principais rearranjos VDJ da cadeia pesada. Entre as amostras de diagnóstico e recidiva foi realizada.

O modo de evolução clonal divergente tardia foi observado. Novos métodos gráficos foram desenvolvidos para visualizar a evolução clonal. Os padrões mostrados são gráficos de escalonamento multidimensional de um modelo de recaída divergente tardia e de um modelo de recaída divergente precoce.

O raio de cada círculo indica a contagem de subclones correspondentes a um perfil específico de MHS. O azul corresponde à amostra de diagnóstico e o vermelho corresponde à amostra de recaída. Da mesma forma, os grafos não direcionados mostram que a distribuição das contagens de subclones no caso divergente tardio difere do caso divergente precoce.

As bordas correspondem a dois perfis de MHS que apresentam uma distância de sequência de uma letra de separação, e a barra de escala de cores indica a proporção de sequências que correspondem a um perfil específico de MHS, relativo à amostra de diagnóstico vermelha ou à amostra de recaída amarela. Ao realizar este procedimento, é importante evitar contaminações cruzadas entre as amostras. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a qualidade de amostras tumorais de linfoma.

Essa abordagem também pode ser usada para rastrear doenças residuais mínimas e investigar a resposta de vigilância imunológica contra cânceres. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.