Name: VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Aprenda a analisar a composição clonal de amostras de linfoma por sequenciamento profundo das regiões VDJ da cadeia pesada de imunoglobulina. Este método permite mapear padrões de evolução clonal entre diagnóstico e recidiva.

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Os autores gostariam de agradecer à Dra. Rita Shaknovich e aos membros do laboratório Elemento, do laboratório Melnick e do laboratório Tam pelas discussões ponderadas. Também gostaríamos de agradecer ao Núcleo de Recursos Genômicos do Weill Cornell Medical College por realizar o sequenciamento VDJ. YJ foi apoiado pelo ASH Scholar Award. WT e OE são apoiados pelo Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. A OE é apoiada pelo prêmio NSF CAREER, pelo Starr Cancer Consortium e pelo Hirschl Trust. Também gostaríamos de agradecer a Katherine Benesch, JD, MPH por seu generoso apoio a este projeto.

1. VDJ Amplification 1.1) a extração de DNA a partir de amostras de tumores <ol><li> Extrair DNA de cortes finos (10-20 um) de PTU tecidos normais ou malignas embutidos congelados. <ol><li> Digerir 10-30 secções finas de tecido embebido corte por micrótomo criostato um em 4 ml de tampão de lise Nucleico (0,0075 M Tris-HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na2EDTA) com proteinase K (0,5 mg / ml, concentração final ) e 0,625% de SDS num tubo de centrífuga de 15 ml num banho de água a 37 C ° durante a noite. </li><li> Adicionar 1 ml de solução saturada de NaCl (5 M) à mistura de digestão e agitar vigorosamente durante 15 segundos. </li><li> Centrifugar a 1.100 xg durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar dois volumes de etanol a 100%. </li><li> Misture invertendo o tubo 6-8 vezes. Centrifugar a 5.000 xg durante 60 min a 4 ° C para recolher o precipitado de ADN. </li><li> Lava-se a pelete de ADN duas vezes com etanol a 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min de cada vez para recolher o sedimento. </li><li> Dissolve-se o ADN em tampão de TE 100-400 uL à temperatura ambiente durante a noite num agitador. O rendimento de DNA é de 5 a 200 ug (concentração final entre 50-500 ng / mL), dependendo do tamanho do tecido </li></ol></li><li> Extrair DNA de cortes finos (10-20 um) de, incorporado (FFPE) tecido normal ou maligno incluídas em parafina fixado em formalina. <ol><li> Incubar secções de parafina em 1 ml de xileno duas vezes à temperatura ambiente, durante 10 min de cada vez, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de de-paraffinize. Recolher as secções de tecido por centrifugação a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar secções em 1 ml de etanol a 100% à temperatura ambiente duas vezes, 10 min cada vez, para remover xilenos resíduos. Recolher as secções de tecido por centrifugação a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. A parafina é completamente dissolvido neste momento e apenas a secção de tecido é restante. </li><li> Secar as seções em te quartomperatura por 10-15 min. </li><li> Adicione uma solução / ml de Proteinase K a 0,5 mg, com tampão de PCR 1x (diluído a partir de tampão de PCR 10x com água livre de nuclease). Adicionar a solução de proteinase K para as amostras num volume final de 50-100 ul e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Aquecer as amostras a 95 ° C durante 10 min para inactivar proteinase K. Nota: Neste passo, o ADN da amostra é dissolvida num tampão de PCR e pode ser utilizado nos passos 1.2 e 1.3 directamente. O rendimento de ADN é de 0,5 a 20 ug (concentração final entre 10-200 ng / mL), dependendo do tamanho do tecido. </li></ol></li></ol> 1.2) Avaliação da Qualidade DNA <ol><li> Misture 0,25 ul DNA polimerase Taq com 45 ul de mistura principal do kit de escada comercial em um tubo de PCR. </li><li> Adicionar 5 uL de ADN preparado a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou no tubo de PCR e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes. </li><li> Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e mantenha a 15 ° C. </li><li> Preparar um gel de agarose a 2% em TBE (Tris / borato / EDTA). </li><li> Misturar 20 uL da reacção de PCR com corante de carga 6x 4 ul, e carrega-se num gel de agarose a 2%. </li><li> Corar o gel de agarose com 0,5 ug ml de brometo de etídio solução / e detectar os produtos de PCR com um sistema de gel de imaginar. Observação: as amostras que produzem produtos de PCR em 5 tamanhos de 100, 200, 300, 400, e 600 pb será continuado para gerar produtos de amplificação VDJ. CUIDADO: O brometo de etídio é um agente mutagênico potente. Por favor, manipular com muito cuidado através do uso de protetor de artes, isto é, luvas, e dispor em recipientes específicos por diretrizes da instituição. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Segmento Amplify recombinados IgH VDJ do Framework Região 1 (IgVHFR1) <ol><li> Misture master mix 45 ul da etiqueta do tuboEd como &quot;mistura de 2&quot; de uma célula somática IGH Hipermutação Ensaio para a Detecção de Gel kit comercial, 0,25 ul ADN-polimerase Taq, e 5 ul de amostra de ADN preparado a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou em um tubo de PCR. </li><li> Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante 7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e mantenha a 15 ° C. </li><li> Resolver o produto de PCR todo em um 2% de gel de agarose por electroforese. </li><li> Corar o gel de agarose com 0,5 ug ml de brometo de etídio solução / e detectar os produtos de PCR com um sistema de imagem em gel. Um anticorpo monoclonal é amplicão esperado com a gama de tamanhos de 310-380 pb. </li><li> Extirpar a parte de gel contendo o fragmento amplificado monoclonal entre 310-380 pb. </li><li> Purifica-se o ADN a partir de gel excisado utilizando um kit de extracção de Gel padrão de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: para amostras que FR1 fragmentos poderiam ser obtidos, não há nenhuma necessidade de se amplamente IgVHFR2 e IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Segmento Amplify recombinado de IgH de estrutura da região VDJ 2 (IgVHFR2) <ol><li> Misturar mistura principal 45 ul do tubo rotulado como &quot;Tubo B&quot; de um comercial IGH Gene clonalidade Ensaio para a Detecção de kit Gel, 0,25 ul ADN-polimerase Taq, e 5 ul de ADN da amostra preparada a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou em um tubo de PCR . </li><li> Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante 7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e deixar a 15 ° C. </li><li> Resolver o produto de PCR todo em um 2% de gel de agarose por electroforese. </li><li> Visualizar produto de PCR (s) por 0,5 ug ml de brometo de etídio de coloração /. Um amplicão monoclonal pode ser observada dentro da gama de tamanhos de 250-295 pb. </li><li> Extirpar a parte de gel contendo o fragmento amplificado monoclonal entre 250-295 pb. </li><li> Purifica-se o ADN a partir de gel excisado utilizando um extracto de gel padrãoKit de iões de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 1.4) Optimize VDJ PCR <ol><li> Use as seguintes condições de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 e IgVHFR2 utilizando ADN sub-óptima: 95 ° C durante 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 seg, 60 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 90 seg, extensão final a 72 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparação e Sequencing 2.1) Preparação da biblioteca 2.1.1) Fim-de reparação <ol><li> Transfira produto PCR VDJ, de 1,3 em um tubo de PCR e adicionar Resuspension tampão de amostra de ADN Preparação Kit para abrir o volume para 60 mL. </li><li> Adicionar 40 ul de Reparação End Mix Kit de Preparação de Amostras de DNA e misture bem. </li><li> Incubar a reacção a 30 ° C durante 30 minutos num termociclador pré-aquecido (30 ° C) com uma tampa pré-aquecido a 100 ° C. </li><li> Misturar 136 ul de contas magnéticas e 24 ul de PCR grade água primeiro em um tubo de 1,5 ml, em seguida, transferir a reacção de toda extremidade de 2.1.1.3-reparação no tubo de 1,5 ml e misture bem com a solução de grânulos. </li><li> Colocar os tubos em um suporte magnético durante 2 min para permitir a separação das esferas da solução. Aspirar o sobrenadante e lavar as contas com 80% fresco preparado EtOH duas vezes enquanto o tubo está no suporte magnético. </li><li> Aspirar a solução de etanol completamente e permitir que as esferas secar ao ar durante 15 min à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Tome tubo fora do carrinho e re-suspenda as esferas magnéticas em 17,5 ul Resuspension Buffer. </li><li> Tubos lugar de volta no suporte magnético por 2 min a esferas separadas do Resuspension buffer. Remover o tampão de ressuspensão (End-reparação produto é ressuspenso no tampão de ressuspensão agora) num tubo de PCR limpo. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Adicionar 12,5 ul mix A-tailing para dentro do tubo de PCR contendo End-Conserto do produto e misture bem. </li&gt; <li> Incubar o tubo de PCR a 37 ° C durante 30 minutos num termociclador pré-aquecido (37 ° C) com uma tampa pré-aquecida a 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptor Ligation <ol><li> Adicionar 2,5 mL Resuspension Buffer, 2,5 ul Ligation Mix, e 2,5 l DNA Index Adaptor na reacção seguindo-A. </li><li> Incubar a reacção a 30 ° C durante 30 MINL num termociclador pré-aquecido (30 ° C) com uma tampa pré-aquecido a 100 ° C. </li><li> Adicionar 5 mL Parar Ligation tampão em cada reação e misture bem. </li><li> Misture 42,5 esferas magnéticas ul bem misturadas para limpar a reação seguinte etapas 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Adicionar 50 ul de tampão de ressuspensão para eluir o produto ligado-adaptador. </li><li> Limpar o produto ligado do adaptador por uma segunda vez, utilizando 50 ul bem misturada grânulos AMPure XP, e elui-se o produto em 25 ul de tampão de ressuspensão para um tubo de PCR limpo. </li></ol> 2.1.4) fragmentos de DNA Amplify <ol><li> Adicionar 5 mL PCR Primer Cocktail e 25 ul PCR Master Mix ao tubo de PCR contendo produto ligado adaptador e misture bem. </li><li> Efectue a amplificação num termociclador pré-programado com as seguintes condições: 98 ° C durante 30 seg; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg; em seguida 72 ° C durante 5 min e manter a 10 ° C. </li><li> Limpar a reacção, usando 50 ul de contas magnéticas bem misturadas, e elui-se o produto final em 30 ul de tampão de ressuspensão. </li></ol> 2.1.5) Biblioteca de Validação <ol><li> Quantificar o produto final com um fluorómetro utilizando o protocolo do fabricante. Biblioteca concentração final situa-se entre 2,5 a 20 ng / ul. </li><li> Avaliar a qualidade do produto final por meio de um instrumento analítico com chip de ADN alta sensibilidade de acordo com o protocolo do fabricante. Esperar uma única banda com o tamanho esperado para qualquer IGVHFR1, IGVHFR2 ou IGVHFR3. Texpected tamanho da biblioteca de produto é igual ao tamanho do fragmento amplificado VDJ original mais o tamanho dos adaptadores (~ 125 pb). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing <ol><li> Calcula-se a molaridade de cada fracção da biblioteca utilizando a seguinte fórmula: = nM [(ng / 1,000) / * 660 pb] x 9 10 em que ng é a concentração da biblioteca de VDJ-PCR medida no passo 2.1.5.1 e pb é o pico tamanho da biblioteca VDJ-PCR medida no passo 2.1.5.2. </li><li> Diluiu-se a biblioteca a 2 nM (10 ul total) com água sem ADNase. </li><li> Combinar os 10 ul da diluídos bibliotecas 2 nM em conjunto num tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar um volume igual de controlo de pico phix-in para o tubo de 1,5 ml. </li><li> Carregue o piscina na concentração 7:00 em uma célula de fluxo. </li><li> Sequenciar as bibliotecas usando um sequenciador de ciclo combinado-end 150 de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> Análise 3. Dados Nota: A summary dos scripts de bioinformática utilizados nesta secção podem ser encontrados como um Documento Suplementar código. 3.1) Alinhamento e QC <ol><li> Mapa emparelhados-end seqüenciamento lê contra um IGH humano V, D e banco de dados região J baixado do site da IMGT 11 utilizando um algoritmo explosão de nucleótidos adaptada com base em &#39;blastn&#39; disponível a partir de NCBI com gap open penalty de 2, lacuna extensão penalidade de 1, comprimento de palavra de 7, e de e-valor limiar de 10 -4. Descarte a-par ler não mapeia para tanto um IGH V e uma região J. </li><li> Contar as restantes pares de ler que têm IGH V e J mapeamentos para obter as frequências das correspondentes combinações VJ em todos ler pares obtidos a partir do sequenciamento corrida na amostra. Contagem de um par de leitura se está mapeado para um tanto CMI V e J do gene, e, em seguida, adicionar o seu alelo para a contagem correspondente para a combinação particular de VJ. </li><li> Posição as contagens para cada região recombinados VDJ obtido a partir 3.1.2 do altoEst para o menor. A região VDJ tem a maior contagem de lê é definido como importante concentração de rearranjo. </li><li> Descartar sequências alinhadas, que cobrem menos do que 35% do rearranjo importante domínio identificado em 3.1.3. </li></ol> 3.2) SHM perfil Identificação <ol><li> Contagem de todos os padrões de SHM em todo o lê a partir do passo 3.1.3. Definir cada padrão SHM como um subclone. </li><li> Contar o número de subclones que são correspondentes aos diferentes padrões únicos SHM, e o número de leituras que são mapeados para os subclones individuais. </li></ol> 3.3) representação gráfica dos resultados <ol><li> Realizar a análise filogenética nos subclones utilizando seus correspondentes padrões SHM usando um bairro método de pacote R &quot;macaco&quot; juntar de acordo com o protocolo do fabricante. Calcule uma matriz de distância dos alinhamentos distintos individuais para recriar a filogenia subclone enraizada para a sequência da linha germinativa do VJ combinação em questão para cada conjunto de amostras pareadas. </li><li> Utilizar a sequência de nucleótidos de cada subclone como vetor de caracteres e calcular a distância cadeia aproximada entre todos os subclones no grande rearranjo VJ tanto para o diagnóstico e amostras de recaída correspondentes, utilizando uma medida de distância Levenshtein onde matematicamente a distância entre dois alinhamentos é dado por d x, y (i, j), onde d x, y (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 em contrário, e depois resumir esta função ao longo do comprimento da cadeia de caracteres correspondendo a sequências de nucleótidos que i e j. </li><li> Graficamente exibir a matriz resultante das distâncias subclone e suas contagens subclone correspondentes nas duas formas seguintes: <ol><li> Usar o pacote R &quot;em massa&quot; de acordo com o protocolo do fabricante para aplicar escalonamento multidimensional para a matriz de distância subclone e gerar um princípio bidimensional coordenadas do mapa, o qual é então marcados ao longo com o logaritmocontagens de subclonal como o raio do círculo. </li><li> Construir um grafo não direcionado com base na distância de Levenshtein, onde os vértices correspondem a cada subclone distinta resultante da grande rearranjo VJ. Nota: Se a distância entre dois clones distintos é igual a um, então existe uma aresta entre estes dois vértices. Se a distância é maior do que um, então não há nenhuma aresta ligando-os. </li><li> Traçar o gráfico de 3.3.3.2 utilizando a função tkplot no &quot;IGRAPH&quot; pacote de R com o layout Kamada Kawai de acordo com o protocolo do fabricante. O raio dos vértices é proporcional à raiz cubos de o número total de clones mapeado para ele e o sombreamento usa um intervalo de vermelho e azul para indicar a percentagem de clones que podem pertencer ao diagnóstico (azul) ou recaída (vermelho) amostras . </li></ol></li></ol> 3.4) A heterogeneidade Entropia) Medição ( <ol><li> Examine os números e contagem do subclonepadrões individuais de hipermutação somática que ocorrem na maior rearranjo VJ emparelhado para cada conjunto de amostras. </li><li> Calcular a entropia empírica e entropia empírica residual ajustada para o número de clones distintos em cada amostra, utilizando a estimativa do histograma de entropia com base padrão. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Devido ao número quase ilimitado de iterações de informação sobre a sequência codificada por VDJ rearranjo e SHM no locus IGH de células B humanas, exame de todo o repertório de CMI por high-throughput-sequenciação profunda provou ser uma maneira eficiente e abrangente para delinear clonal e populações sub-clonais de células-B. Além disso, esta estratégia pode ser usada para estudar o caminho do desenvolvimento evolução clonal de células B do tumor, remissão, e recaída comparando as arquitecturas clonais e sub-clonais d...

O câncer é uma doença clonal. Desde há trinta anos atrás, quando Peter Nowell C. propôs o modelo de evolução clonal câncer 1, muitos estudos têm tentado dissecar populações clonais dentro de amostras de tumores e reconstruir expansão e evolução padrões clonais que fundamentam o processo de tumorigênese 2. Recentemente, todo o seqüenciamento do genoma permitiu que os investigadores tomar um profundo olhar para a heterogeneidade clonal e evolução 3,4. No entanto, devido à falta de marcadores tratáveis ​​em muitos tipos de células, é difícil deduzir a arquitectura clonal caminho preciso e evolutiva. Felizmente, existe um marcador clonality natural em células maduras B a partir do qual muitas doenças malignas linfóides, incluindo DLBCL, são originários. Em resposta a estimulação por antigénio, cada célula B pode formar uma única sequência de IgH VDJ produtiva juntando um H V (variável), um D (diversidade), e um J H (unir) segmento em conjunto a partir de um grande pool de estes segmentos. Durante este processo, pequenas porções da sequência original pode ser eliminado e nucleótidos não templated adicionais podem ser adicionados para criar um rearranjo VDJ única. Este rearranjo VDJ específica pode ser herdado em toda a descendência desta célula B, por conseguinte, a marcação de células B maduras individual e a sua prole 5. Além disso, SHM ocorre nas sequências de VDJ recombinados na reacção subsequente centro germinal (GC) para introduzir mutações adicionais para a expansão do conjunto de anticorpo e o aumento da afinidade do anticorpo 6. Portanto, comparando e contrastando padrões de amostras de linfoma que tenham sido submetidos a esses processos VDJ e SHM, heterogeneidade intra-tumoral pode ser delineada e caminho de evolução da doença clonal pode ser deduzida. Anteriormente, VDJ e rearranjo SHM puderam ser identificados por PCR amplificar as regiões recombinadas, clonagem dos produtos de PCR, e subsequentemente a sequenciação de Sanger para obter informação sobre a sequência. Esta abordagem is de baixo rendimento e baixo rendimento, recuperando apenas uma pequena parte de todo o repertório de VDJ recombinadas, e impedindo a caracterização da representação global da população clonal dentro de uma dada amostra. A abordagem modificada foi criado por meio da geração NGS indexados bibliotecas de seqüenciamento dos produtos de PCR VDJ e realizando PE 2x150 bp seqüenciamento obter mais de meio milhão de sequências VDJ recombinadas por amostra. Além disso, uma tubagem personalizada foi desenvolvido para realizar o controlo de qualidade (QC), alinhar, VDJ filtro sequenciação leituras para identificar rearranjos e SHMS de cada leitura, e realizar a análise filogenética na arquitectura clonal de cada amostra. Além disso, uma nova abordagem foi estabelecida para caracterizar adicionalmente os padrões de evolução clonal para amostras recolhidas em vários estádios da doença. Nós aplicamos essa técnica para amostras de pacientes LDGCB. DLBCL é uma forma agressiva de linfoma não-Hodgkin com recaídas freqüentes em até um thIRD dos pacientes 7. Recaídas LDGCB normalmente ocorrem no início, dentro de 2 a 3 anos do diagnóstico inicial, embora alguns ocorrem após 5 anos 8. O prognóstico para pacientes recidiva é pobre, com apenas 10% alcançar três anos sobrevida livre de progressão devido a opções de tratamento limitadas. Esta é a base para a necessidade urgente de novas abordagens para o tratamento de DLBCL recaída 9,10. No entanto, os mecanismos moleculares associados com DLBCL recaída são ainda desconhecidos. Em particular, o papel da heterogeneidade clonal no momento do diagnóstico e evolução clonal durante DLBCL desenvolvimento recaída são atualmente descaracterizado, o que torna difícil definir um biomarcador preciso e útil para predizer recaída. Para abordar essas questões, nós aplicamos nossa abordagem VDJ-sequenciação de múltiplos pares de pares combinados de amostra DLBCL diagnóstico de recidiva primária. Dois cenários evolutivos clonais distintos de recaída surgiu a partir da comparação dos arquiteturas clonais entre o diagnóstico e samp recaídales sugere que vários mecanismos moleculares podem estar envolvidos na DLBCL recaída.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 provas, para biologia molecular</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot; Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP) Solução Mix</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM cada nucleotídeo</td></tr><tr><td>10x PCR Buffer&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>Sem MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA Polimerase com Tampão de Ouro e Tecnologias de MgCl2</td><td>Life</td><td>4311806</td><td>50 &micro; l em 5 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Escada de Controle de Tamanho de Espécime</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 reações</td></tr><tr><td>Ensaio de Hipermutação Somática IGH v2.0 - Detecção de Gel</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 reações, Mix 2 para detecção de IGVHFR1</td></tr><tr><td>Ensaio de Clonalidade do Gene IGH - Detecção</td><td>de Gel Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 reações, Tubo B para detecção de IGVHFR2</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polimerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro; l em 5 U/&micro; l</td></tr><tr><td>10X Tris-Borato-EDTA (TBE) buffer</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAE BUFFER&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Solução de brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 pb DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>15628-019</td><td>1 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Solução de Acrilamida/Bis 40%</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td> Kit de Extração de Gel QIAquick de <td>500 ml</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 colunas</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNA de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ressuspensão (Kit de Preparação de Amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td>Mistura de reparo final <td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de Preparação de Amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td>Mistura de cauda A <td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de Preparação de Amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td>Mistura de ligação <td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de Preparação de Amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Índice do adaptador de DNA (Kit de preparação de amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Tampão</td> de parada de ligação Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de preparação de amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td>Coquetel de primer PCR <td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de preparação de amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Mistura mestre de PCR Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de preparação de amostra de DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Suporte magnético Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel</td><td></td> 4457858 <td></td> Life Technologies Bio-Rad Laboratories 170-8370 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq: análise sequenciamento profundo do reorganizados imunoglobulina cadeia pesada gene para revelar padrões clonal evolução do linfoma b celular

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Clonality tumor compreensão é fundamental para a compreensão dos mecanismos envolvidos na tumorigênese e progressão da doença. Além disso, a compreensão das alterações da composição clonais que ocorrem dentro de um tumor em resposta a certos micro-ambiente ou tratamentos podem levar à concepção de abordagens mais sofisticadas e eficazes para a erradicação de células de tumor. No entanto, o rastreamento tumorais clonais sub-populações tem sido um desafio devido à falta de marcadores distinguíveis. Para resolver este problema, um protocolo VDJ-seq foi criada para rastrear os padrões de evolução clonal de linfoma de grandes células B (LDGCB) recaída difusa, explorando VDJ recombinação e mutação somática (SHM), duas características únicas de linfomas de células B. Neste protocolo, Next-Generation seqüenciamento (NGS) bibliotecas com potencial de indexação foram construídos a partir de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjados amplificado (IgH) região VDJ de pares de diagnóstico primário e recaída samp DLBCLles. Em média, mais de meio milhão de sequências VDJ por amostra foram obtidos após o seqüenciamento, que contêm tanto VDJ e rearranjo informações SHM. Além disso, condutas bioinformatics personalizados foram desenvolvidos para utilizar completamente a informação de sequência para a caracterização de IgH-VDJ repertório dentro destas amostras. Além disso, a tubagem permite a reconstrução e comparação da arquitectura clonal de tumores individuais, o que permite o exame da heterogeneidade clonal dentro dos tumores de diagnóstico e dedução de padrões de evolução clonal entre o diagnóstico de tumor e pares de recaída. Ao aplicar essa análise para vários pares diagnóstico de recidiva, nós descobriu a evidência chave que múltiplos padrões evolutivos tumorais distintivo poderia levar a DLBCL recaída. Além disso, esta abordagem pode ser alargada a outros aspectos clínicos, tais como a identificação de doença residual mínima, monitorar o progresso recaída e resposta ao tratamento e investigação do repertório imunees em contextos não-linfoma.

O procedimento geral de VDJ sequenciação (VDJ-SEQ), incluindo a extracção de ADN, amplificação da região VDJ recombinados e a purificação, a construção da biblioteca de sequenciação, lê-se o processamento e análise filogenética, é representado na Figura 1. Rotineiramente 5-200 ug de ADN pode ser recuperado a partir de secções de tecido congelado ou 0,5-20 ug de ADN de secções de tecido fixado em formol e embebidos em parafina. Dependendo da qualidade, padrão de rearranjo, e SHM grau de ...

Este protocolo descreve uma abordagem para interrogar as regiões VDJ de cadeia pesada de imunoglobulina recombinada de linfomas por sequenciamento profundo e recuperar o rearranjo VDJ e o status de hipermutação somática para delinear a arquitetura clonal do tumor individual. A comparação da arquitetura clonal entre amostras pareadas de diagnóstico e recidiva revela os modos de evolução clonal de recidiva do linfoma.

VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a composição clonal de amostras de linfoma para a identificação de padrões de evolução clonal no recidiva do linfoma. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de linfoma, como a forma pela qual tumores recidivados se originam dos tumores originais. A principal vantagem deste protocolo é que ele adapta a mais recente tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, permitindo um mapeamento mais abrangente das semelhanças entre linfomas.Neste protocolo, o DNA será extraído de cortes finos de tecidos normais ou malignos congelados em OCT, bem como de tecidos fixados em parafina e formalina, para extrair DNA de tecidos congelados em OCT. Primeiro, digira de 10 a 30 cortes finos em quatro mililitros de tampão de lise de ácidos nucleicos com protease K e SDS 0,625% em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione um mililitro de cloreto de sódio saturado 5 molar à mistura de digestão e agite vigorosamente por 15 segundos, em seguida centrifugue a 1.100 ×g por 15 minutos.À temperatura ambiente, transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Adicione dois volumes de etanol a 100% e misture invertendo o tubo de seis a oito vezes; centrifugue a 5.000 × g durante 60 minutos a quatro graus Celsius. Para coletar o DNA precipitado, lave o pellet de DNA duas vezes com etanol a 70%, centrifugando a 5.000 × g durante 15 minutos a cada vez.Para coletar o pellet, dissolva o pellet de DNA em 100 a 400 microlitros de tampão TE à temperatura ambiente em agitador durante a noite para extrair o DNA de cortes finos de tecido embutido em parafina fixado com formol. Primeiro, desparafine incubando os cortes de parafina em um mililitro de xilol duas vezes à temperatura ambiente, por 10 minutos cada vez. Colete os cortes de tecido centrifugando a 13.000 × g por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, remova os resíduos de eluente incubando as seções em um mililitro de Etanol 100% duas vezes, à temperatura ambiente, durante 10 minutos cada vez. Colete as seções de tecido centrifugando a 13.000 ×g durante cinco minutos. À temperatura ambiente, seque as seções ao ar por 10 a 15 minutos.Adicione uma solução fresca de protease K aos exemplos em um volume final de 50 a 100 microlitros e incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos para inativar a proteinase K. O rendimento de DNA das extrações demonstradas no segmento anterior é de cinco a 200 microgramas, dependendo do tamanho do tecido.O próximo passo é avaliar a qualidade de cada amostra de DNA em uma mistura de tubos de PCR. Adicione 25 microlitros de polimerase TDNA a 45 microlitros de mistura mestra proveniente de um kit comercial de marcadores moleculares. Adicione cinco microlitros de DNA ao tubo de PCR e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos cinco vezes.Amplifique o DNA seguindo as condições detalhadas no texto do protocolo. Em seguida, misture 20 microlitros da reação de PCR com quatro microlitros de corante carregador 6x e carregue em um gel de agarose 2%. Quando a eletroforese estiver completa, corar o gel de agarose com brometo de etídio e detectar os produtos de PCR.Com um sistema de imagem de gel, as amostras que produzirem cinco produtos de PCR com tamanhos de 100, 200, 300, 400 e 600 pares de bases serão utilizadas exclusivamente para gerar amplicons VDJ. Neste vídeo, será demonstrada a amplificação do segmento I-G-H-V-D-J recombinado a partir da região estrutural um ou IGV HFR um. A amplificação do segmento I-G-H-B-D-J recombinado a partir da região estrutural dois segue um procedimento semelhante e é descrita no texto do protocolo em uma mistura em tubo de PCR.45 microlitros da mistura mestra do tubo rotulado como mistura dois de um kit comercial de detecção em gel para ensaio de HIPERMUTAÇÃO SOMÁTICA IGH, 25 microlitros da DNA polimerase TAC e cinco microlitros de DNA da amostra para amplificar o DNA, seguindo as condições descritas no texto do protocolo. Para amplificar em condições subótimas de PCR de DNA, pode-se ajustar o tempo de alongamento ou aumentar o número de ciclos de amplificação. Resolva todos os produtos de PCR por eletroforese em um gel de AGROSE 2%, corado com solução de brometo de etídio a 0,5 microgramas por mililitro e detecte os produtos de PCR.Com um sistema de imagem de gel, espera-se um amplicon monoclonal na faixa de tamanho de 310 a 380 pares de bases. Recorte a porção do gel contendo o amplicon monoclonal. Posteriormente, purifique o DNA do fragmento recortado do gel utilizando um kit padrão de extração de gel, conforme o protocolo do fabricante.Para iniciar este procedimento, transfira o produto purificado V-D-J-P-C-R para um tubo de PCR e adicione o tampão de suspensão Resus do kit de preparação de amostras de DNA para completar o volume até 60 microlitros. Adicione 40 microlitros da mistura de reparo de extremidades do kit de preparação de amostras de DNA, homogeneíze bem e incube a reação a 30 graus Celsius por 30 minutos em um termociclador pré-aquecido com tampa pré-aquecida a 100 graus Celsius. Em seguida, misture 136 microlitros de microesferas magnéticas e 24 microlitros de água grau PCR em um tubo de 1,5 mililitro e transfira toda a reação de reparo de extremidades para o tubo, misturando bem com a solução de microesferas.Coloque os tubos em um suporte magnético por dois minutos para permitir a separação das microesferas da solução. Aspire o sobrenadante e lave as microesferas duas vezes com etanol a 80% recém-preparado. Aspire completamente a solução de etanol e deixe as microesferas secarem ao ar por 15 minutos à temperatura ambiente.Após 15 minutos, retire os tubos do suporte magnético e re-suspenda as microesferas em 17,5 microlitros de Tampão de Re-suspensão. Coloque os tubos novamente no suporte magnético por dois minutos para separar as microesferas do Tampão de Re-suspensão. Transfira o Tampão de Re-suspensão, que agora contém o produto de reparo final, para um tubo de PCR limpo.O próximo passo é adicionar uma cauda A ao produto da reparação de extremidades. Adicione 12,5 µL da mistura de adição de cauda A ao tubo de PCR contendo o produto da reparação de extremidades e misture bem. Incube os tubos de PCR a 37 °C por 30 minutos em um termociclador pré-aquecido com tampa pré-aquecida a 100 °C.Para a ligação do adaptador, adicione 2,5 microlitros de tampão de re-suspensão, 2,5 microlitros de mistura de ligação e 2,5 microlitros de índice do adaptador de DNA à reação de adição de cauda A. Incube a reação a 30 graus Celsius por 30 minutos em um termociclador pré-aquecido com tampa pré-aquecida a 100 graus Celsius. Após 30 minutos, adicione cinco microlitros de tampão de parada da ligação a cada reação e misture completamente.Adicione 42,5 microlitros de esferas magnéticas bem misturadas a cada reação e lave com etanol a 80%, conforme mostrado anteriormente. Adicione 50 microlitros de tampão de suspensão Resus para eluir o produto ligado ao adaptador. Limpe o produto ligado ao adaptador uma segunda vez utilizando 50 microlitros de esferas Ampu XP bem misturadas e elua o produto em 25 microlitros de Tampão de Suspensão Resus em um tubo de PCR limpo.Para amplificar o Amplicon VDJ, adicione cinco microlitros do coquetel de iniciadores de PCR e 25 microlitros do mix mestre de PCR ao tubo de PCR contendo o produto com ligação de adaptador e misture bem; realize a amplificação em um termociclador com as condições descritas no texto do protocolo. Quando a amplificação estiver concluída, purifique a reação utilizando 50 microlitros de esferas magnéticas bem misturadas e elua o produto final em 30 microlitros de Tampão Resus. A biblioteca de Amplicon VTJ é posteriormente validada, agrupada e sequenciada conforme descrito no texto do protocolo.Como a complexidade da biblioteca de sequenciamento VVG é baixa, recomendamos adicionar de 20 a 50% de FI de espaciamento em amostras de sequenciamento aprovadas para permitir uma chamada de base precisa. Essas imagens representativas em gel mostram os produtos de amplicon V-D-J-P-C-R obtidos a partir de DNA extraído de amostras de pacientes com linfoma. A qualidade do amplicon V-D-J-P-C-R antes e após a construção da biblioteca foi avaliada por meio de um bioanalisador.O deslocamento no tamanho de 334 pares de bases para 459 pares de bases indica a adição do adaptador para rastrear a evolução clonal de um caso de recidiva de linfoma difuso de grandes células B. Análise filogenética dos perfis de mutação hiper somática ou SHM das principais rearranjos VDJ da cadeia pesada. Entre as amostras de diagnóstico e recidiva foi realizada.O modo de evolução clonal divergente tardia foi observado. Novos métodos gráficos foram desenvolvidos para visualizar a evolução clonal. Os padrões mostrados são gráficos de escalonamento multidimensional de um modelo de recaída divergente tardia e de um modelo de recaída divergente precoce.O raio de cada círculo indica a contagem de subclones correspondentes a um perfil específico de MHS. O azul corresponde à amostra de diagnóstico e o vermelho corresponde à amostra de recaída. Da mesma forma, os grafos não direcionados mostram que a distribuição das contagens de subclones no caso divergente tardio difere do caso divergente precoce.As bordas correspondem a dois perfis de MHS que apresentam uma distância de sequência de uma letra de separação, e a barra de escala de cores indica a proporção de sequências que correspondem a um perfil específico de MHS, relativo à amostra de diagnóstico vermelha ou à amostra de recaída amarela. Ao realizar este procedimento, é importante evitar contaminações cruzadas entre as amostras. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a qualidade de amostras tumorais de linfoma.Essa abordagem também pode ser usada para rastrear doenças residuais mínimas e investigar a resposta de vigilância imunológica contra cânceres. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

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Medicine

Medicina

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Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

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VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular (Vídeo) | JoVE Journal

VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular

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