Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

O objetivo geral deste artigo em vídeo é isolar mitocôndrias de alta qualidade de pequenas quantidades de músculo esquelético de camundongo para uso em ensaios tric baseados em microplacas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa biomédica, como descrever como certos medicamentos e proteínas modulam o músculo esquelético, o consumo de oxigênio mitocondrial. A principal vantagem dessa técnica é que as mitocôndrias de alta qualidade podem ser isoladas de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo do que foi relatado anteriormente.

Realize a eutanásia do camundongo de acordo com as diretrizes da instituição. Em seguida, posicione o mouse de lado e use uma tesoura de ponta fina para fazer uma incisão na pele. Sobrepondo o epicôndilo lateral do fêmur.

Retire a pele em direção ao mouse e, em seguida, remova a almofada de gordura posicionada sobre o ponto de origem do quadríceps. Em seguida, corte o tendão do quadríceps que está preso à patela. Corte lentamente a aponeurose entre o osso e o quadríceps, evitando a artéria femoral.

Em seguida, corte o tendão no ponto de origem do fêmur para liberar o músculo quadríceps e coloque o músculo quadríceps em PBS resfriado. Remova qualquer tecido adiposo visível sobre o quadríceps usando uma tesoura. Depois de limpo, vire o quadríceps para que a parte do músculo que estava sobreposta ao fêmur fique voltada para cima.

Abra o músculo quadríceps com uma pinça em um movimento de ventilação. Remova as duas porções musculares vermelhas visíveis de cada lóbulo e coloque-as em um béquer contendo cinco mililitros de mitocôndrias resfriadas. Buffer de isolamento.

Em seguida, corte a pele que cobre o tendão de Aquiles com uma tesoura de ponta fina e descasque a pele em direção ao mouse. Corte o tendão de Aquiles exposto e descasque o músculo em direção ao corpo do mouse. Corte o tendão nos côndilos lateral e medial do fêmur para liberar o gastrocnêmio e coloque o gastrocnêmio preso aos tendões em um prato cheio de PBS resfriado.

Vire o gastrocnêmio e retire o músculo sóleo. Coloque o músculo sóleo no béquer contendo cinco mililitros de mitocôndrias resfriadas. Buffer de isolamento.

Um próximo ventilador abriu o gastrocnêmio e removeu as três porções visuais do músculo vermelho. Haverá duas porções laterais e uma faixa vermelha superficial medial. Uma vez isolado, transferir o músculo vermelho para o copo contendo cinco mililitros de mitocôndrias geladas.

Buffer de isolamento um. Remova outros 75 a 100 miligramas de músculo vermelho da outra perna do mouse. Repetindo o processo que acabei de mostrar.

Coloque o músculo dissecado da segunda perna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com o coquetel de inibidores de protease e fosfatase e tampão de lise celular preparado conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Imediatamente pisque, congele a segunda amostra em nitrogênio líquido para uso em western blotting. Coloque uma superfície plástica plana pré-curada no gelo em um balde grande.

Em seguida, despeje uma gota de tampão de isolamento de mitocôndrias na superfície de plástico e use uma pinça para colocar todo o músculo vermelho seccionado em uma gota de isolamento. Buffer. Pique o tecido muscular por dois minutos usando lâminas de barbear de ponta única, mude para uma nova navalha afiada a cada 40 segundos. Transfira o tecido picado para um novo béquer com cinco mililitros de mitocôndrias frescas.

Buffer de isolamento um. Em seguida, pegue a solução e drene-a através de um filtro de células de 100 mícrons, colocado em um tubo cônico de 50 mililitros. Seque o tecido com um limpador de tarefas delicadas e, em seguida, transfira-o para cinco mililitros de uma solução de 0,05% de tentina.

Use uma pinça para remover qualquer tecido restante do limpador de tarefas e adicione-o à tripsina. Incube o tecido muscular na solução de tripsina no gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue a amostra a 200 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, despeje o supinato de tripsina em um recipiente de resíduos e ressuspenda o pellet com três mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias geladas um. Em seguida, transfira o tecido para um tubo homogeneizador de vidro de 45 mililitros. Enxágue o tubo cônico de 15 mililitros com mais 1,5 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndria para coletar qualquer amostra restante e adicione-a ao tubo homogeneizador de vidro.

Em seguida, coloque o tubo homogeneizador de vidro em um copo ou recipiente de plástico cheio até a metade com gelo. Assim, o homogeneizador de vidro se move minimamente dentro do béquer. Homogeneizar a amostra com um pilão de politetrafluoretileno ligado a um tecido motorizado.

Homogeneizador com 10 a 80 RPM. Segure a parte inferior de cada passagem por cerca de dois segundos. Em seguida, transferir o homogeneizado de tecido para um novo tubo cónico de 15 mililitros.

E enxágue o tubo homogeneizador de vidro com 6,5 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndria um. Despeje o tampão no tubo cônico de 15 mililitros contendo o resto do tecido. Homogeneizar. Gire a amostra a 700 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, despeje suavemente o supinato em um tubo de centrífuga de vidro de alta resistência e descarte o pellet.

Em seguida, gire o snat a 8.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para pellet as mitocôndrias, remova o snat e ressuspenda o pellet adicionando lentamente 500 microlitros de tampão de isolamento de mitocôndrias dois, corte a extremidade de uma ponta de pipeta e homogeneize suavemente o pellet no tampão com movimentos de mistura e agitação. Em seguida, adicione mais 4,5 mililitros de isolamento de mitocôndrias.

Tampão dois à mistura Depois que o pellet estiver totalmente suspenso, gire o homogeneizado a 8.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para novamente granular as mitocôndrias. Remova o sobrenadante S e ressuspenda suavemente, mas completamente, o pellet, adicionando 2 incrementos de 25 microlitros de isolamento de mitocôndrias. Tampão dois, usando uma ponta de pipeta com a ponta cortada, mexa suavemente e misture o pellet após cada edição de 25 microlitros de tampão.

Quando terminar, coloque esse estoque mitocondrial no gelo. Faça duas diluições separadas de uma a 20 do estoque mitocondrial em água de alta pureza. Adicione 0,1% de Triton 100 x a uma amostra e sonice por 10 segundos em uma configuração baixa.

Deixar a outra diluição no gelo e voltar a colocar a amostra sonicada no gelo. Após a sonicação, em seguida, execute um ensaio de citrato sintase com a diluição mitocondrial não sonicada e sonicada usando um ensaio fotométrico usando técnicas padrão, determine a porcentagem de membranas mitocondriais intactas usando as equações fornecidas no protocolo de texto anexo. A distribuição das mitocôndrias resulta em um aumento estatisticamente significativo na atividade da citratito sintase.

A atividade da cistase sintase em amostras mitocondriais não sonicadas em comparação com amostras sonicadas mostra que 92,5% das mitocôndrias estavam intactas após a expressão de isolamento de ga. DH e COX quatro são evidentes no lisado de todo o tecido na expressão mitocondrial isolada de Cox quatro é observada. Embora apenas bandas fracas de GA DH sejam evidentes, esses achados indicam bons isolamentos mitocondriais com pouca contaminação de componentes não mitocondriais durante o procedimento de isolamento.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o estoque mitocondrial com cuidado, nunca agitando-o ou misturando-o vigorosamente após este procedimento. Outros métodos, como medir a produção de espécies de ação reativa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se uma intervenção influencia a produção de espécies reativas de oxigênio em mitocôndrias isoladas.