Name: Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias de alta qualidade a partir de pequenas quantidades de músculo esquelético de camundongo para ensaios respirométricos em microplacas. Este método permite estudar o consumo de oxigênio mitocondrial e os efeitos de drogas e proteínas.

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O Fralin Life Science Research Institute e o Metabolic Phenotyping Core da Virginia Tech apoiaram este trabalho.

Os estudos em animais foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care e usar Comité na Virginia Polytechnic Institute e State University. 1. Instalação (Time: ~ 45 min) <ol><li> Lojas de congelados descongelamento de tripsina a 0,25%, tampão de isolamento para mitocôndrias (IBM) 1 e IBM2 em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Enxágüe copos e instrumentos de dissecação em etanol a 70%, seguido por água de alta pureza. </li><li> Preparar a solução de tripsina a 0,05% a partir de 0,25% estoque de tripsina diluindo 1 parte de tripsina em 4 partes IBM1. </li><li> Misturar protease e fosfatase cocktail inibidor com tampão de lise celular (1: 100 rácio) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca. </li><li> Alíquotas de 5 ml (5 ml / rato) de tripsina a 0,05% para um tubo de plástico de 15 ml. </li><li> Ajuste motorizado homogeneizador de tecidos a 80 RPM. </li></ol> 2. Isolamento de mitocôndrias Músculo Esquelético (Tempo: ~ 90 min) <ol><li> Euthanize um rato por CO 2 </sub&gt; inalação, seguido por deslocação cervical. </li><li> Remover músculo vermelho do músculo gastrocnémio e quadríceps, que inclui o sóleo (~ 75-100 mg no total) tal como descrito nas etapas a seguir: <ol><li> Descasque a pele para o mouse. </li><li> Remova a almofada de gordura sobre o ponto de origem do quadríceps. Corte o tendão do quadríceps que está ligado à patela com uma tesoura de ponta fina. Nota: O quadríceps é identificado por sua posição anatômica na porção anterior do fêmur proximal. </li><li> Lentamente cortar o aponeurosis entre o osso e os quadríceps, evitando a artéria femoral, para libertar os quadríceps do osso. Corte o tendão com uma tesoura de ponta fina no ponto de origem no fêmur para liberar o músculo quadríceps e coloque o músculo quadríceps em refrigerados PBS. </li><li> Remover o tecido adiposo visível sobre o quadríceps com uma tesoura. Virar o quadríceps de forma que a parte do músculo que se recobre o fémur é virado up. Abra o músculo quadríceps com uma pinça em um movimento de ventilação. Retire as duas porções musculares vermelhas visíveis de cada lobo com uma tesoura de ponta fina e coloque em um copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. Nota: músculo quadríceps aparecem como dois lobos com uma tira de músculo vermelho localizado perto da borda lateral de cada lóbulo. </li><li> Corte a pele que recobre o tendão de Aquiles com tesouras com ponta fina e descascar a pele na direção do mouse. Cortar o tendão de Aquiles exposta e descasque o músculo em direcção ao corpo do rato. </li><li> Corte o tendão no côndilos lateral e medial do fêmur com uma tesoura de ponta fina para libertar o gastrocnêmio e coloque o gastrocnêmio anexado aos seus tendões em refrigerados PBS. </li><li> Virar o gastrocnêmio sobre e descolar o músculo sóleo e coloque no copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. Fan abrir o gastrocnêmio. Remova os três porções visuais vermelhas musculares (duas tiras vermelhas lateral e um medial superficial) com tesoura de ponta finas e transferi-los para o copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. </li></ol></li><li> Remover outro ~ 75-100 mg de vermelho de músculo a outra perna do rato (conforme descrito no passo 2.2) e colocar num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com protease e fosfatase cocktail inibidor e tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de dodecil sulfato de sódio, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de polioxietileno (9) nonilfeniléter, ramificada. Imediatamente piscar-congelar esta segunda amostra em azoto líquido para posterior utilização em transferência Western (ver passo 6.1). </li><li> Colocar uma superfície de plástico pré-gelada, plana sobre gelo em um balde grande. Pour uma gota de IBM1 sobre a superfície de plástico e utilizar uma pinça para colocar todo o músculo vermelho segmentado (passo 2.2.4 e 2.2.7) em IBM1 gota. Picar o tecido muscular durante 2 minutos usando 3 individuais lâminas de barbear borda, alterando lâminas de barbear a cada 40 seg. </li><li> Transferir o tecido moído para um novo recipiente com 5 ml de IBM1 fresco, mantendo a superfície de plástico sobre o the proveta e raspando o músculo para a proveta com uma lâmina de barbear. Tome esta solução e drená-lo através de um filtro de células 100 mm colocados em um tubo de 50 ml. </li><li> Seque o tecido com um limpador tarefa delicada e, em seguida, transferi-la para 5 ml de solução de tripsina a 0,05%. Use pinças para remover o tecido a partir da tarefa do limpador. </li><li> Incubar o tecido muscular em gelo durante 30 min em solução de tripsina a 0,05%. </li><li> Rodar as tubo de 15 ml contendo mistura de tripsina / músculo a 200 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Despeje o sobrenadante tripsina em um recipiente de resíduos e ressuspender o sedimento com 3 ml de gelo frio IBM1. Transferir o tecido para um tubo de 45 ml homogeneizador de vidro. Lavar as 15 ml tubo cônico com mais 1,5 ml IBM1 para recolher qualquer amostra restante e adicione ao tubo de homogeneizador de vidro. </li><li> Colocar o tubo homogeneizador de vidro para um copo ou recipiente de plástico a meio caminho cheio de gelo de modo que o homogeneizador de vidro move-se minimamente no interior da taça. </li><li&gt; Homogeneizar a mistura tecido / IMB1 com o pilão de PTFE ligados a um homogeneizador de tecido accionada por motor com 10 passagens a 80 rpm. Segure a parte inferior de cada passagem para ~ 2 seg. </li><li> Transferir o homogeneizado de tecido para um novo tubo de 15 mL cónico e enxaguar o tubo homogeneizador de vidro com 6,5 ml de IBM1. Verter a IBM1 para dentro do tubo cónico de 15 ml contendo homogeneizado de tecido. </li><li> Girar o tubo de 15 ml a 700 g durante 10 min a 4 ° C. Delicadamente despeje o sobrenadante para um tubo de centrífuga de alta resistência vidro e descartar o pellet. </li><li> Girar o sobrenadante do passo anterior a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e re-IBM1 suspender o sedimento, adicionando-se lentamente 500 ul de IBM2. Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta e homogeneizar suavemente o sedimento em IBM2 com mistura e agitação movimentos. Adicionar mais 4,5 ml de IBM2 à mistura após a pelete é totalmente suspenso. Nota: Evite trituração excessiva ao quebrar pedaços maiores de pelotas como tHis pode danificar as membranas mitocondriais. </li><li> Girar o homogenato / tecido IBM2 a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C. Nota: Esta etapa pode ser repetida num tubo de centrífuga limpo de alta resistência, para a quantificação mais precisa da proteína de mitocôndrias isoladas no Passo 4, uma vez de BSA residual pode contribuir para o conteúdo de proteína total. </li><li> Remover o sobrenadante e suavemente, mas completamente re-suspender o sedimento, adicionando dois incrementos de 25 ul de IBM2 com uma ponta de pipeta com a ponta cortada. Agitar suavemente o sedimento e misturar após cada adição de 25 ul de IBM2. Coloque este estoque mitocondrial no gelo. </li></ol> 3. A homogeneização da Whole Tissue Lysate (Tempo: ~ 45 min; pode ser feito durante Passo 7) <ol><li> Remover o músculo do que foi colocada em azoto líquido a partir do passo 2.3 e incubar à temperatura ambiente até estarem completamente descongelados. </li><li> Picar o tecido para ~ 30 segundos em gelo com uma tesoura de ponta fina. </li><li> Adicione duas colheres de 100 ul de ZircoÓxido nio Beads para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca a partir do passo 3.2 que contém o tecido picada. Homogeneizar o tecido em um homogeneizador de tecidos moinho de esferas usando dois a três ciclos de 5 min a uma velocidade de 4-6 configuração (ajuste médio). </li><li> Girar-se a mistura a partir do passo 3.3 a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante utilizando uma ponta de pipeta de 1.000 ul, após a centrifugação e transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Desprezar o pelete e colocar o sobrenadante em gelo. </li></ol> 4. Determinação da proteína (Tempo: ~ 30 min) <ol><li> Determinar a concentração de proteína de lisado de todo o tecido (passo 3.4) e da mitocondrial (passo 2.17) utilizando o kit de ensaio de proteínas BCA de acordo com as especificações do fabricante. </li></ol> 5. As mitocôndrias Membrane Integridade; Citrato sintase (CS) Atividade (Tempo: ~ 15 min) <ol><li> Faça dois separados 1: 20 diluições do estoque mitocondrial em água de alta pureza. Adicionar0,1% de Triton X-100 para uma amostra e sonicate-lo em um nível baixo (765 Watts, amplitude de 2). Deixe a outra diluição no gelo. Recolocar a amostra de gelo após sonicação. </li><li> Realizar um ensaio de citrato sintase tanto com a não-sonicada e sonicada diluições mitocondriais utilizando um ensaio espectrofotométrico conforme anteriormente descrito 11,12. </li><li> Determinar a percentagem de membranas mitocôndrias intactas, utilizando as seguintes equações: (CS atividade não-sonicado ÷ sonicado atividade CS) * 100 </li></ol> 100- N- (percentagem obtida a partir de cima) 6. As mitocôndrias Qualidade de isolamento; Western Blotting (Horário: De acordo com Lab Protocol) <ol><li> Realizar Western blotting em todo o lisado de tecido e mitocôndrias isoladas como anteriormente descrito 12. Nota: O uso de anticorpos primários para GAPDH (1: 1000 de diluição em 5% de BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1000 de diluição em 5% de gordura não-leite / TBS-T), seguido por anti-cabra, e anticorpos secundários de coelho, respectivamente (1: 10.000). </li></ol> 7. respirométrico Ensaio Run (Time: ~ 90 min) <ol><li> Realizar ensaios respirométricos desejados utilizando baseado O 2 tecnologia de medição do consumo de microplaca, como descrito anteriormente (ver artigo do companheiro e Rogers et al 8). </li><li> Determinar a relação de controle respiratório (RCR) dividindo Estado 3 por Estado 4o (RCR) ou dividindo 3U Estado por Estado 4o. Use o (média) ponto médio, ou o mais elevado (estado 3) e taxas mais baixas (4o Estado) a partir de vestígios ponto-a-ponto ao determinar RCR. </li></ol>

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</ol>

George Rogers é um funcionário da Seahorse Bioscience que produz o instrumento para o qual este protocolo foi modificado.

Os métodos aqui apresentados proporcionam uma descrição detalhada de um procedimento de isolamento de quantidades mínimas mitocondrial (~ 75-100 mg) de rato músculo esquelético. Este procedimento de isolamento é capaz de produzir alto funcionamento, as mitocôndrias puro (~ 450 mg) como evidenciado pela O2 taxas de consumo, valores RCR, atividade da citrato sintase máxima e expressão de proteína de immunoblotting. Importante, as mitocôndrias isoladas a partir deste processo pode ser usado para múltiplos ensaio...

A principal função das mitocôndrias é produzir ATP a partir da fosforilação oxidativa. No entanto, as mitocôndrias têm muitas outras funções celulares importantes, incluindo, mas não se limitando a: a produção e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, a regulação do cálcio citoplasmático e mitocondrial, o tráfego de organelas, a homeostase iônica e o envolvimento na apoptose1,2. Portanto, não é surpreendente que as mitocôndrias disfuncionais desempenhem um papel em muitas patologias de doenças, como envelhecimento, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, câncer, obesidade e diabetes3,4. É importante ressaltar que as mitocôndrias do músculo esquelético estão especificamente envolvidas em muitas dessas patologias3-5.
Os ensaios de respiração mitocondrial usando mitocôndrias isoladas permitem a avaliação da cadeia de transporte de elétrons e da função de fosforilação oxidativa, e a determinação do(s) mecanismo(s) de ação de drogas e proteínas que modulam o metabolismo. Existem procedimentos de isolamento mitocondrial para vários tipos de tecidos e células para uma variedade de espécies6,7. No entanto, esses procedimentos geralmente requerem grandes quantidades de tecido/células para um rendimento mitocondrial de alta qualidade necessário para ensaios respirométricos clássicos. 
Os ensaios respiratórios baseados em microplacas permitem medições de alto rendimento usando quantidades mínimas de mitocôndrias isoladas, geralmente apenas alguns μg por poço8. Portanto, apresentamos uma modificação dos métodos publicados anteriormente7 para permitir que mitocôndrias de alta qualidade sejam isoladas de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo para uso em ensaios respiratórios baseados em microplacas. Além disso, são fornecidos métodos para estabelecer a qualidade da preparação do isolamento mitocondrial e a integridade das membranas mitocondriais. Dado que as mitocôndrias do músculo esquelético estão envolvidas em muitas condições patológicas, a medição do consumo deO2 em estudos mecanicistas está se tornando mais prevalente na pesquisa biomédica9,10.

<table><tbody><tr><td>Essencialmente gorduroso</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N / A</td></tr><tr><td>livre de ácido - BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris / HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N / A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N / A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E6511</td><td>N / A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho fenol</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio Cristais Brancos ou Pó Cristalino &ge; 99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Éter nonilfenílico de polioxietileno (12), ramificado</td> Lâminas de barbear <td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>de borda única</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Filtros de células de nylon</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halt Protease & Coquetel de inibidor de fosfatse</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de óxido de zircônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo GAPDH (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti- COXIV anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>4844s</td><td>Qualquer proteína mitocondrial da membrana interna será suficiente</td></tr><tr><td>Burro affinipure conjugado com Peroxidase, Anti Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugada affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ácido Pirúvico, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Loja em 4 &deg; C,pH até 7.4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico</td></tr><tr><td>Ácido Succínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Armazene à temperatura ambiente, pH até 7.4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico</td></tr><tr><td>L(-) Ácido Málico, BioXtra, &ge; 95%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Armazene em temperatura ambiente, a 7,4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Armazene em temperatura ambiente, a 7,4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico, a 7,4 com KOH antes de usar em ensaio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> respirométrico <tr><td>Cloreto de L-carnitina Palmitoil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Armazene a -20 ° C</td></tr><tr><td>Oligomicina A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Loja a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Loja em 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>fenilhidrazona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (TLC), pó [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A de streptomyces sp.</td><td>Loja Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato monopotássio sal desidratado [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Armazenar a -20 &graus; C, a 7,4 com KOH antes do uso no ensaio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> respirométrico <tr><td>Rotenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de rato músculo esquelético para medições high throughput microplate respiratórias

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Disfuncionais mitocôndrias do músculo esquelético desempenha um papel no metabolismo alterado observado com o envelhecimento, obesidade e diabetes tipo II. Ensaios respirométricos mitocondriais isoladas a partir de preparações mitocondriais permitir a avaliação da função mitocondrial, bem como a determinação do mecanismo (s) de acção de drogas e proteínas que modulam o metabolismo. Procedimentos de isolamento atuais requerem muitas vezes grandes quantidades de tecido para produzir mitocôndrias de alta qualidade necessários para ensaios respirométricos. Os métodos aqui apresentados descrevem como de alta qualidade mitocôndrias purificadas (~ 450 mg) pode ser isolado a partir de quantidades mínimas (~ 75-100 mg) de rato músculo esquelético para utilização em medições respiratórias alto rendimento. Nós determinamos que nosso método de isolamento produz 92,5 ± 2,0% mitocôndrias intacto medindo atividade da citrato sintase espectrofotometria. Além disso, a análise de Western blot em mitocôndrias isoladas resultou na expressão fraca da cytosoproteína lic, GAPDH, e a expressão robusta da proteína mitocondrial, COXIV. A ausência de uma banda proeminente GAPDH nas mitocôndrias isoladas é indicativo de pouca contaminação a partir de fontes não-mitocondriais durante o procedimento de isolamento. Mais importante ainda, a medição da taxa de consumo de O2 com a tecnologia de micro-placa de base e a determinação do índice de controlo respiratório (RCR) para ensaios respirométricos acoplados mostra altamente acopladas (RCR;&gt; 6 para todos os ensaios) e mitocôndrias funcionais. Em conclusão, a adição de um passo de picagem separado e reduzindo significativamente accionada por motor de velocidade de homogeneização de um método previamente relatado que permitiu o isolamento de alta qualidade e de mitocôndrias purificadas a partir de pequenas quantidades de rato músculo esquelético que resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com elevada função durante microplacas ensaios respirometirc.

Atividade da citrato sintase serve como uma medida para a integridade da membrana, uma vez sintase de citrato é localizado na membrana mitocondrial interna, e, portanto, não devem estar presentes nas suspensões de mitocôndrias com membranas intactas. A Figura 1 representa a actividade da sintase de citrato em amostras não sonicada mitocondriais em comparação com sonicada amostras do mesmo isolamento. Sonicando os resultados mitocôndria em um aumento estatisticamente significativo na atividade da citrato...

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

O objetivo geral deste artigo em vídeo é isolar mitocôndrias de alta qualidade a partir de pequenas quantidades de músculo esquelético de camundongo para uso em ensaios tric baseados em microplacas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na pesquisa biomédica, como descrever como certas drogas e proteínas modulam o músculo esquelético e o consumo mitocondrial de oxigênio. A principal vantagem desta técnica é que mitocôndrias de alta qualidade podem ser isoladas a partir de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo do que as previamente relatadas.Realize a eutanásia do camundongo de acordo com as diretrizes da instituição. Em seguida, posicione o camundongo de lado e use uma tesoura de ponta fina para fazer uma incisão na pele, sobrepondo o epicôndilo lateral do fêmur.Descasque a pele em direção ao mouse e, em seguida, remova o coxim de gordura posicionado sobre o ponto de origem do quadríceps. Em seguida, corte o tendão do quadríceps que está preso à patela. Corte lentamente a aponeurose entre o osso e o quadríceps, evitando a artéria femoral.Em seguida, corte o tendão no ponto de origem no fêmur para liberar o músculo quadríceps e coloque o músculo quadríceps em PBS refrigerado. Remova qualquer tecido adiposo visível sobre o quadríceps usando uma tesoura. Após a limpeza, vire o quadríceps de modo que a parte do músculo que estava sobrejacentes ao fêmur fique voltada para cima.Abra o músculo quadríceps com pinça em movimento de leque. Remova as duas porções vermelhas visíveis de cada lobo e coloque-as em um béquer contendo cinco mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias gelado.A seguir, corte a pele sobrejacente ao tendão de Aquiles com uma tesoura de ponta fina e puxe a pele em direção ao corpo do camundongo. Corte o tendão de Aquiles exposto e puxe o músculo em direção ao corpo do camundongo. Corte o tendão nos côndilos lateral e medial do fêmur para liberar o músculo gastrocnêmio e coloque o gastrocnêmio, ainda ligado aos seus tendões, em uma placa contendo PBS gelado.Virar o gastrocnêmio e remover o músculo sóleo. Colocar o músculo sóleo no béquer contendo cinco mililitros de mitocôndrias. Tampão de isolamento frio.Um pesquisador experiente abriu o gastrocnêmio e removeu as três porções visíveis do músculo vermelho. Haverá duas porções laterais e uma faixa superficial medial vermelha. Após isolado, transfira o músculo vermelho para o béquer contendo cinco mililitros de mitocôndrias geladas.Tampão de isolamento um. Remova mais 75 a 100 miligramas de músculo vermelho da outra perna do camundongo. Repita o processo recém-mostrado.Coloque o músculo dissecado da segunda perna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com o coquetel de inibidores de protease e fosfatase e o tampão de lise celular preparado conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Congele imediatamente a segunda amostra em nitrogênio líquido para uso em western blotting. Coloque uma superfície plana de plástico pré-aquecida sobre gelo em um balde grande.Em seguida, coloque uma gota de tampão de isolamento de mitocôndrias sobre a superfície de plástico e use pinças para colocar todo o músculo vermelho seccionado em uma gota do tampão de isolamento. Pique o tecido muscular por dois minutos utilizando lâminas de barbear de corte único, trocando para uma lâmina afiada nova a cada 40 segundos. Transfira o tecido picado para um novo béquer contendo cinco mililitros de mitocôndrias frescas.Tampão de isolamento um. Em seguida, pegue a solução e filtre-a através de um filtro celular de 100 microns, colocado sobre um tubo cônico de 50 mililitros. Seque o tecido com um lenço descartável de tarefa delicada e, então, transfira-o para cinco mililitros de uma solução de 0,05% de tripsina.Use tweezers para remover qualquer tecido remanescente do limpador de tarefas e adicione-o à tripsina. Incube o tecido muscular na solução de tripsina em gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue a amostra a 200 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, despeje o sobrenadante de tripsina em um recipiente de resíduos e re-suspenda o pellet com três mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias frio a 4 °C. Em seguida, transfira o tecido para um tubo de homogeneizador de vidro de 45 mililitros. Enxágue o tubo cônico de 15 mililitros com mais 1,5 mililitro do tampão de isolamento de mitocôndrias para recolher qualquer amostra remanescente e adicione isso ao tubo de homogeneizador de vidro.Em seguida, coloque o tubo de homogeneização de vidro em um béquer ou recipiente plástico preenchido até a metade com gelo, de modo que o tubo de homogeneização de vidro se mova o mínimo possível dentro do béquer. Homogeneíze a amostra com uma pistila de politetrafluoretileno acoplada a um homogeneizador de tecidos motorizado.Homogeneizador com 10 a 80 RPM. Mantenha a parte inferior de cada passagem por cerca de dois segundos. Em seguida, transfira o homogeneizado do tecido para um novo tubo cônico de 15 mililitros.E lave o tubo do homogeneizador de vidro com 6,5 mililitros do tampão de isolamento de mitocôndrias um. Despeje o tampão no tubo cônico de 15 mililitros que contém o resto do tecido homogeneizado. Centrifugue a amostra a 700 × g durante 10 minutos a 4 °C e, em seguida, despeje cuidadosamente o sobrenadante em um tubo de centrífuga de vidro de alta resistência e descarte o pellet.Em seguida, centrifugue o sobrenadante a 8.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Para obter o pellet de mitocôndrias, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet adicionando lentamente 500 microlitros do tampão de isolamento de mitocôndrias dois, corte a ponta de uma pipeta e homogeneíze suavemente o pellet no tampão com movimentos de mistura e agitação. Em seguida, adicione mais 4,5 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias.Adicione o tampão dois à mistura. Após a suspensão completa do pellet, centrifugue o homogenato a 8.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para pelotizar novamente as mitocôndrias. Remova o sobrenadante S e ressuspenda suavemente, mas completamente, o pellet adicionando incrementos de 25 microlitros de tampão de isolamento de mitocôndrias. Utilize uma ponta de pipeta com a ponta cortada, agite e misture suavemente o pellet após cada adição de 25 microlitros de tampão.Quando terminar, coloque este estoque mitocondrial no gelo. Prepare duas diluições separadas de um para 20 do estoque mitocondrial em água de alta pureza. Adicione 0,1% de Triton 100 x a uma amostra e sonique por 10 segundos em um nível baixo.Deixe a outra diluição no gelo e retorne a amostra sonificada ao gelo. Após a sonicação, realize um ensaio de citrato sintase com ambas as diluições mitocondriais, não sonificada e sonificada, utilizando um ensaio fotométrico com técnicas padrão, e determine a porcentagem de membranas mitocondriais intactas usando as equações fornecidas no protocolo textual complementar. A sonicação das mitocôndrias resulta em um aumento estatisticamente significativo da atividade da citrato sintase.A atividade da citrato sintase em amostras mitocondriais não sonicadas comparadas com amostras sonicadas mostra que 92,5% das mitocôndrias estavam intactas após o isolamento. A expressão de GA DH e COX quatro é evidente no lisado de tecido inteiro e na expressão de COX quatro observada nas mitocôndrias isoladas. Embora apenas bandas fracas de GA DH sejam evidentes, esses achados indicam um bom isolamento mitocondrial com pouca contaminação por componentes não mitocondriais durante o procedimento de isolamento.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular o estoque mitocondrial com cuidado, nunca fazendo vortex nem misturando vigorosamente após este procedimento. Outros métodos, como a medição da produção de espécies reativas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se uma intervenção influencia a produção de espécies reativas de oxigênio em mitocôndrias isoladas.

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Biology

Biologia

Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de...

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Aqui, uma amostra de músculo quadríceps é retirada de um porco anestesiado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. Em seguida, as frequências respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial são determinadas por meio de respirometria de alta resolução.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Mitocôndrias são organelas metabólicas chave que exibem um alto nível de plasticidade fenotípica no músculo esquelético. A importação de proteínas do citosol é um caminho crítico para a biogênese organela, essencial para a expansão do ritúlume e a manutenção da função mitocondrial.  Portanto, a importação de proteínas serve como um barômetro da saúde celular.

Medição da Capacidade de Importação de Proteínas das Mitocôndrias Musculares Esqueléticas

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Método para a dissociação enzimática, rotulagem superfície e purificação por citometria de fluxo de fibro / adipogénicos e progenitores miogênica de músculo esquelético murino.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Aprenda a isolar mitocôndrias de alta qualidade a partir de pequenas quantidades de músculo esquelético de camundongo para ensaios respirométricos em microplacas. Este método permite estudar o consumo de oxigênio mitocondrial e os efeitos de drogas e proteínas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

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