Estudar comunidades microbianas In Vivo: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre Candida Albicans E Pseudomonas aeruginosa Nas Airways

O objetivo geral deste procedimento é construir um modelo para estudar as interações entre uma bactéria individual e um único fungo. Esta mensagem pode ajudar a responder a questões-chave no campo das interações de patógenos, como quais fatores estão envolvidos na conversa cruzada e no dialeto interespécies. A principal vantagem desta técnica é que os dados gerados a partir deste modelo in vivo têm relevância clínica.

Para instalar o fungo por via intranasal, primeiro dilua duas vezes dez elevado ao sexto UFC de C. albicans por mililitro em PBS estéril. Em seguida, após confirmar a perda do reflexo de endireitamento em um camundongo hipotônico adulto, aspire pelo menos 50 microlitros da suspensão fúngica em uma pipeta de 200 microlitros. Agora, segure o rato com uma mão e vire o animal para que ele fique aninhado de costas com o abdômen voltado para cima.

Quando o mouse estiver em posição, use o dedo indicador da mão que segura o mouse para apoiar a cabeça e o polegar para manter a mandíbula fechada e mova a ponta da pipeta para perto do nariz do animal. Em seguida, dispense cuidadosamente uma gota de 50 microlitros de fungo nas narinas, permitindo que a gota seja inalada pela respiração espontânea do camundongo. E coloque o mouse sozinho em uma gaiola até que esteja totalmente recuperado.

Quatro dias após a instalação de C.albicans, raspar o abdômen do animal eutanasiado, seguido de esterilização com etanol da pele exposta. Em seguida, use uma tesoura para abrir a pele do esterno até o meio do abdômen. Em seguida, estenda a incisão ao longo da caixa torácica em ambos os lados da linha média e dobre a pele para trás em ambos os lados do tórax.

Quando a caixa torácica estiver visível, faça uma incisão vertical em ambos os lados do tórax em direção às clavículas e use o esterno para reclinar toda a parede torácica anterior para visualizar o coração e os pulmões. Em seguida, usando uma seringa pré-heparinizada, perfure o coração próximo à artéria intraventricular e retire um mínimo de 500 microlitros de sangue. Coloque a amostra de sangue no gelo.

Em seguida, faça uma incisão cervical na linha média para revelar a traqueia. Disseque cuidadosamente a fáscia ao redor da traqueia, seguida pela colocação de uma sutura sob a traqueia. Em seguida, use uma agulha de gavagem modificada de calibre 20 para cateterizar a traqueia, prendendo a cânula com a sutura previamente colocada.

Para realizar uma lavagem broncoalveolar, dispense suavemente 500 microlitros de PBS gelado no pulmão. Em seguida, aspire o fluido de lavagem e transfira o fluido para um tubo de centrífuga de dois mililitros no gelo. Depois de coletar mais duas amostras de 500 microlitros, remova os pulmões do tórax e coloque um pedaço de pulmão em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro para armazenamento imediato a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, coloque outro pedaço de tecido pulmonar em um tubo de hemólise pré-pesado contendo PBS no gelo. Por fim, faça uma incisão no lado esquerdo do abdômen. Colha o baço em um segundo tubo de hemólise contendo um mililitro de PBS e coloque o tubo no gelo.

Um modelo de persistência de quatro dias é obtido por instalação intranasal de cinco vezes dez elevado à quinta UFC de C. albicans por camundongo. Durante esses quatro dias, os camundongos ganham peso, mas não apresentam lesão pulmonar. À medida que a UFC do inóculo aumenta, no entanto, o mesmo acontece com a lesão pulmonar.

Com a lesão pulmonar máxima observada entre 24 a 36 horas após a infecção. A carga bacteriana, por outro lado, demonstra uma diminuição de um log de UFC por mililitro a cada 24 horas, com um aumento cumulativo de disseminação bacteriana observado a cada dia. Na lavagem broncoalveolar colhida de camundongos infectados, os neutrófilos são amplamente recrutados, com a contagem diferencial de células demonstrando uma população de células imunes infiltrando 90% de neutrófilos e 10% de macrófagos.

Após esse procedimento, outros métodos, como a análise do lavado broncoalveolar, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a caracterização da resposta inflamatória. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir uma colonização Pseudomonas. Não se esqueça de que trabalhar com Candida luminescente pode ser extremamente perigoso, e as precauções, como o uso de equipamentos de proteção para evitar a contaminação por gotículas, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.