Estudar comunidades microbianas

O objetivo geral deste procedimento é construir um modelo para estudar as interações entre uma bactéria individual e um único fungo. Esta abordagem pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das interações entre patógenos, como quais fatores estão envolvidos na comunicação cruzada e no dialeto interespecífico. A principal vantagem desta técnica é que os dados gerados por este modelo in vivo possuem relevância clínica.

Para instilar o fungo por via intranasal, primeiro dilua duas vezes dez elevado à sexta UFC de C.albicans por mililitro em PBS estéril. Em seguida, após confirmar a perda do reflexo de endireitamento em um camundongo adulto hipotônico, aspire pelo menos 50 microlitros da suspensão fúngica para uma pipeta de 200 microlitros. Agora, segure o camundongo com uma mão e vire o animal de modo que fique deitado de costas, com o abdômen voltado para cima.

Quando o camundongo estiver em posição, use o dedo indicador da mão que segura o animal para sustentar a cabeça e o polegar para manter a mandíbula fechada, e aproxime a ponta da pipeta do nariz do animal. Em seguida, dispense cuidadosamente uma gota de 50 microlitros de fungo nas narinas, permitindo que a gota seja inalada pela respiração espontânea do camundongo. Depois, coloque o camundongo sozinho em uma gaiola até que se recupere completamente.

Quatro dias após a instalação de C.albicans, realize a depilação do abdômen do animal eutanasiado, seguida pela esterilização da pele exposta com etanol. Em seguida, use uma tesoura para abrir a pele do esterno até o abdômen médio. Depois, estenda o corte ao longo da caixa torácica em ambos os lados da linha média e puxe a pele para trás em ambos os lados do tórax.

Quando as costelas estiverem visíveis, faça uma incisão vertical em ambos os lados do tórax em direção às clavículas e use o esterno para afastar toda a parede torácica anterior, permitindo visualizar o coração e os pulmões. Em seguida, com uma seringa pré-heparinizada, perfure o coração próximo à artéria interventricular e retire um mínimo de 500 microlitros de sangue. Coloque a amostra de sangue sobre gelo.

Em seguida, faça uma incisão cervical mediana para expor a traqueia. Disseque cuidadosamente a fáscia ao redor da traqueia, seguido pelo posicionamento de uma sutura sob a traqueia. Em seguida, utilize uma agulha de gavagem modificada de 20 calibres para cateterizar a traqueia, fixando a cânula com a sutura previamente colocada.

Para realizar uma lavagem broncoalveolar, dispense suavemente 500 microlitros de PBS gelado no pulmão. Em seguida, aspire o fluido de lavagem e transfira-o para um tubo de centrífuga de dois mililitros sobre gelo. Após coletar mais duas amostras de 500 microlitros, remova os pulmões da cavidade torácica e coloque um fragmento de pulmão em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro para armazenamento imediato a menos 80 graus Celsius.

Em seguida, coloque outro pedaço de tecido pulmonar em um tubo de hemólise previamente pesado contendo PBS sobre gelo. Por fim, faça uma incisão no lado esquerdo do abdômen. Retire o baço e coloque-o em um segundo tubo de hemólise contendo um mililitro de PBS e coloque o tubo sobre gelo.

Um modelo de persistência de quatro dias é obtido por instilação intranasal de cinco vezes dez à quinta UFC de C.albicans por camundongo. Durante esses quatro dias, os camundongos ganham peso, mas não apresentam lesão pulmonar. No entanto, à medida que a UFC do inóculo aumenta, a lesão pulmonar também aumenta.

Com a lesão pulmonar máxima observada entre 24 e 36 horas após a infecção. A carga bacteriana, por outro lado, demonstra uma redução de um log de UFC por mililitro a cada 24 horas, com um aumento cumulativo da disseminação bacteriana observado a cada dia. No lavado broncoalveolar coletado de camundongos infectados, há ampla recrutamento de neutrófilos, sendo a contagem diferencial de células composta por 90 por cento de neutrófilos e 10 por cento de macrófagos e linfócitos como população de células imunes infiltrantes.

Após este procedimento, outros métodos, como a análise do lavado broncoalveolar, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a caracterização da resposta inflamatória. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabelecer uma colonização por Pseudomonas. Não se esqueça de que trabalhar com Candida luminescente pode ser extremamente perigoso, e as precauções, como o uso de equipamento de proteção para evitar contaminação por gotículas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.