In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

O objetivo geral do experimento a seguir é observar os efeitos de diferentes patologias de fluxo pulsátil nas células endoteliais. In vitro. Isso é conseguido primeiro tratando quimicamente as lâminas de vidro e revestindo-as com proteínas para garantir a fixação das células durante a exposição ao fluxo.

Como segunda etapa, determina-se o índice de pulsatilidade do fluxo, o que permite a comparação do fluxo in vitro com os valores descritos na literatura. As lâminas sentadas na célula Next são conectadas ao sistema de fluxo para medir a resposta da célula às patologias de fluxo. Os resultados mostram alterações na morfologia e expressão proteica com base em perfis de fluxo usando microscopia óptica e coloração imunofluorescente.

A principal vantagem dessa técnica sobre a bomba peristáltica ou pulsátil é a capacidade de ajustar a pulsatilidade do fluxo para imitar a resposta doente ou saudável. Isso pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da doença arterial. Para começar, coloque novas lâminas de vidro medindo 75 milímetros por 50 milímetros por um milímetro em uma mancha de lâmina de vidro limpa.

Em seguida, adicione uma solução de ácido sulfúrico a 20% suficiente para mergulhar totalmente as lâminas de vidro e incubá-las na solução ácida durante a noite no dia seguinte. Lave as lâminas três vezes, mergulhando-as em água fresca deionizada por cinco minutos de cada vez. Depois de enxaguado, mergulhe as lâminas em acetona por 30 minutos e, em seguida, durante a noite em uma solução de 6% de trixiselina aminopropil trixi em acetona.

Em seguida, enxágue as lâminas três vezes em acetona pura por cinco minutos, trocando a acetona após cada lavagem. Em seguida, lave as lâminas três vezes em água deionizada por cinco minutos, trocando a água deionizada após cada lavagem. Em seguida, mergulhe as lâminas em 1,5% de glutaraldeído e deixe-as submersas por 60 minutos.

Uma vez reticuladas, lave as lâminas duas vezes em água deionizada, trocando a água deionizada Após cada lavagem, coloque as lâminas em etanol a 70% por 30 minutos para esterilizá-las. Retirar o etanol e deixar evaporar os resíduos remanescentes das lâminas. Depois de secos, reidratar as lâminas colocando-as brevemente em água desionizada estéril.

Em seguida, remova o suporte da lâmina e coloque-o em uma placa de Petri quadrada de 100 milímetros por 100 milímetros. Na capela de fluxo laminar, revestir a lâmina funcionalizada com um mililitro de solução de fibronectina de 25 microgramas por mililitro, cobrindo a área aproximada que será exposta à câmara de cultura de células. Em seguida, cubra o prato e incube as lâminas a 37 graus Celsius por uma a duas horas Após a incubação, aspire a solução restante e semeie 600.000 células endoteliais em um mililitro de DMEM com 10% FBS no lado revestido da lâmina.

Cubra a câmara e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 120 minutos. Em seguida, cubra as células com meio adicional e continue a incubá-las até que estejam 70 a 80% confluentes. Conecte o circuito de fluxo conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e, conforme mostrado aqui, certifique-se de que o dampcâmara de amortecimento e o medidor de vazão ultrassônico estão dispostos na direção correta do fluxo.

Em seguida, encha o fluxo, o circuito e o reservatório com água deionizada. Certifique-se de que o tubo de saída do reservatório esteja submerso dentro do volume do reservatório. Em seguida, visualize a forma de onda do fluxo usando um medidor de vazão.

Abra a válvula de liberação de ar no dampcâmara de amortecimento para alterar a relação fluido/volume de ar. Feche a válvula de liberação de ar em diferentes intervalos de nível de fluido e calcule o índice de pulsatilidade. Para calcular o índice, avalie a forma de onda do fluxo, pois o pico representa o máximo da VM.

O vale representa o v min e a média V é a média do registro do sinal. Os valores do índice de pulso em um notebook. Marque o nível de fluido resultante e o índice de pulsatilidade na câmara de amortecimento usando uma caneta de tinta permanente com ponta de feltro para uso futuro.

Determine os níveis de índice de pulsatilidade desejados da literatura de patologia referenciada no protocolo de texto que acompanha enquanto prepara o aquecimento da câmara de fluxo. DMEM suplementado com 1% de FBS em banho-maria a 37 graus Celsius. Retire uma das lâminas revestidas de células da mídia quando estiverem 70 a 80% confluentes e coloque uma junta em cima do lado assentado da célula.

Em seguida, alinhe o canal de vácuo da câmara de fluxo com os orifícios da gaxeta. Em seguida, conecte a tubulação de vácuo às portas de vácuo, garantindo que nenhum fluido vaze para o vácuo. Coloque uma folha de policarbonato embaixo da lâmina de vidro e prenda o conjunto da câmara de fluxo com uma mola clamp em cada um dos lados curtos e duas molas clamps ao longo dos lados longos da câmara de fluxo.

Em seguida, conecte a câmara de fluxo, entrada e saída ao circuito de fluxo. Coloque o sistema de fluxo em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e preencha o circuito com o meio pré-aquecido, enchendo o reservatório com o meio e bombeando-o em baixa pulsatilidade. Mantenha esse fluxo por quatro horas para pré-condicionar as células.

Em seguida, ajuste o volume do fluido na câmara de amortecimento para o nível de índice de pulsatilidade pré-marcado e cultura. As células pela duração desejada. As células endoteliais mostradas aqui foram cultivadas sem fluxo, fluxo constante e fluxo pulsátil.

Alterações na morfologia podem ser observadas desde a morfologia típica das células endoteliais até uma morfologia mais fusiforme após 24 horas de exposição a alto fluxo pulsátil. Enquanto o fluxo estático e constante mostram pouca ou nenhuma diferença na morfologia. As células musculares lisas também são afetadas pela co-cultura com células endoteliais expostas a alto fluxo pulsátil, conforme indicado aqui por diferentes níveis de actina de músculo liso alfa e cadeia pesada de miosina.

Ao longo das diferentes condições de fluxo, as células que foram expostas ao fluxo pulsátil apresentaram as maiores quantidades de ambas as proteínas, o que é indicativo de hipertrofia e contratilidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as vedações e garantir que os níveis de fluido permaneçam constantes após este procedimento. Outros métodos, como co-cultura de células endoteliais e células vasculares, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como interações célula a célula.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar o circuito de fluxo, controlar o índice e expor as células endoteliais ao fluxo pulsátil.