In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

O objetivo geral do experimento a seguir é observar os efeitos de diferentes patologias de fluxo pulsátil sobre células endoteliais in vitro. Isso é alcançado primeiramente por meio do tratamento químico de lâminas de vidro e revestimento com proteína para garantir a adesão celular durante a exposição ao fluxo.

Como segundo passo, determina-se o índice de pulsatividade do fluxo, o que permite a comparação do fluxo in vitro com valores descritos na literatura. Em seguida, lâminas com células aderidas são conectadas ao sistema de fluxo para medir a resposta celular às patologias de fluxo. Os resultados mostram alterações na morfologia e na expressão proteica com base nos perfis de fluxo, utilizando microscopia óptica e coloração por imunofluorescência.

A principal vantagem dessa técnica em relação à bomba peristáltica ou pulsátil é a capacidade de ajustar a pulsatilidade do fluxo para imitar respostas doentes ou saudáveis. Isso pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das doenças arteriais. Para começar, coloque lâminas de vidro novas, medindo 75 milímetros por 50 milímetros por um milímetro, em um recipiente limpo para coloração de lâminas de vidro.

Em seguida, adicione quantidade suficiente de uma solução de ácido sulfúrico a 20% para imergir completamente as lâminas de vidro e incube-as na solução ácida durante a noite no dia seguinte. Lave as lâminas três vezes, imergindo-as em água desionizada fresca por cinco minutos a cada vez. Após a lavagem, imergir as lâminas em acetona por 30 minutos e, em seguida, durante a noite, em uma solução de 6% de trietoxissililpropilamina em acetona.

Em seguida, lave as lâminas três vezes em acetona pura durante cinco minutos, trocando a acetona após cada lavagem. Depois, lave as lâminas três vezes em água desionizada durante cinco minutos, trocando a água desionizada após cada lavagem. Em seguida, imerja as lâminas em glutaraldeído 1,5% e mantenha-as submersas por 60 minutos.

Uma vez reticulados, lave as lâminas duas vezes em água desionizada, trocando a água desionizada após cada lavagem; em seguida, coloque as lâminas em etanol 70% por 30 minutos para esterilizá-las. Remova o etanol e deixe que qualquer resíduo remanescente evapore das lâminas. Após secagem, reidrate as lâminas colocando-as brevemente em água desionizada estéril.

Em seguida, remova o suporte para lâminas e coloque-o em uma placa de Petri quadrada de 100 milímetros por 100 milímetros. Na cabine de fluxo laminar, cubra a lâmina funcionalizada com um mililitro de uma solução de fibronectina a 25 microgramas por mililitro, cobrindo a área aproximada que será exposta à câmara de cultura celular. Em seguida, cubra a placa e incube as lâminas a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Após a incubação, aspire a solução remanescente e plaque 600.000 células endoteliais em um mililitro de DMEM com 10% de FBS sobre o lado revestido da lâmina.

Cubra a câmara e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 120 minutos. Em seguida, cubra as células com meio adicional e continue a incubação até que atinjam de 70 a 80% de confluência. Conecte o circuito de fluxo conforme descrito no protocolo de texto acompanhante e conforme mostrado aqui, garantindo que a câmara de amortecimento e o medidor de fluxo ultrassônico estejam dispostos na direção correta do fluxo.

Em seguida, preencha o fluxo, o circuito e o reservatório com água desionizada. Certifique-se de que o tubo de saída do reservatório esteja submerso dentro do volume do reservatório. Em seguida, visualize a forma de onda do fluxo utilizando um medidor de fluxo.

Abra a válvula de liberação de ar na câmara de amortecimento para alterar a proporção entre o volume de fluido e o de ar. Feche a válvula de liberação de ar em diferentes intervalos de nível de fluido e calcule o índice de pulsatividade. Para calcular o índice, avalie a forma de onda do fluxo, considerando que o pico representa o VM máximo.

O ponto mais baixo representa o v mínimo e a V média é a média do registro do sinal. Os valores do índice de pulsatilidade em um caderno. Marque o nível de fluido resultante e o índice de pulsatilidade na câmara de amortecimento usando uma caneta permanente de ponta de feltro para uso futuro.

Determine os níveis desejados de índice de pulsatilidade a partir da literatura de patologia referenciada no protocolo de texto acompanhante enquanto prepara o pré-aquecimento da câmara de fluxo. DMEM suplementado com 1% de FBS em banho-maria a 37 graus Celsius. Retire um dos lâminas com células cultivadas do meio assim que atingirem 70 a 80% de confluência e coloque uma junta sobre o lado onde as células estão aderidas.

Em seguida, alinhe o canal de vácuo da câmara de fluxo com os orifícios da junta. Depois, conecte a tubulação de vácuo às portas de vácuo, garantindo que não haja vazamento de meio para o vácuo. Coloque uma folha de policarbonato sob a lâmina de vidro e fixe o conjunto da câmara de fluxo com um grampo de mola em cada um dos lados curtos e dois grampos de mola ao longo dos lados longos da câmara de fluxo.

Em seguida, conecte a câmara de fluxo, a entrada e a saída ao circuito de fluxo. Coloque o sistema de fluxo em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e preencha o circuito com o meio pré-aquecido, enchendo o reservatório com o meio e bombeando-o com baixa pulsatilidade. Mantenha esse fluxo por quatro horas para pré-condicionar as células.

Em seguida, ajuste o volume de fluido na câmara de amortecimento até o nível pré-marcado do índice de pulsatividade e cultive as células pelo tempo desejado. As células endoteliais mostradas aqui foram cultivadas sem fluxo, com fluxo contínuo e com fluxo pulsátil.

Alterações na morfologia podem ser observadas, passando da morfologia típica de células endoteliais para uma morfologia mais alongada, após 24 horas de exposição a fluxo pulsátil elevado. Enquanto isso, tanto o fluxo estático quanto o contínuo mostram pouca ou nenhuma diferença na morfologia. As células musculares lisas também são afetadas pelo cultivo em co-cultura com células endoteliais expostas a fluxo pulsátil elevado, conforme indicado aqui por diferentes níveis de actina alfa da músculo liso e cadeia pesada da miosina.

Em todas as condições variáveis de fluxo, as células expostas ao fluxo pulsátil apresentaram as maiores quantidades de ambas as proteínas, o que é indicativo de hipertrofia e contratilidade. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter todas as vedações e garantir que os níveis de fluido permaneçam constantes após o procedimento. Outros métodos, como o co-cultivo de células endoteliais e células vasculares, podem ser realizados para responder a questões adicionais, como as interações entre células.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar o circuito de fluxo, controlar o índice e expor células endoteliais ao fluxo pulsátil.