Perturbação Anti-virulenta de patogênicos biofilmes usando Engineered Quorum para saciar a Lactonases

O objetivo geral deste experimento é demonstrar a eficácia das enzimas de extinção de quórum na ruptura do biofilme bacteriano. Este método ajudará a responder a questões-chave no campo da terapêutica antibacteriana e a ajudar a entender o efeito das lactonases de extinção de quórum em bactérias patogênicas em um ambiente de biofilme. A principal vantagem desta técnica é que as lactonases de têmpera de quorum podem ser adicionadas diretamente em um ambiente in vitro.

Assim, seu efeito na ruptura do biofilme é facilmente quantificado. Demonstrando este procedimento está Terrence Tay, um técnico em nosso laboratório. Para começar, cultive uma cultura de 5 mililitros de A.baumannii S1 em LB a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada por 16 horas.

Ajuste a cultura para um OD 600 de 0,8. Em seguida, use LB fresco contendo 4 miligramas por mililitro de enzima GKL purificada para diluir a cultura de um a 100. E adicione 100 microlitros aos poços de uma placa de 96 poços.

Use as tampas para cobrir os pratos e coloque-os em um recipiente de plástico de 10 litros. Feche o recipiente e incube a 30 graus Celsius por três horas, antes de remover suavemente o meio. Adicione mais 100 microlitros de meio LB fresco aos poços e incube a placa a 30 graus Celsius por 21 horas.

Depois de remover suavemente o meio, use 200 microlitros de água estéril para lavar suavemente as células bacterianas planctônicas. Posicione a ponta da pipeta no fundo do poço e remova cuidadosamente o meio líquido para garantir o mínimo de perturbações no biofilme estranho entre a interface ar e líquido. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução violeta a 1% de cristal a cada poço e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Remova a solução de cristal violeta usando 200 microlitros de água estéril para lavar os poços três vezes. Adicione 100 microlitros de ácido acético a 33% em cada poço e incube com agitação suave por 15 minutos para dissolver o corante. Quantificar a quantidade de biofilme medindo a absorbância do cristal violeta a 600 nanômetros.

A quantidade de cristal violeta é proporcional à quantidade de biofilme formado. Para realizar microscopia confocal de varredura a laser, ou CLSM, de biofilmes de A.baumannii S1, cultive uma cultura de cinco mililitros de A.baumannii S1 em LB a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada por 16 horas. Ajustar a cultura de A.baumannii S1 a uma OD 600 de 0,8.

Em seguida, use LB fresco contendo 1,2 miligramas por mililitro de enzima GKL purificada para diluir a cultura, um a 100, e adicione um mililitro a uma microplaca com fundo de vidro de 35 mililitros. Cubra o microprato com uma tampa e coloque-o em um recipiente de plástico de 10 litros e feche-o antes de incubar o prato a 30 graus Celsius por três horas. Depois de remover suavemente o meio, adicione um mililtro de meio fresco contendo 30 microlitros de enzima GKL purificada e incube a 30 graus Celsius por mais 21 horas.

Remova suavemente o meio uma segunda vez e substitua por outro mililitro da enzima GKL em meio fresco. Incube 30 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, remova suavemente o meio e adicione 500 microlitros de cinco microgramas por mililitro de aglutinina de gérmen de trigo conjugado Alexa Fluor 488 dissolvido em HBSS.

Incube a microplaca a 37 graus Celsius por 30 minutos para manchar os biofilmes. Para fixar os biofilmes, adicione 500 microlitros de formaldeído a 3,7% dissolvido em HBSS e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Use dois mililitros de HBSS para lavar o microprato uma vez e, em seguida, remova a solução completamente.

Armazene o prato no escuro a quatro graus Celsius antes da imagem CLSM. Para imagens e análises CLSM, use uma objetiva de 63X para gerar 97 pilhas por imagem com um intervalo de 0,21 mícrons por pilha. No experimento de quantificação de violeta de cristal, GKL do tipo selvagem e uma enzima de extinção de quorum de dupla mutação GKL aprimorada foram usadas para a atividade da lactonase contra três hidroxidecanoil l homoserina lactona ou 3OHC10HSL, a principal molécula de quorum usada por A.baumanii S1.As mostrada aqui, ambas as enzimas foram capazes de reduzir significativamente a formação de biofilmes em A.baumanii S1 do tipo selvagem pré-tratado. A extensão da ruptura dos biofilmes por ambas as enzimas não é proporcional à sua eficácia contra 3OHC10HSL.

Como visto nesta tabela, a taxa de rotatividade do GKL mutante é seis vezes mais rápida do que o GKL do tipo selvagem contra 3OHC10HSL. No entanto, a diferença na extensão da ruptura dos biofilmes entre as enzimas é de apenas duas. Neste experimento, a enzima mutante GKL aprimorada e sua enzima catecolicamente inativa foram usadas para comparação.

Esta imagem DIC mostra que o tratamento com a enzima mutante GKL melhorada resultou em uma diminuição no tamanho do biofilme em comparação com a enzima inativa. A análise das imagens de fluorescência também revelou que houve redução na área superficial, biomassa e espessura média dos biofilmes, quando tratados com a enzima mutante GKL melhorada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas, excluindo o tempo de incubação, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a remoção e a ruptura do biofilme durante as etapas de lavagem. Após este procedimento, outros métodos, como contagem de células e ensaios de estabilidade enzimática, podem ser realizados. Isso responderá a perguntas adicionais, como os efeitos das lactonases de extinção de quorum na população de células dentro do biofilme, bem como sua duração de ação.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do tratamento de doenças infecciosas explorarem os efeitos de potenciais lactonases de extinção de quórum no biofilme produzido por bactérias patogênicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como quantificar a ruptura do biofilme por coloração com cristal violeta e avaliar as alterações morfológicas no biofilme por imagens confocais. Não se esqueça de que trabalhar com material patogênico pode ser extremamente perigoso.

Precauções, como o uso de instalações adequadas de contenção de risco biológico, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.