Name: Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprenda a usar sacos intestinais ex vivo para avaliar a permeabilidade da mucosa em modelos de doenças gastrointestinais. Este método permite estudar a integridade da barreira epitelial e a camada de muco em sítios específicos do trato digestivo.

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Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 e uma bolsa do Hunter Medical Research Institute patrocinada pela Sparke Helmore/NBN Triathlon e pelo Espólio do falecido Leslie Kenneth McFarlane.

Todo o trabalho de animais neste protocolo é realizada com a estrita observância Universidade do Comitê de Ética Newcastle animal procedimentos aprovados. 1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e pratos <ol><li> Pré-quente Mídia 199 (TC199) ou de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) media a 37 ° C. Pré-oxigenar o meio por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2. Verificar que a forma tem um pH final de 7,3. </li><li> Prepare sutura cortando duas seções 5 cm para cada saída. Laço as suturas em um nó não fechada. </li></ol> 2. Dissecção e Preparação do Trato Gastrointestinal <ol><li> Retirar o alimento contínuo de 12 horas antes da eutanásia. Se desejado, colocar os animais sobre gel de suplementos de nutrientes durante este tempo. </li><li> Eutanásia ratos por dose excessiva de pentobarbitona de sódio ([200 mg / kg], injecção intraperitoneal), seguida por deslocação cervical, de acordo com o proto de Ética Institucionalcols e pulverizar 70% de etanol para o abdômen e tórax. </li><li> Utilizando uma tesoura, fazer uma incisão horizontal no meio do abdómen e expor o peritoneu. </li><li> Avance para separar e remover o tracto gastrointestinal através da redução do intestino delgado superior a partir do estômago para o esfíncter pilórico e cortar o intestino grosso na margem anal. Use uma pinça para remover suavemente o mesentério. Colocar o tracto intestinal de pré-aquecido, o meio oxigenado. </li><li> Identificar a secção de intestino de ser avaliada para a permeabilidade (Figura 1) e cortado desta secção livre do resto do tracto intestinal. <ol><li> A fim de manter a consistência entre os animais, medir secções do duodeno e jejuno em relação ao estômago, e medir secções de cólon e íleo em relação ao ceco. </li><li> Ao selecionar segmentos de tecido, observe a presença de tecidos linfóides associados a mucosas, tais como placas de Peyer. Estes podem ser identificados como pequeno acenoULES no lado da serosa do lúmen. </li><li> Usando uma seringa de 1 mL, gentilmente liberar o conteúdo luminal do segmento intestinal para uma placa de Petri com PBS pré-aquecido (37 ° C). Estes conteúdos fecais pode ser descartada ou armazenada a -80 ° C para análise futura conforme desejado. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de intestinal Sacos <ol><li> Prepara-se uma seringa de 1 mL com um volume de 300 uL do composto de teste ou molécula. Para a integridade da mucosa, uma solução de 1 mg / ml de FITC-Dextrano P.M. 4400 pode ser usado. As sondas que variam de 4,400-70,000 Da em tamanho pode ser usado para aumentar a sensibilidade. Firmemente encaixar um cateter animais vascular pequena na seringa. </li><li> Medida 5 cm da abertura do segmento intestinal e amarrar o segmento de bem fechada com uma sutura em malha neste momento. Delicadamente, coloque um fio de sutura em circuito pré-amarrado ao redor da abertura do intestino e inserir o cateter embotada. Puxar o laço fechado, de modo a garantir o segmento intestinale libertar o volume de 300 uL a partir da seringa para dentro do intestino, assegurando que toda a solução é injectada. </li><li> Remova cuidadosamente o cateter enquanto puxando simultaneamente o laço de sutura para garantir o fechamento do saco intestinal. Cortar o saco intestinal solto a partir do intestino e colocar num tubo cónico de 50 ml cheio com 20 ml de meio oxigenado, pré-aquecido a 37 a ° C. </li></ol> 4. Medição da permeabilidade <ol><li> Colocar os tubos cónicos contendo os sacos intestinais num banho de água aquecida para 37 definir ° C. Aos 0, 30, 60, 90 e 120 min pontos de tempo, tomar uma amostra de 100 ul a partir do tubo cónico e transferência para uma placa de 96 poços, substituindo o volume com 100 ul de meio fresco em cada exemplo. </li><li> Depois de a amostra final é tomada, cortar sacos abertos no ponto de sutura e para baixo do comprimento do segmento, expondo a superfície da mucosa. </li><li> Medir o comprimento e a largura de cada segmento intestinal. Se desivermelho, pressão congelar os segmentos e armazenar a -80 ° C para a proteína ou análise bioquímica, ou alternativamente, loja em solução estabilizadora de RNA para ensaios moleculares. </li><li> Preparar uma curva padrão de diluições log para moléculas de FITC-tag que variam de 1 a 1 x 10 -6. </li><li> medir amostras e padrões para FITC em um leitor de placas fluorescentes, FITC excitação / emissão: 495 nm / 519 nm. </li></ol> 5. Cálculo da permeabilidade aparente para cada indivíduo Intestinal Sac <ol><li> Converter unidades de tempo para seg. </li><li> Para cada ponto de tempo, calcular a concentração cumulativa, Q Q t = (C t * V r) + (Q t soma * V s), onde: Q t = concentração cumulativa no tempo t C t = concentração no tempo t V r = Volume no lado receptor Q t sum = Soma de Q tudo t anterior V = svolume amostrado </li><li> Lote Q em função do tempo (t) e calcular o declive: δQ / dt </li><li> Calcule a permeabilidade aparente (app P) P app = (δQ / AT) / (A * Co), onde: A = Área de tecido 0 C = concentração inicial </li></ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
<li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB%2FDbpA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
<li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor%3A+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, nós detalhou o isolamento e preparação de sacos intestinais para avaliar a função barreira da mucosa ex vivo. sac preparações intestinais têm sido principalmente utilizados em investigação farmacêutica, examinando a absorção de medicamentos candidatos em todo o intestino. No entanto, este ensaio é igualmente adequado para o estudo da doença intestinal. permeabilidade intestinal podem variar muito por região e local de avaliação específica da permeabilidade permite uma melhor compreensão da importância reg...

A barreira epitelial intestinal do tracto gastrointestinal é uma área de superfície de mucosa estimado em cerca de 400 m 2 no adulto humano. Consequentemente, é constantemente expostos a desafiar de micróbios, drogas ingeridas, nutrientes e toxinas bacterianas. O hospedeiro deve não só distinguir entre bactérias comensais toleráveis ​​e os potenciais agentes patogénicos, mas deve evitar que estas espécies e as suas moléculas segregadas a partir de atravessar a barreira epitelial, enquanto, ao mesmo tempo que permite a absorção de nutrientes. Assim, o papel do epitélio intestinal é actuar como uma barreira selectiva para o conteúdo luminal 1. Isto é conseguido, em parte, pelo sistema de defesa inata epiteliais na mucosa, que actua através de um sistema biológico responsivo que consiste em mecanismos constitutivos e indutíveis 2. A perda da função de barreira epitelial é uma patologia que é característico de um número de doenças gastrointestinais. In vivoexame da função de barreira epitelial podem ser avaliados através de gavagem oral de uma molécula de marcador e a análise subsequente de soro 3. No entanto, esta técnica não oferece nenhuma indicação quanto ao local da disfunção da barreira. In vitro e avaliação ex vivo da resistência transepitelial usando sistemas Transwell 3 e câmaras de Ussing 4,5, respectivamente, são comumente utilizados como marcadores substitutos da função barreira epitelial, mas falta a fisiologia da doença contribuindo de modelos animais 6. Neste protocolo, descrevem um modelo de preparação de tecido ex vivo que permite a avaliação directa e localizada de integridade intestinal e que pode ser utilizada para avaliar a função de barreira da mucosa a um número de níveis. Mais importante, esta técnica pode ser aplicada aos modelos animais de doença, ou podem ser manipulados para permitir farmacologicamente interrogação em profundidade de uma disfunção da barreira da mucosa.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&nbsp; Sutura de seda não absorvível</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>Sem vermelho de fenol, pois isso interfere na fluorescência</td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td> <td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>Sem vermelho de fenol, pois isso interfere na fluorescência</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Use a 10 mM em meios</td></tr><tr><td>Cateter vascular de pequenos animais: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4.400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo intestinal sacs para avaliar mucosa permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

A barreira epitelial é a primeira defesa inata do tracto gastrointestinal e regula selectivamente o transporte a partir do lúmen para os compartimentos dos tecidos subjacentes, restringir o transporte de moléculas pequenas através do epitélio e quase completamente proibindo transporte macromolecular epitelial. Esta selectividade é determinada pela camada de gel mucosa, o que limita o transporte de moléculas lipofílicas e ambos os receptores apicais e complexos de proteína de junções apertadas do epitélio. Modelos in vitro de cultura de células de epitélio são convenientes, mas como um modelo, falta-lhes a complexidade das interacções entre a microbiota, muco-gel, epitélio e sistema imunológico. Por outro lado, a avaliação in vivo da absorção intestinal ou da permeabilidade pode ser realizada, mas estes ensaios medem a absorção gastrointestinal, em geral, sem qualquer indicação de especificidade local. Ex vivo ensaios de permeabilidade intestinal usando &quot;sacos&quot;; são um método rápido e sensível de medir tanto a integridade intestinal global comparativa ou transporte de uma molécula específica, com a vantagem adicional de especificidade local intestinal. Aqui descreve-se a preparação de sacos para os estudos de permeabilidade intestinal e o cálculo da permeabilidade aparente (P app) de uma molécula através da barreira intestinal. Esta técnica pode ser usada como um método de avaliar a absorção do fármaco, ou para analisar a disfunção da barreira epitelial regional nos modelos animais de doenças gastrointestinais.

Este protocolo pode ser usado para examinar as mudanças regionais na função de barreira intestinal em modelos animais da doença gastrointestinal. Através da medição do fluxo de uma sonda paracelular através da superfície da mucosa em zonas diferentes do tracto gastrointestinal 7, a integridade das junções apertadas epiteliais pode ser avaliada. Além disso, fazendo variar a natureza da sonda paracelular por tamanho (Figura 2) ou a hidrofobicidade (Figur...

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a integridade intestinal localizada em modelos animais de doenças gastrointestinais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre doenças gastrointestinais, como se a integridade da mucosa está comprometida ou se há um aumento na captação de uma molécula específica ou de bactérias durante a doença. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para avaliar áreas específicas do trato gastrointestinal. Para preparar o trato gastrointestinal, comece borrifando o abdômen e o tórax do camundongo com etanol a 70 por cento e use uma tesoura para fazer uma incisão horizontal no meio do abdômen, expondo o peritônio. Em seguida, corte o intestino delgado superior no esfíncter pilórico, junto ao estômago, e o intestino grosso na borda anal. Use então uma pinça para remover suavemente o mesentério e coloque o trato intestinal em meio pré-aquecido e oxigenado. Identifique a região a ser avaliada quanto à permeabilidade, medindo os segmentos do duodeno e jejuno em relação ao estômago, e os segmentos do cólon e íleo em relação ao ceco, a fim de manter a consistência entre os animais experimentais. Observe a presença de tecidos linfoides associados à mucosa, como as placas de Peyer, que podem ser identificadas como pequenos nódulos no lado seroso da luz intestinal. Em seguida, corte o segmento selecionado e use uma seringa de 1 ml para lavar suavemente o conteúdo luminal do segmento em uma placa de Petri contendo 37

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Medicina

Os tratamentos actuais de doenças inflamatórias do intestino (IBD) destinam-se a atenuar os sintomas da doença, mas pode causar efeitos laterais graves. Assim, estratégias alternativas estão a ser investigados em modelos de colite em animais. Aqui, vamos explicar como os efeitos benéficos da dieta suplementos em sinais clínicos IBD são analisados ​​de tal modelo de colite.

Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

O acesso de nutrientes, metabólitos da microbiota e medicamentos para a circulação é controlado pela barreira sangue-intestino (GBB). Nós descrevemos um método direto para medir a GBB permeabilidade na vivo, que, em contraste com comumente usados métodos indirectos, praticamente não é afetado pelas funções de fígado e rim.

Um método In Vivo para avaliar a barreira de sangue do intestino e metabolismo hepático da Microbiota produtos

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

O presente protocolo descreve um método que utiliza o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out para determinar a permeabilidade intestinal. Este método pode ser usado para determinar a permeabilidade paracelular em enteróides que modelam doenças inflamatórias intestinais, como enterocolite necrosante.

Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Este protocolo descreve uma plataforma de triagem usando mucosas do tecido epitelial bucal suíno recém-isoladas para avaliar a permeação peptídica. O método integra a permeação de um GLP-1RA na presença de um intensificador de permeação proveniente de soluções, câmaras Hilltop, filmes em Células de Difusão Franz e insertos impressos em 3D, acompanhados por avaliação histológica da mucosa.

Um Modelo Padronizado Ex Vivo de Oromucosas Suínas para Avaliação de Fluxos de Peptídeos

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

Aprenda a usar sacos intestinais ex vivo para avaliar a permeabilidade da mucosa em modelos de doenças gastrointestinais. Este método permite estudar a integridade da barreira epitelial e a camada de muco em sítios específicos do trato digestivo.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

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