Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent

O objetivo geral deste protocolo é produzir agregados uniformes de células-tronco embrionárias de camundongo que passem por auto-organização e alongamento axial em cultura de suspensão. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como o papel das interações teciduais na especificação de eixos e na auto-organização em processos como a gastrulação. A principal vantagem desta técnica é que ela permite estudar eventos de desenvolvimento a partir de uma nova perspectiva desconstrutiva, fora do embrião, antes da agregação.

Mantenha células embrionárias de camundongo ou M MECs no meio ES.Lift em frascos de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados revestidos com gelatina para a geração de agregados. Inicie com o frasco de cultura de tecidos contendo células com 40 a 60% de confluência, aspire o meio e lave o frasco duas vezes. Com PBS, adicione um mililitro de tripsina 0,25% EDTA e incube a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos para destacar as células do frasco.

Em seguida, adicione cinco mililitros de meio Es.Lift à suspensão celular destacada e misture completamente. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e retire uma alíquota de um mililitro para contagem das células. Adicione cinco vezes 10 à quarta células a cinco mililitros de PBS quente e centrifugue as células a 170 × g durante cinco minutos.

Aspire a solução sem perturbar o pellet. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS suavemente e repita a centrifugação. Aspire o volume máximo sem perturbar o pellet celular.

Para evitar arraste de PBS, re-suspenda o pellet celular em um mililitro de meio N2B27 aquecido, misturando bem com uma pipeta P1000 para gerar uma suspensão celular homogênea.

Em seguida, dilua com mais quatro mililitros de meio N2B27. Transfira a suspensão celular para um reservatório estéril utilizando uma pipeta multicanal. Misture bem as células e transfira 40 microlitros da suspensão celular do reservatório para cada poço em uma placa ubo não tratada para cultura de tecidos.

Placa de 96 poços. Uma placa não destinada a cultura de tecidos é especificamente utilizada para minimizar a aderência das células à placa. Incubar a placa em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas para permitir a agregação celular após 48 horas.

Retire a placa do incubador e observe as células em um microscópio invertido, confirmando a presença de agregados. Adicione um volume da solução estoque de CHI 99021 a 10 milimolar ao N2B27 aquecido para obter uma concentração final de três micromolar. Este é um meio secundário para estimulação celular.

Usando uma pipeta multicanal, distribua 150 microlitros do meio secundário para cada poço. Com força suficiente para desprender quaisquer agregados aderentes. Retorne a placa ao incubador de cultura celular por 24 horas após a incubação.

Remova cuidadosamente o meio sem aspirar o agregado celular. Adicione 150 microlitros de N2 B27 fresco a cada poço com força suficiente para desprender quaisquer agregados aderentes. Repita este procedimento a cada 24 horas por um período total de incubação de aproximadamente cinco dias.

Para preparar agregados para fixação, primeiro aspire suavemente a solução de incubação de cada poço mantendo a pipeta em um ângulo de 30 graus. Para evitar aspirar o agregado celular, adicione 150 microlitros de PBS a cada poço. Aguarde alguns minutos para que o agregado se sedimente no fundo e, em seguida, aspire o PBS.

Repita este passo de lavagem mais duas vezes usando tesouras estéreis. Corte a ponteira de uma pipeta P1000 aproximadamente três milímetros acima de sua extremidade de dispensação. Com esta ponteira, aspire e libere um pequeno volume de líquido em um poço.

Para agitar o agregado e soltá-lo do fundo do poço. Em seguida, aspire o agregado para a ponta e transfira-o para uma placa de dissecação de drosófila. Usando o mesmo procedimento, colete todos os agregados que passarão por procedimentos idênticos de imunomarcação em uma única placa de dissecação.

Coloque a placa de dissecação sob o microscópio e gire-a suavemente para mover os agregados em direção ao centro. Em seguida, aspire cuidadosamente o PPS da borda da placa, tomando o cuidado de não remover nenhum agregado.

Para fixar os agregados, adicione um mililitro de solução de formaldeído 4% recém-preparada e incube as placas em um agitador orbital por duas horas a quatro graus Celsius. Ajuste em baixa velocidade. Aspire cuidadosamente a solução de formaldeído para evitar a sucção de quaisquer agregados e, em seguida, adicione um mililitro de PBS ao poço.

Retorne a placa ao agitador orbital por 10 minutos. Remova o PBS do poço e repita esta etapa de lavagem mais duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro da solução P-B-S-F-T e coloque a placa no agitador orbital por 10 minutos.

Aspire a solução e repita a lavagem mais duas vezes. Adicione um mililitro de P-B-S-F-T por poço para bloquear os agregados contra imunorreatividade inespecífica. Coloque a placa no agitador orbital em velocidade baixa por uma hora a quatro graus Celsius.

Após a incubação, aspire cuidadosamente a solução bloqueadora dos poços e adicione 500 microlitros do anticorpo primário diluído em P-B-S-F-T. Sobreponha a placa com parafilm para prevenir evaporação e incube durante a noite a quatro graus Celsius em agitador orbital em baixa velocidade. Em seguida, substitua a solução de anticorpo primário por P-B-S-F-T pré-resfriado.

Lave os agregados colocando a placa no agitador orbital. Ajuste para baixa velocidade a quatro graus Celsius por cinco minutos. Repita a lavagem mais uma vez.

Realize dois ciclos adicionais de lavagem com P-B-S-F-T a quatro graus Celsius em velocidade baixa no agitador orbital. Conforme indicado no protocolo textual, remova a solução de lavagem e incube com 500 microlitros de anticorpo secundário diluído em P-B-S-F-T. Adicione um micrograma por mililitro de herst para visualizar os núcleos e incube durante a noite a quatro graus Celsius em rotor giratório, protegido da luz.

Realize outro ciclo de lavagem com PBS FT a quatro graus Celsius, protegido da luz em uma caixa envolta com papel alumínio. Realize lavagens adicionais com PBS contendo 0,2% de FBS e 0,2% de Triton X-100 ou tampão PBT à temperatura ambiente. Após aspirar cuidadosamente a solução, incube os agregados com um mililitro de uma mistura de glicerol e PBT na proporção um para um durante 30 minutos no escuro e à temperatura ambiente.

Em seguida, incube-os com um mililitro de glicerol sete para três em PBT durante 30 minutos. Para preparar as amostras para a imagem confocal, aspire a solução de glicerol em PBT e substitua por um mililitro de meio de montagem. Em seguida, monte os agregados em gotas de 17 microlitros sobre uma lâmina de vidro.

Usando a ponta de uma pipeta, prepare um espaçador dobrando uma tira de fita adesiva dupla face quatro vezes sobre si mesma. Em seguida, coloque um espaçador em cada lado dos agregados sobre a lâmina, inverta a lamínula, deslize sobre os espaçadores e, então, visualize os agregados utilizando microscopia confocal. 48 horas após o plaqueamento, formam-se agregados com diâmetro de cerca de 150 micrômetros, exibindo bordas suaves.

Por outro lado, uma qualidade inadequada do meio, o plaqueamento com número não ideal de células ou a aderência celular insuficiente podem resultar em falha na agregação adequada. O tratamento contínuo por 120 horas com CHI 9 9 0 2 1, um inibidor da glicogênio sintase quinase três, faz com que o agregado esférico se torne alongado. Além disso, observa-se uma localização distinta de células positivas para SOX GFP em uma das extremidades do agregado após o tratamento; diferentes tratamentos geram diferentes alterações na morfologia de um único agregado e na marcação fluorescente.

A localização dentro do agregado pode ser monitorada ao longo do tempo. Após dominar a técnica, o pesquisador será capaz de gerar agregados em cerca de 45 minutos, se o procedimento for realizado corretamente. Uma vez formados os agregados, outros métodos, como Q-R-T-P-C-R, podem ser realizados em vez da imunomarcação para investigar alterações na expressão gênica dentro dos agregados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como formar agregados a partir de CEMs, aplicar estímulos específicos e preparar os agregados para análise por imunomarcação e microscopia confocal.