Name: Microbiologicamente induzida Calcita Precipitation Mediada por Sporosarcina pasteurii (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a induzir precipitação de calcita microbiológica usando Sporosarcina pasteurii. Este protocolo padronizado demonstra cultivo, enriquecimento bacteriano e caracterização por microscopia óptica e eletrônica para aumentar a resistência compressiva de materiais.

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Gostaríamos de agradecer aos parceiros da Iniciativa Helmholtz-Alberta, da Associação Helmholtz e da Universidade de Alberta, pelo apoio resultante da participação nesta colaboração. O financiamento da pesquisa é fornecido pelo Fundo de Iniciativa e Rede da Associação Helmholtz, pelos Centros Helmholtz participantes e pelo Governo de Alberta por meio do programa ecoTrust da Alberta Environment.
A Dra. Tanushree Ghosh é grata por suas contribuições críticas em vários estágios cruciais.

NOTA: Execute os protocolos experimentais na ordem descrita abaixo. O protocolo de cultura bacteriana é discutido na Seção 1 (ver também Figura 1). Secção 2 descreve o protocolo para o enriquecimento do meio de cultura utilizando aditivos externos. Seção 3 descreve os protocolos de microscopia multi-modo. Os pesos de todos os componentes individuais podem ser medida utilizando uma balança analítica. O volume de cada solução pode ser medida utilizando um cilindro volumétrico. NOTA: Os protocolos de biossegurança adequadas devem ser seguidas para Seções 1 - 2. Consulte o escritório de segurança institucional para obter detalhes. 1. Cultura Bacteriana <ol><li> Cultura das bactérias - plac Médio Preparação <ol><li> Montar equipamento e ingredientes, tais como placas de Petri, frasco, de base Tris, HCl, agar, água Millipore, pH-metro etc.Sterilize todos os recipientes em autoclave a 121 ° C antes da utilização. </li><li> Prepare 1 L de 0,1solução aquosa 3 M de Tris-tampão por mistura de 15,75 g de base Tris com 1 L de água Millipore. Para diminuir o nível da solução original (pH 10,4) pH adicionar 2,800 mL de HCl (concentração 50%). Verificar continuamente por meio de um medidor de pH para ajustar o pH = 9. </li><li> Dividir a solução tampão de 1 L em duas partes como se segue: <ol><li> Tome 800 ml desta solução. Divide-se igualmente em duas partes de 400 ml cada. Dissolve-se 8 g de (NH 4) 2 SO 4 a uma solução a 16 g de extracto de levedura para a outra solução. </li><li> Aqui os restantes (200 ml de) solução e dividi-lo outra vez em duas partes de 100 ml cada. Misturar 2 g de (NH 4) 2 SO 4 a uma. Adicionar 4 g de extracto de levedura e 4 g de agar para o outro. </li></ol></li><li> Autoclave as 4 soluções separadamente após o acondicionamento dos respectivos frascos na folha de Al e aderindo fitas de autoclave. NOTA: Se uma unidade de bancada autoclave é utilizado, o volume deve ser ajustado para 500 ml (temperatura e pressão automáticocamente especificado como uma função do volume). </li><li> Depois de levá-los para fora da autoclave, defina as duas soluções de 400 ml de lado para a etapa 1.3.1 (abaixo). Misturar as duas soluções de 100 ml de ter uma solução de 200 ml. Despeje a mistura em 10 - 12 placas de Petri. </li></ol></li><li> Cultura das bactérias - a plac Preparação de amostras <ol><li> Remova o estoque bacteriana do congelador (-80 ° C) e deixe-o descongelar. Depois de descongelar corretamente, coloque o estoque de bactérias ea placa de agar dentro de uma capa de biossegurança. </li><li> Seleccione a micropipeta de menor dimensão disponível (0,5-10 ul é uma boa escolha) para infestar a ponta com o estoque pasteurii Sporosarcina. Streak uma placa de agar com a ponta da micropipeta. Colocar a placa de agar estrias dentro de uma incubadora sem agitação a 31 ° C durante 48 h. </li><li> Após 48 horas, retire a placa da incubadora e examinar visualmente a existência de colónias individuais. Se não houver colónias individuais, em seguida, coloque-o em tele incubadora por mais 24 horas. </li><li> Repita o processo até que sejam detectadas colónias individuais. Não exceder 7 dias de julgamento. NOTA: Se colónias individuais não aparecem mesmo depois de uma semana, então concluiu-se que os passos não têm sido seguido de forma adequada e todo o processo deve ser repetido a partir do passo 1. </li></ol></li><li> Cultura das bactérias - Amostra final de preparação <ol><li> Misturar as duas soluções de 400 ml (tampão de Tris + (NH 4) 2 SO 4 e tampão Tris + extracto de levedura (1.5.1) em conjunto para obter uma solução de 800 ml. Transferir 125 ml desta solução para um balão. </li><li> Realizar um exame visual da superfície da placa de agar para identificar regiões com elevada concentração de colónias individuais. Gentilmente cutucar e quebrar uma das colônias com uma ponta de micropipeta. </li><li> Mergulhar o mesmo ponta da micropipeta para o balão de 125 ml e agita-se cuidadosamente para garantir que esse número suficiente de células para multiplicação robusta ser transferido. Colocar o balão numa incubadora com agitação a 150 rpm, 30 ° C durante 2 - 3 dias. Após 2 - 3 dias, retirar o balão da incubadora. </li></ol></li><li> Cultura das bactérias - Contagem de Células final <ol><li> Efectuar diluições em série da solução de cultura não diluídos utilizando PBS para atingir uma diluição de pelo menos dez milhões (10 -7) para assegurar colónias individuais aparecem contáveis. Desenhe sete linhas equidistantes paralelas sobre uma das ágar-placas. <ol><li> Para fazer isso, o desenho de linhas em negrito na superfície inferior da placa de Petri, proeminente suficiente para ser visível a partir de cima. Gota 3 pequenas gotas de solução não diluída em um segmento. Adicionar 1 ml de solução não diluída a 9 ml de tampão fosfato salino (PBS) para obter uma diluição de 1:10. </li></ol></li><li> Aqui uma pequena alíquota (~ 0,1 ml) desta solução recém diluiu-se com uma pipeta e soltar mais 3 gotas pequenas no próximo segmento. Transferir a solução recentemente diluído para um novo frasco e em seguida diluído dez vezes (10 x) deadicionando PBS. Isto reduz a diluição a 10 -2 ou 1: 100. <ol><li> Utilizar esta solução a 1: 100 no próximo segmento. Repita este processo com ele pequenos volumes de soluções recém-diluídas sucessivamente transferi-los para novos frascos e continuamente diluição de dez vezes (10x) em conjunto com PBS para obter mais e mais amostras diluídas de 10 -3 ou 1: 1000 todo o caminho até 10 ~ 7 ou 1:10 milhões no último segmento. </li></ol></li><li> Realizar Colony-Forming contagem de unidades (CFU) placa para contar o número de células presentes na placa de agar após incubação da placa durante 1 - 2 dias a 31 ° C. Isto dá uma medida quantitativa da contagem de bactérias na amostra não diluída. NOTA: O valor de CFU é medida com base na capacidade do sistema para dar origem a colónias de acordo com as condições específicas de meio nutriente, temperatura e tempo, assumindo que cada colónia é separada e fundada por uma única célula microbiana viável. </li><li> Focaas placas de Petri com auto-vedante de filme e armazenar os itens restantes no frigorífico para uso futuro. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo para o enriquecimento de nutrientes para acelerar Precipitation <ol><li> Transferência 9 ml de líquido de cultura preparado (células + meio) em vários tubos de centrífuga esterilizados, cada um de 10 ml de volume. </li><li> Prepara-se uma solução de 100 ml de caldo de enriquecimento externa que consiste em quatro componentes nas seguintes concentrações em meio fresco: Ureia: 2 g / L, cloreto de amónio: 1 g / L, bicarbonato de sódio: 212 mg / L, cloreto de cálcio: 280 mg /EU. Meça cuidadosamente todos os ingredientes em uma balança analítica e misturar tudo, mas ureia com meio fresco num copo e coloque em autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min). <ol><li> Após autoclave, misturar a quantidade necessária de ureia (2 mg) com 1 ml de meio fresco e passar através de uma seringa equipada com um filtro de seringa de 0,22? M para completar o processo de enriquecimento. </li><li> Adicione 1ml deste meio de enriquecimento com aditivos para os tubos de centrífuga esterilizados contendo 9 ml de líquido de cultura preparado (células + meio) (ver passo 2.1). NOTA: De todos estes componentes, ureia sendo degradáveis, a temperaturas elevadas, não pode ser esterilizado em autoclave. Assim, após os outros componentes foram autoclavados (121 ° C, 15 psi, 15 min), a ureia é adicionada em último lugar através de um filtro de seringa de 0,22? M. </li></ol></li><li> Vortex cada tubo, cuidadosamente, com um agitador mecânico. Colocar os líquidos enriquecidos (células + aditivos + médias) numa incubadora sem agitação a 30 ° C. Monitorar todas as unidades regularmente para o início da precipitação. Usando um microscópio de luz, uma vez que começam as observações microscópicas início da precipitação é detectada a olho nu. Isto é, geralmente, entre 30 - 36 h após o início das experiências. </li></ol> 3. Protocolo para Multi-Modo de Microscopia <ol><li> Transferir um pequeno volume (~ 1 ml) de fluido para uma alta Magnífication sistema lamela microscopia de câmaras para realizar observações iniciais com o modo de campo claro. Para começar, iniciar todas as observações com o menor aumento (4X). que proporciona uma ampla área de cobertura e, por conseguinte, informação sobre a distribuição mundial de precipitados. </li><li> Selecione áreas específicas com volumes significativos de precipitação e zoom (20x, 40x, 60x), aumentando progressivamente a ampliação. NOTA: Uma vez que é impossível resolver adequadamente as células da substância polimérica extracelular (EPS) sob de campo brilhante (devido a índices de refração muito próximos), ligar o modo de contraste de fase, sempre que necessário. Neste modo, apenas os contornos das membranas celulares (sendo uma fase diferente da de células grandes quantidades) são visíveis, permitindo, assim, a diferenciação visual. </li><li> Finalmente, manchar algumas câmaras com mancha Live / Morto que tinge seletivamente os componentes vivos como verde, enquanto colorindo os componentes mortos em vermelho. Referem-se a protocolos padrão 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Ligue o modo fluorescente para distinguir adequadamente entre as regiões vermelhas e verdes. Red (cubo de filtro vermelho com Excitação comprimento de onda de 540-580 nm, espelho dicróico de 595 nm e Barreira filtro de 600-660 nm) e (-pass longo GFP Verde cubo de filtro verde com Excitação comprimento de onda de 440-480 nm, espelho dicróico de 505 filtro nm e Barreira de 510 cubos nm) de filtro são usados ​​para facilitar micrografias fluorescentes. </li><li> Uma vez que todos os dados multi-modo foram recolhidas, selecionar as melhores imagens e sobreposição manualmente (brightfield indivíduo, de contraste de fase e imagens fluorescentes) para obter o melhor contraste e nitidez possível. </li><li> Realizar SEM nas amostras sólidas secas compreender estruturas cristalinas. Este é um procedimento bem estabelecido e padrão. 22 Realizar XPS para identificar assinaturas químicas dos grupos funcionais (carbonatos). Este é um procedimento bem estabelecido e padrão também. 23 </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Passos críticos: Este manuscrito descreve em detalhes os protocolos para a cultura de uma amostra viável de S. pasteurii. Uma vez que a cultura foi preparado, ele deve ser apropriadamente enriquecido. Este é um passo chave essencial para o sucesso da experiência, pois uma falha para proporcionar o ambiente químico adequado leva a qualquer escala de tempo muito longos de precipitação ou de uma completa falta dela. S. pasteurii é bastante sensível a vários órgãos externos e devem ser cul...

Sporosarcina pasteurii é uma bactéria gram-positiva capazes de sobreviver em ambientes altamente alcalino (pH ~ 10) um e é uma das espécies de bactérias que podem tornar-se um agente causador de um fenómeno chamado microbiologicamente Induzida calcite Precipitação (MICP) 2-4. MICP é um processo em que a precipitação de carbonato de cálcio é induzida por certos microorganismos sob condições ambientais adequadas. S. pasteurii assumiu importância nos últimos anos devido à sua identificação como possível agente para induzir volumes significativos de MICP sob certas condições. Esta possibilidade resulta do facto de S. pasteurii tem a capacidade única para secretar grandes quantidades de enzima urease. Esta enzima actua como um catalisador, que promove uma lise acelerada de ureia (um composto bioquímico que ocorre naturalmente com o fornecimento generalizada e abundante) na presença de moléculas de água. Através de uma cascata de reacções, neste processo finalLY conduz à geração de iões carbonato carregados negativamente. Estes iões, por sua vez, reagir com os iões de metal como cálcio positivos para finalmente formar precipitados de carbonato de cálcio (calcite); portanto, a etiqueta MICP 5-9. O processo de MICP foi conhecida e estudada por várias décadas 10,11. Ao longo dos últimos anos, MICP foi investigado por uma ampla gama de engenharia e ambientais, incluindo a de baixo para cima construção verde 12, melhoria de estruturas de grande escala 13,14 e sequestro e armazenamento de carbono 15,16. Por exemplo, Cunningham et 17. al projetado um reator de fluxo de temperatura moderada alta pressão contendo um núcleo de arenito Berea. O reactor foi inoculado com a bactéria S. fridgidimarina e sob condições de injecção de dióxido de carbono supercrítico de alta pressão, uma acumulação maciça de biomassa no interior do volume de poroumes foi observado, o que levou a uma redução superior a 95% da permeabilidade. Jonkers e Schlangen 18 estudaram o efeito de certas estirpes de bactérias especiais sobre o processo de auto-cura em concreto. água externa transportados para a rede de poros entrar através dos poros da superfície é esperado para ativar as bactérias dormentes que por sua vez ajudam a resistência estrutural via MICP. Tobler 19 et al. compararam a atividade ureolítica de S. pasteurii com um subterrâneas ureolítica microcosmo indígena sob condições que favorecem MCIP grande escala e descobriu que S. pasteurii tem uma capacidade consistente para melhorar a precipitação de calcita, mesmo quando as comunidades indígenas não tinham actividade da urease prévio. Mortensen 20 et.al estudaram os efeitos de fatores externos, como o tipo de solo, a concentração de cloreto de amônio, salinidade, concentração de oxigênio e lise de células na MICP. Sua demonstração de que o processo de tratamento biológico é muito robusto com respect a uma grande variação no espaço de parâmetros substancia a aptidão deste processo para várias aplicações de reparação de grande escala proporcionado um processo de enriquecimento adequada para reforçar a bactéria é levada a cabo. Phillips et 21. al concebido experimentos para estudar as alterações na permeabilidade e força de uma coluna de areia e um núcleo de arenito depois de ser injetado com S. culturas pasteurii. Eles descobriram que enquanto que a permeabilidade diminuída 2 - 4 vezes enquanto que a resistência à fractura aumentou três vezes. S. pasteurii e seu papel na MICP são tópicos de pesquisa ativa e várias questões relacionadas com o mecanismo de precipitação química ainda não são totalmente compreendidos. À luz disto, é muito importante ter um conjunto de protocolos padronizados consistentes com precisão a cultura um estoque adequadamente enriquecida de S. pasteurii para alcançar MICP. Aqui, descrevemos um protocolo rigoroso, que irá garantir a repetibilidade ea reprodutibilidade. este manuscript descreve os protocolos detalhados para a cultura de S. pasteurii e adequadamente enriquecimento do meio de cultura para induzir a precipitação. O processo é investigada através de várias técnicas microscópicas, tais como óptica e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e X-Ray Photo-elétron Spectroscopy (XPS). O foco do manuscrito está no processo de MICP. Procedimentos como SEM e Sims, sendo os protocolos padrão bem conhecidos, não são descritos separadamente.

<table><tbody><tr><td>Petridish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Petridish sendo usado como placa de ágar</td></tr><tr><td>Frascos de pirex</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>sendo usado para fazer</td></tr><tr><td>ácido clorídrico</td> Tris-Buffer <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1.0 N, Biorreagente, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Ágar em pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>testado em microbiologia, testado em cultura de células vegetais, testado em cultura de células, em pó</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>para Biologia</td></tr><tr><td>Molecular Extrato de levedura em pó</td><td>Cilindro de medição Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr>Cilindro<td>graduado</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cole-Parmer Classe A com certificado Cal, TC; 1.000 ml, 1 / Pk</td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>sendo usada para medir o peso de reagentes</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Autoclave</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Alumínio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>sendo usada para selar o frasco antes de colocá-lo em Autoclave</td></tr><tr><td>Estoque Bacteriano</td><td>Cedarlane</td><td>11859</td><td>-80 &deg; C estoque de S. pasteurii, ATCC No. é mencionado contra Cat. Não.</td></tr><tr><td>Pipetadores mecânicos de canal único Mline, volume variável</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Comercializado pela VWR sob o número de catálogo 14005976</td></tr><tr><td>Ponta de micropipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Usado para arranhar placas de ágar</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Pasta</td><td>80079098</td><td>Incubadora de microbiologia,</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td> da série BF <td>VWR</td><td>14004300</td><td>VWR Signature Benchtop Shakeking Incubadoras</td></tr><tr><td>Tampão Fosfato Salino (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Express Dispositivo de pipetagem de auxílio de pipeta</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Comercializado pela VWR sob o número de catálogo 53106220</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Usado para selar placas de ágar</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Enriquecimento para meio nutriente</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Enriquecimento para meio nutriente</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de cálcio Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Enriquecimento para meio nutriente</td></tr></tbody></table>

microbiologicamente induzida calcita precipitation mediada por<em&gt; sporosarcina pasteurii</em

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

A bactéria em particular sob investigação aqui (S. pasteurii) é única em sua capacidade, sob as condições certas, para induzir a hidrólise da uréia (ureolysis) em que ocorre naturalmente ambientes através da secreção de uma enzima urease. Este processo de ureolysis, através de uma cadeia de reacções químicas, conduz à formação de precipitados de carbonato de cálcio. Isto é conhecido como microbiologicamente Induzida calcite Precipitação (MICP). Os protocolos de cultura adequados para MICP são detalhados aqui. Finalmente, as experiências de visualização sob diferentes modos de microscopia foram realizados para compreender vários aspectos do processo de precipitação. Técnicas como microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e X-Ray Photo-elétron Spectroscopy (XPS) foram empregadas para caracterizar quimicamente o produto final. Além disso, a capacidade destes precipitados para obstruir os poros no interior de um meio poroso natural foi demonstrado através de uma experiência qualitativa onde esponjabarras foram utilizadas para imitar uma poro de rede com uma gama de escalas de comprimento. Uma barra de esponja embebida em meio de cultura contendo as células bacterianas endurece devido ao entupimento dos seus poros resultantes do processo contínuo de precipitação química. Esta barra de esponja endurecida apresenta uma resistência superior quando comparada com uma barra de esponja de controlo que fica comprimido e espremido sob a acção de uma carga externa aplicada, enquanto a barra endurecida é capaz de suportar o mesmo peso com pouca deformação.

S. pasteurii ser um Alcalifilo 24 podem sobreviver a condições relativamente severas. Quando o protocolo de cultura acima mencionado é seguido, e S. pasteurii é cultivado dentro de uma câmara, as bactérias conduz à precipitação de carbonato de cálcio ao longo do tempo (Figura 2A). A Figura 2 (b) mostra uma imagem de contraste de fase microscópica óptica da população celular bacteriana dentro do meio de cultura. As células ind...

Protocolos para precipitação de calcita induzida microbiologicamente (MICP) usando a bactéria Sporosarcina pasteurii são apresentados aqui. O carbonato de cálcio precipitado foi caracterizado por meio de microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Também é mostrado que a exposição ao MICP aumenta a resistência à compressão da esponja.

Microbiologicamente induzida Calcita Precipitation Mediada por<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

O objetivo geral deste protocolo é induzir a precipitação de calcita em um cultivo estagnado de Sporosarcina pasteurii. Este método pode nos ajudar a responder perguntas-chave de natureza biofísica sobre a precipitação de calcita mediada por Sporosarcina pasteurii, como as escalas relevantes de comprimento e tempo. A principal vantagem desta técnica é o fato de que ela padroniza os passos complexos envolvidos no cultivo e enriquecimento adequado de Sporosarcina pasteurii, garantindo uma precipitação confiável de calcita.Para começar, reúna placas de Petri, frascos, base de Tris, HCl, ágar, água Millipore e um medidor de pH. Esterilize todos os recipientes por autoclavagem a 121 graus Celsius antes do uso. Prepare um litro de uma solução aquosa 0,13 molar de tampão Tris misturando 15,75 gramas de base de Tris com um litro de água Millipore.Adicione aproximadamente 2,8 mililitros de HCl 50% para ajustar o tampão a um pH de nove. Uma vez que o cultivo estiver pronto, ele deverá ser adequadamente enriquecido com o tampão apropriado. Este passo é fundamental para o sucesso do experimento, pois a falha em fornecer o ambiente químico adequado pode levar a escalas de tempo muito longas de precipitação ou até mesmo à ausência completa da mesma.Em seguida, divida um litro do tampão em duas partes conforme a seguir. Em uma alíquota de 400 mililitros, dissolva oito gramas de sulfato de amônio. Em uma segunda alíquota de 400 mililitros, dissolva 16 gramas de extrato de levedura.Em 100 mililitros do tampão, misture dois gramas de sulfato de amônio e, nos últimos 100 mililitros de tampão, adicione quatro gramas de extrato de levedura e quatro gramas de ágar. Após envolver os frascos em papel alumínio, autoclave as quatro soluções. Imediatamente após a autoclavação, reserve as duas soluções de 400 mililitros.Combine as duas soluções de 100 mililitros, misture bem e distribua entre 10 a 12 placas de Petri. Para cultivar amostras bacterianas, retire o estoque bacteriano do congelador a menos 80 graus Celsius e deixe descongelar adequadamente. Em seguida, coloque-o junto com uma placa de ágar na cabine de segurança biológica.Selecione uma micropipeta com o menor volume possível e mergulhe a ponteira da micropipeta no estoque de Sporosarcina pasteurii antes de usar a ponteira para semear uma placa de ágar. Incube a placa a 31 graus Celsius por 48 horas e, em seguida, examine visualmente a presença de colônias isoladas. Caso nenhuma esteja presente, incube por mais 24 horas.Repita a verificação e as incubações até que colônias isoladas sejam detectadas. Para preparar as amostras finais de cultura bacteriana, misture as duas soluções de 400 mililitros autoclavadas anteriormente em um béquer esterilizado e transfira 125 mililitros para um frasco. Realize uma inspeção visual da placa de ágar para identificar regiões com altas concentrações de colônias isoladas.Com a ponta de uma micropipeta, empurre suavemente e quebre uma das colônias. Em seguida, mergulhe a mesma ponta no frasco de 125 mililitros e agite bem para garantir que um número suficiente de células seja transferido. Coloque o frasco em um incubador agitador a 30 graus Celsius e 150 rpm por dois a três dias.Para determinar a contagem final de células, trace sete linhas paralelas equidistantes e em negrito no fundo de uma das placas de ágar, de modo que fiquem visíveis a partir da parte superior. Coloque três gotas pequenas de cerca de dez microlitros de cultura não diluída em um segmento. Adicione um mililitro de cultura não diluída a nove mililitros de PBS esterilizado para obter uma diluição de um para dez.Em seguida, coloque três pequenas gotas da diluição sobre um segundo segmento da placa. Transfira a cultura diluída para um novo frasco e use PBS para diluir adicionalmente dez vezes, até dez elevado a menos dois. Repita o processo de semeadura e diluição até obter uma diluição de, no mínimo, dez elevado a menos sete, para garantir a obtenção de colônias isoladas.Incube a placa a 31 graus Celsius por um a dois dias antes de contar as colônias em cada seção da placa. Transfira nove mililitros da cultura líquida preparada para vários tubos de centrífuga esterilizados de dez mililitros. Prepare 100 mililitros da solução estoque de enriquecimento externo utilizando uma balança analítica para medir cuidadosamente dois gramas por litro de ureia, um grama por litro de cloreto de amônio, 212 miligramas por litro de bicarbonato de sódio e 280 miligramas por litro de cloreto de cálcio.Em um béquer com meio fresco, combine todos os ingredientes exceto a ureia e autoclave. Após a autoclavação, misture a ureia com um mililitro de meio fresco e passe a solução através de uma seringa equipada com filtro de 0,2 micrômetro antes de adicionar ao meio de enriquecimento. Adicione um mililitro do meio de enriquecimento com aditivos aos tubos de centrífuga esterilizados contendo nove mililitros do cultivo preparado.Vortex cada tubo e incube em um incubador sem agitação a 30 graus Celsius. Monitore todas as unidades regularmente quanto ao início da precipitação. Assim que a precipitação for detectada a olho nu, transfira um pequeno volume de fluido para um sistema de lâmina de microscopia com câmara de alta magnificação.Observe inicialmente com aumento de 4X para visualizar uma ampla área antes de aumentar progressivamente a magnificação. Realize as colorações e experimentos de MEV de acordo com o protocolo descrito no texto. Quando S. pasteurii é cultivada seguindo o protocolo demonstrado neste vídeo, as bactérias promovem a precipitação de carbonato de cálcio que se deposita no fundo do tubo ao longo do tempo.Esta figura mostra imagens de contraste de fase de uma população bacteriana claramente distinta, com formato de bastonete, dentro do meio. Aqui, podem-se observar as linhas bem definidas de clivagem, uma característica marcante da cristalinidade. Este gráfico de espectroscopia fotoeletrônica de raios X para a mesma amostra contém picos correspondentes a grupos carbonato que indicam a presença de carbonato de cálcio.Mostrado neste painel está uma esponja não tratada que se comprime facilmente quando submetida a um peso de um quilograma. Quando uma esponja foi imersa em uma solução precipitante de calcita com S.pasteurii por sete dias e depois secada, endureceu e exibiu maior resistência à compressão devido ao entupimento dos poros pela precipitação de calcita. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em algumas horas se todos os passos forem realizados corretamente.No entanto, embora os passos individuais levem apenas alguns minutos cada um, existem períodos ociosos mais longos entre eles, nos quais a amostra deve ser incubada por horas ou até mesmo dias. Após este procedimento, várias outras técnicas, como caracterizações adicionais, podem ser realizadas para responder outras questões sobre, por exemplo, a distribuição estatística de formas polimórficas no carbonato de cálcio. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão adequada e clara de como cultivar adequadamente Sporosarcina pasteurii para enriquecê-la corretamente, garantindo a precipitação de calcita, e também de como observar o processo por meio de microscopia multímodo.Não se esqueça de que trabalhar com autoclaves de alta pressão pode ser extremamente perigoso e, portanto, todas as precauções, como a ventilação completa da câmara e o uso de EPIs, devem ser garantidas antes de realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Bhaduri, S., et al., Precipitação de calcita induzida microbiologicamente mediada por Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o método de enriquecimento de Sporosarcina pasteurii com uréia e cloreto de cálcio para desencadear a atividade da urease, levando à formação de cristais de calcita visíveis por meio da precipitação de calcita induzida microbiologicamente, ou MICP.

Precipitação de calcita induzida microbiologicamente por Sporosarcina pasteurii

Um método para destacar endósporos bacterianos de comunidades microbianas complexas foi desenvolvido para realizar estudos moleculares ou de cultura personalizados desse grupo de bactérias.

O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Um protocolo para a produção paralela de carbonato de cálcio precipitado e material zeolítico a partir de escória de alto-forno via carbonatação mineral e conversão hidrotérmica alcalina, respectivamente, é apresentado. O desempenho do material zeolítico em relação à adsorção de níquel é testado.

Two-way Valorização da escória de alto forno: Síntese de Precipitado de Carbonato de Cálcio e zeolítico Heavy Metal adsorvente

Demonstramos o uso de vários métodos de microscopia que são úteis na observação da calcificação de um verme tubular, Hydroides elegans, bem como na localização e caracterização do primeiro material calcificado. A microscopia ao vivo e a microscopia eletrônica são usadas juntas para fornecer informações funcionais e materiais que são importantes no estudo da biomineralização.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Descrevemos um protocolo para a precipitação e caracterização de cristais de carbonato de cálcio que se formam na presença de biopolímeros.

Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos

Aqui, a tecnologia micróbios induzida da precipitação da calcita (micp) é apresentada para melhorar Propriedades do solo pela imersão.

Melhoramento do solo de Sandy através da precipitação Microbialmente induzida da calcita (MICP) pela imersão

O método de verificação descrito aqui é adaptável para monitorar o sequestro de carbono inorgânico pedogênico em vários solos agrícolas alterados com rochas alcalinas contendo silicato de metais terrestres, como wollastonita, basalto e olivina. Esse tipo de validação é essencial para programas de crédito de carbono, que podem beneficiar agricultores que sequenciam carbono em seus campos.

Monitoramento do acúmulo de carbono inorgânico pedogênico devido ao intemperismo de minerais de silicato alterados em solos agrícolas.

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Sporosarcina pasteurii é uma bactéria ureolítica que decompõe a uréia em carbonato e amônio. O carbonato se combina com o cálcio para formar carbonato de cálcio, criando uma rede cristalina que ancora as partículas circundantes para produzir biocimento. Este é um protocolo conveniente para usar moldes impressos em 3D para criar tijolos de biocimento adequados para testes de compressão.

Produção e análise de tijolos de biocimento Sporosarcina pasteurii usando moldes personalizados impressos em 3D para testes de compressão não confinada

Sintetizamos nanostars em forma de estrela de ouro usando um método de crescimento de sementes de prata mediada. O diâmetro do nanostars varia de 200 a 300 nm eo número de dicas variam de 7 a 10. As nanopartículas têm uma ampla ressonância de plasmons de superfície de modo centrado no infravermelho próximo.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

Aprenda a induzir precipitação de calcita microbiológica usando Sporosarcina pasteurii. Este protocolo padronizado demonstra cultivo, enriquecimento bacteriano e caracterização por microscopia óptica e eletrônica para aumentar a resistência compressiva de materiais.

Microbiologicamente induzida Calcita Precipitation Mediada por

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