Silenciamento de Genes com Morfolinos
O silenciamento genético mediado por morfina é uma técnica comum usada para estudar papéis de genes específicos durante o desenvolvimento. Os morpholi…
Técnicas de silenciamento genético são comumente usadas no campo da biologia do desenvolvimento. Abordagens de knockdown baseadas em morfolino permitem rotineiramente que os pesquisadores identifiquem e caracterizem genes envolvidos em processos celulares importantes. Os morfolinos antissenses são agora amplamente populares em muitos sistemas de modelos, incluindo ratos, filhotes e zebrafish, devido à sua alta eficácia, alta especificidade e baixo custo.
Este vídeo fornecerá uma visão geral dos mecanismos de morfolino e estratégias de microinjeção, controles experimentais chave e como os morpholinos estão sendo usados em laboratórios hoje para investigar o desenvolvimento de vertebrados.
Os morpholinos foram desenvolvidos pela primeira vez como uma forma de inibir a tradução de transcrições de RNA em células vivas e organismos. Geralmente, os morfolnos são moléculas sintéticas compostas de 25 oligonucleotídeos conectados por uma espinha dorsal carregada neutramente.
Mas embora os morfolnos possam se parecer muito com o DNA, eles contêm anéis de morfina no lugar dos grupos de açúcar encontrados na espinha dorsal do açúcar fosfato. Esta simples conversão aumenta a estabilidade do morfolino nas células, e reduz seu custo de produção.
Dentro das células, os morfolnos são direcionados ao RNA de interesse por emparelhamento de base complementar. A localização no RNA onde o morpholino hibridiza determina seu mecanismo específico de ação.
Os morfolitos que bloqueiam emendas se ligam a junções específicas e inibem o processamento adequado da transcrição, enquanto os morfolnos bloqueador de tradução se ligam dentro da região não traduzida do gene de 5' perto do local de início da tradução e impedem a montagem ribossa. Ambos os tipos de morfolnos reduzem a expressão de proteínas-alvo funcionais.
Ao planejar um experimento usando morfolinos, existem algumas considerações importantes a serem consideradas. Morpholinos podem ser usados em vários sistemas de modelo, por isso é importante selecionar um modelo que seja capaz de abordar a questão biológica em questão.
Os morpholinos são comercialmente sintetizados, e a assistência profissional ao design não tem custo para os pesquisadores, mas por serem informações genéticas específicas de sequência para todos os alvos específicos de morfolino devem ser originadas antes do projeto.
No sistema modelo de zebrafish, muitas vezes há duas cópias de genes únicos encontrados em outros vertebrados, devido a um evento de duplicação de genoma inteiro que ocorreu em um ancestral evolutivo do zebrafish. Portanto, o knockdown de ambos os genes de zebrafish pode ser necessário para modelar com sucesso deficiências proteicas no desenvolvimento humano.
Projetar bons controles experimentais é tão importante quanto projetar seus morfolnos direcionados. Qualquer morfolino pode se ligar a sequências específicas em diferentes genes. É aconselhável usar morfolinos independentes e não sobrepostos complementares ao mesmo gene, a fim de garantir que uma mudança fenotípica observada seja devido ao knockdown do seu gene de interesse.
Agora que abordamos o projeto experimental de Morpholino, vamos dar uma olhada em como os morfolnos são introduzidos em zebrafish.
Aqui, descreveremos a microinjeção de morfolino em zebrafish. Para obter mais informações sobre os detalhes da microinjeção, consulte o vídeo da JoVE Science Education intitulado "Técnicas de Microinjeção de Zebrafish".
Os morfonos são tipicamente injetados em embriões de zebrafish entre o estágio de uma e quatro células, na gema ou citoplasma celular. As conexões citoplasmáticas entre células embrionárias permitem a difusão rápida e a entrega onipresente de morfolnos solúveis em água em todo o organismo. Os morfonos estão estáveis nas células, uma vez que o embrião de zebrafish é elevado a 28,5°C.
Concentrações e volumes de injeção ideais devem ser testados empiricamente para cada morfelino. Normalmente, a dose mais baixa na qual há um fenótipo confiável definido em pelo menos 50-75% dos embriões injetados é usada para evitar a letalidade embrionária ou efeitos fora do alvo indesejados.
A maioria dos fenótipos de peixe-zebra morpholino são identificados nos primeiros três dias pós-fertilização, e o silenciamento genético é geralmente eficaz até o quinto dia. No caso de morfolinos de bloqueio de emendas, o RT-PCR pode ser usado para identificar quantidades relativas de transcrições nativas e alteradas. Para morfolinos de bloqueio de tradução, os níveis de knockdown genético podem ser avaliados pela mancha ocidental.
O rápido desenvolvimento externo e a transparência dos embriões de zebrafish permitem fácil observação de muitos processos biológicos precoces. Fenótipos de morfolino podem ser comumente pontuados analisando morfologia usando microscopia de campo brilhante ou fluorescência, bem como avaliando o comportamento.
Após a definição do fenótipo de morfolino, o resgate do RNA pode ser realizado para demonstrar a especificidade do alvo. Após o knockdown de morfolino do mRNA endógeno, o mRNA sintético é injetado, que codifica a mesma proteína, mas não contém a sequência de alvos de morfolino. Se este RNA injetado é capaz de restaurar o fenótipo do tipo selvagem do organismo, então podemos concluir que o fenótipo de morfolino observado é especificamente devido ao gene alvo ser derrubado.
Agora que você tem uma noção do que são morfolnos e como experimentos de morfolino controlados podem ser realizados, vamos ver como os morpholinos estão sendo aplicados em laboratórios biológicos hoje.
Na biologia celular, os morfonos são usados para entender os processos de desenvolvimento precoce. O fluxo de fluido gerado por Cília na vesícula de Kupffer é um exemplo, que controla a padronização esquerda-direita em zebrafish. O fluxo de fluidos corre no sentido anti-horário em embriões injetados no controle, enquanto o silenciamento de um gene que regula a organização celular ciliada interrompe a velocidade e a direção do fluido.
Os morfonos também são muito adequados para modelar de forma rápida e confiável doenças genéticas humanas. Fenótipos de perda de função podem ser facilmente reproduzidos manipulando a expressão proteica, como visto em um modelo de zebrafish de displasia humana exibindo cistos renais, edema pericárdico e uma cauda enrolada. Além disso, mutações patogênicas podem ser rapidamente avaliadas in vivo usando mRNA selvagem ou mutante para resgatar fenótipos da doença de morpholino.
Uma vez que os morfolnos podem ser introduzidos em células vivas de diferentes maneiras, eles são altamente valorizados no estudo da regeneração e desenvolvimento de órgãos. A microinjeção seguida de estimulação elétrica de morfinas em tecidos específicos permitiu aos pesquisadores estudar o crescimento de barbatanas e a formação de retina em zebrafish adultos.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao silenciamento genético com morfolnos. Neste vídeo, discutimos a estrutura e o mecanismo dos morfolnos, aplicações comuns para uso e maneiras importantes de avaliar a eficácia e os efeitos do silenciamento genético direcionado. Por serem fáceis de projetar, altamente específicos e econômicos, os morfonos continuarão a ser um ator significativo no campo da genética reversa, ajudando a analisar funcionalmente os genes envolvidos em doenças e desenvolvimento. Obrigado por assistir!
Técnicas de silenciamento genético são comumente usadas no campo da biologia do desenvolvimento. Abordagens de knockdown baseadas em morfolino permitem rotineiramente que os pesquisadores identifiquem e caracterizem genes envolvidos em processos celulares importantes. Os morfolinos antissenses são agora amplamente populares em muitos sistemas de modelos, incluindo ratos, filhotes e zebrafish, devido à sua alta eficácia, alta especificidade e baixo custo.
Este vídeo fornecerá uma visão geral dos mecanismos de morfolino e estratégias de microinjeção, controles experimentais chave e como os morpholinos estão sendo usados em laboratórios hoje para investigar o desenvolvimento de vertebrados.
Os morpholinos foram desenvolvidos pela primeira vez como uma forma de inibir a tradução de transcrições de RNA em células vivas e organismos. Geralmente, os morfolnos são moléculas sintéticas compostas de 25 oligonucleotídeos conectados por uma espinha dorsal carregada neutramente.
Mas embora os morfolnos possam se parecer muito com o DNA, eles contêm anéis de morfina no lugar dos grupos de açúcar encontrados na espinha dorsal do açúcar fosfato. Esta simples conversão aumenta a estabilidade do morfolino nas células, e reduz seu custo de produção.
Dentro das células, os morfolnos são direcionados ao RNA de interesse por emparelhamento de base complementar. A localização no RNA onde o morpholino hibridiza determina seu mecanismo específico de ação.
Os morfolitos que bloqueiam emendas se ligam a junções específicas e inibem o processamento adequado da transcrição, enquanto os morfolnos bloqueador de tradução se ligam dentro da região não traduzida do gene de 5' perto do local de início da tradução e impedem a montagem ribossa. Ambos os tipos de morfolnos reduzem a expressão de proteínas-alvo funcionais.
Ao planejar um experimento usando morfolinos, existem algumas considerações importantes a serem consideradas. Morpholinos podem ser usados em vários sistemas de modelo, por isso é importante selecionar um modelo que seja capaz de abordar a questão biológica em questão.
Os morpholinos são comercialmente sintetizados, e a assistência profissional ao design não tem custo para os pesquisadores, mas por serem informações genéticas específicas de sequência para todos os alvos específicos de morfolino devem ser originadas antes do projeto.
No sistema modelo de zebrafish, muitas vezes há duas cópias de genes únicos encontrados em outros vertebrados, devido a um evento de duplicação de genoma inteiro que ocorreu em um ancestral evolutivo do zebrafish. Portanto, o knockdown de ambos os genes de zebrafish pode ser necessário para modelar com sucesso deficiências proteicas no desenvolvimento humano.
Projetar bons controles experimentais é tão importante quanto projetar seus morfolnos direcionados. Qualquer morfolino pode se ligar a sequências específicas em diferentes genes. É aconselhável usar morfolinos independentes e não sobrepostos complementares ao mesmo gene, a fim de garantir que uma mudança fenotípica observada seja devido ao knockdown do seu gene de interesse.
Agora que abordamos o projeto experimental de Morpholino, vamos dar uma olhada em como os morfolnos são introduzidos em zebrafish.
Aqui, descreveremos a microinjeção de morfolino em zebrafish. Para obter mais informações sobre os detalhes da microinjeção, consulte o vídeo da JoVE Science Education intitulado "Técnicas de Microinjeção de Zebrafish".
Os morfonos são tipicamente injetados em embriões de zebrafish entre o estágio de uma e quatro células, na gema ou citoplasma celular. As conexões citoplasmáticas entre células embrionárias permitem a difusão rápida e a entrega onipresente de morfolnos solúveis em água em todo o organismo. Os morfonos estão estáveis nas células, uma vez que o embrião de zebrafish é elevado a 28,5°C.
Concentrações e volumes de injeção ideais devem ser testados empiricamente para cada morfelino. Normalmente, a dose mais baixa na qual há um fenótipo confiável definido em pelo menos 50-75% dos embriões injetados é usada para evitar a letalidade embrionária ou efeitos fora do alvo indesejados.
A maioria dos fenótipos de peixe-zebra morpholino são identificados nos primeiros três dias pós-fertilização, e o silenciamento genético é geralmente eficaz até o quinto dia. No caso de morfolinos de bloqueio de emendas, o RT-PCR pode ser usado para identificar quantidades relativas de transcrições nativas e alteradas. Para morfolinos de bloqueio de tradução, os níveis de knockdown genético podem ser avaliados pela mancha ocidental.
O rápido desenvolvimento externo e a transparência dos embriões de zebrafish permitem fácil observação de muitos processos biológicos precoces. Fenótipos de morfolino podem ser comumente pontuados analisando morfologia usando microscopia de campo brilhante ou fluorescência, bem como avaliando o comportamento.
Após a definição do fenótipo de morfolino, o resgate do RNA pode ser realizado para demonstrar a especificidade do alvo. Após o knockdown de morfolino do mRNA endógeno, o mRNA sintético é injetado, que codifica a mesma proteína, mas não contém a sequência de alvos de morfolino. Se este RNA injetado é capaz de restaurar o fenótipo do tipo selvagem do organismo, então podemos concluir que o fenótipo de morfolino observado é especificamente devido ao gene alvo ser derrubado.
Agora que você tem uma noção do que são morfolnos e como experimentos de morfolino controlados podem ser realizados, vamos ver como os morpholinos estão sendo aplicados em laboratórios biológicos hoje.
Na biologia celular, os morfonos são usados para entender os processos de desenvolvimento precoce. O fluxo de fluido gerado por Cília na vesícula de Kupffer é um exemplo, que controla a padronização esquerda-direita em zebrafish. O fluxo de fluidos corre no sentido anti-horário em embriões injetados no controle, enquanto o silenciamento de um gene que regula a organização celular ciliada interrompe a velocidade e a direção do fluido.
Os morfonos também são muito adequados para modelar de forma rápida e confiável doenças genéticas humanas. Fenótipos de perda de função podem ser facilmente reproduzidos manipulando a expressão proteica, como visto em um modelo de zebrafish de displasia humana exibindo cistos renais, edema pericárdico e uma cauda enrolada. Além disso, mutações patogênicas podem ser rapidamente avaliadas in vivo usando mRNA selvagem ou mutante para resgatar fenótipos da doença de morpholino.
Uma vez que os morfolnos podem ser introduzidos em células vivas de diferentes maneiras, eles são altamente valorizados no estudo da regeneração e desenvolvimento de órgãos. A microinjeção seguida de estimulação elétrica de morfinas em tecidos específicos permitiu aos pesquisadores estudar o crescimento de barbatanas e a formação de retina em zebrafish adultos.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao silenciamento genético com morfolnos. Neste vídeo, discutimos a estrutura e o mecanismo dos morfolnos, aplicações comuns para uso e maneiras importantes de avaliar a eficácia e os efeitos do silenciamento genético direcionado. Por serem fáceis de projetar, altamente específicos e econômicos, os morfonos continuarão a ser um ator significativo no campo da genética reversa, ajudando a analisar funcionalmente os genes envolvidos em doenças e desenvolvimento. Obrigado por assistir!
Q1: What are morpholinos and how do they differ from DNA?
Morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone. Unlike DNA, morpholinos contain morpholine rings in place of sugar groups found in the phosphate sugar backbone. This structural difference increases morpholino stability in cells and lowers their production cost, making them cost-effective tools for gene silencing in developmental research.
Q2: How do splice-blocking and translation-blocking morpholinos work differently?
Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, while translation-blocking morpholinos bind within the 5' untranslated region near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types reduce expression of functional target proteins, but they achieve gene silencing through distinct molecular mechanisms targeting different stages of gene expression.
Q3: Why is using independent morpholinos important for experimental design?
Independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene ensure that observed phenotypic changes are due to knockdown of your target gene, not off-target effects. Since any given morpholino can bind to specific sequences on different genes, using multiple morpholinos confirms specificity and strengthens the validity of your developmental genetics techniques and applications.
Q4: When and where are morpholinos typically injected into zebrafish embryos?
Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. The lowest dose producing a defined reliable phenotype in 50-75% of injected embryos is used to avoid lethality or unwanted off-target effects.
Q5: How is RNA rescue used to confirm morpholino target specificity?
Following morpholino knockdown of endogenous mRNA, synthetic mRNA encoding the same protein but lacking the morpholino target sequence is injected. If this injected RNA restores the wild-type phenotype, the observed morpholino phenotype is specifically due to target gene knockdown. This validation step confirms that the gene silencing effect is genuine and not caused by off-target interactions.
Q6: What are practical applications of morpholinos in studying vertebrate development?
Morpholinos are used to study early developmental processes like cilia-generated fluid flow in Kupffer's vesicle, which controls left-right patterning in zebrafish. They also model human genetic diseases by reproducing loss-of-function phenotypes and rapidly assaying pathogenic mutations. Additionally, microinjection of morpholinos into specific tissues enables researchers to study tissue regeneration with somatic stem cells and organ formation in adult zebrafish.
Q7: Why are zebrafish particularly suitable for morpholino-based gene silencing studies?
Zebrafish are ideal for morpholino research due to their rapid external development, transparency, and ease of observation using brightfield or fluorescence microscopy. Morpholino phenotypes are typically identified within the first three days post-fertilization and remain effective through day five. Additionally, zebrafish often have two gene copies from a whole-genome duplication event, requiring knockdown of both genes to model human protein deficiencies.