Silenciamento de Genes com Morfolinos

Gene Silencing with Morpholinos

JoVE Science Education
Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

Gene Silencing with Morpholinos

2.1: Invertebrate Lifespan Quantification

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08:47 min

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April 30, 2023

Overview

O silenciamento genético mediado por morfina é uma técnica comum usada para estudar papéis de genes específicos durante o desenvolvimento. Os morpholinos inibem a expressão genética hibridizando-se para mRNAs complementares. Devido à sua química única, os morfos são fáceis de produzir e armazenar, o que os torna extraordinariamente econômicos em comparação com outros métodos de silenciamento genético.

Este vídeo revisa o design experimental adequado ao usar esses oligonucleotídeos. Na sequência, será discutida uma explicação das técnicas de microinjeção de morfolino em zebrafish e a análise dos fenótipos resultantes. Por fim, mostramos exemplos de aplicações específicas onde a tecnologia morpholino é usada para modelar distúrbios do desenvolvimento ou para estudar a regeneração tecidual.

Procedure

Técnicas de silenciamento genético são comumente usadas no campo da biologia do desenvolvimento. Abordagens de knockdown baseadas em morfolino permitem rotineiramente que os pesquisadores identifiquem e caracterizem genes envolvidos em processos celulares importantes. Os morfolinos antissenses são agora amplamente populares em muitos sistemas de modelos, incluindo ratos, filhotes e zebrafish, devido à sua alta eficácia, alta especificidade e baixo custo.

Este vídeo fornecerá uma visão geral dos mecanismos de morfolino e estratégias de microinjeção, controles experimentais chave e como os morpholinos estão sendo usados em laboratórios hoje para investigar o desenvolvimento de vertebrados.

Os morpholinos foram desenvolvidos pela primeira vez como uma forma de inibir a tradução de transcrições de RNA em células vivas e organismos. Geralmente, os morfolnos são moléculas sintéticas compostas de 25 oligonucleotídeos conectados por uma espinha dorsal carregada neutramente.

Mas embora os morfolnos possam se parecer muito com o DNA, eles contêm anéis de morfina no lugar dos grupos de açúcar encontrados na espinha dorsal do açúcar fosfato. Esta simples conversão aumenta a estabilidade do morfolino nas células, e reduz seu custo de produção.

Dentro das células, os morfolnos são direcionados ao RNA de interesse por emparelhamento de base complementar. A localização no RNA onde o morpholino hibridiza determina seu mecanismo específico de ação.

Os morfolitos que bloqueiam emendas se ligam a junções específicas e inibem o processamento adequado da transcrição, enquanto os morfolnos bloqueador de tradução se ligam dentro da região não traduzida do gene de 5′ perto do local de início da tradução e impedem a montagem ribossa. Ambos os tipos de morfolnos reduzem a expressão de proteínas-alvo funcionais.

Ao planejar um experimento usando morfolinos, existem algumas considerações importantes a serem consideradas. Morpholinos podem ser usados em vários sistemas de modelo, por isso é importante selecionar um modelo que seja capaz de abordar a questão biológica em questão.

Os morpholinos são comercialmente sintetizados, e a assistência profissional ao design não tem custo para os pesquisadores, mas por serem informações genéticas específicas de sequência para todos os alvos específicos de morfolino devem ser originadas antes do projeto.

No sistema modelo de zebrafish, muitas vezes há duas cópias de genes únicos encontrados em outros vertebrados, devido a um evento de duplicação de genoma inteiro que ocorreu em um ancestral evolutivo do zebrafish. Portanto, o knockdown de ambos os genes de zebrafish pode ser necessário para modelar com sucesso deficiências proteicas no desenvolvimento humano.

Projetar bons controles experimentais é tão importante quanto projetar seus morfolnos direcionados. Qualquer morfolino pode se ligar a sequências específicas em diferentes genes. É aconselhável usar morfolinos independentes e não sobrepostos complementares ao mesmo gene, a fim de garantir que uma mudança fenotípica observada seja devido ao knockdown do seu gene de interesse.

Agora que abordamos o projeto experimental de Morpholino, vamos dar uma olhada em como os morfolnos são introduzidos em zebrafish.

Aqui, descreveremos a microinjeção de morfolino em zebrafish. Para obter mais informações sobre os detalhes da microinjeção, consulte o vídeo da JoVE Science Education intitulado “Técnicas de Microinjeção de Zebrafish”.

Os morfonos são tipicamente injetados em embriões de zebrafish entre o estágio de uma e quatro células, na gema ou citoplasma celular. As conexões citoplasmáticas entre células embrionárias permitem a difusão rápida e a entrega onipresente de morfolnos solúveis em água em todo o organismo. Os morfonos estão estáveis nas células, uma vez que o embrião de zebrafish é elevado a 28,5°C.

Concentrações e volumes de injeção ideais devem ser testados empiricamente para cada morfelino. Normalmente, a dose mais baixa na qual há um fenótipo confiável definido em pelo menos 50-75% dos embriões injetados é usada para evitar a letalidade embrionária ou efeitos fora do alvo indesejados.

A maioria dos fenótipos de peixe-zebra morpholino são identificados nos primeiros três dias pós-fertilização, e o silenciamento genético é geralmente eficaz até o quinto dia. No caso de morfolinos de bloqueio de emendas, o RT-PCR pode ser usado para identificar quantidades relativas de transcrições nativas e alteradas. Para morfolinos de bloqueio de tradução, os níveis de knockdown genético podem ser avaliados pela mancha ocidental.

O rápido desenvolvimento externo e a transparência dos embriões de zebrafish permitem fácil observação de muitos processos biológicos precoces. Fenótipos de morfolino podem ser comumente pontuados analisando morfologia usando microscopia de campo brilhante ou fluorescência, bem como avaliando o comportamento.

Após a definição do fenótipo de morfolino, o resgate do RNA pode ser realizado para demonstrar a especificidade do alvo. Após o knockdown de morfolino do mRNA endógeno, o mRNA sintético é injetado, que codifica a mesma proteína, mas não contém a sequência de alvos de morfolino. Se este RNA injetado é capaz de restaurar o fenótipo do tipo selvagem do organismo, então podemos concluir que o fenótipo de morfolino observado é especificamente devido ao gene alvo ser derrubado.

Agora que você tem uma noção do que são morfolnos e como experimentos de morfolino controlados podem ser realizados, vamos ver como os morpholinos estão sendo aplicados em laboratórios biológicos hoje.

Na biologia celular, os morfonos são usados para entender os processos de desenvolvimento precoce. O fluxo de fluido gerado por Cília na vesícula de Kupffer é um exemplo, que controla a padronização esquerda-direita em zebrafish. O fluxo de fluidos corre no sentido anti-horário em embriões injetados no controle, enquanto o silenciamento de um gene que regula a organização celular ciliada interrompe a velocidade e a direção do fluido.

Os morfonos também são muito adequados para modelar de forma rápida e confiável doenças genéticas humanas. Fenótipos de perda de função podem ser facilmente reproduzidos manipulando a expressão proteica, como visto em um modelo de zebrafish de displasia humana exibindo cistos renais, edema pericárdico e uma cauda enrolada. Além disso, mutações patogênicas podem ser rapidamente avaliadas in vivo usando mRNA selvagem ou mutante para resgatar fenótipos da doença de morpholino.

Uma vez que os morfolnos podem ser introduzidos em células vivas de diferentes maneiras, eles são altamente valorizados no estudo da regeneração e desenvolvimento de órgãos. A microinjeção seguida de estimulação elétrica de morfinas em tecidos específicos permitiu aos pesquisadores estudar o crescimento de barbatanas e a formação de retina em zebrafish adultos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao silenciamento genético com morfolnos. Neste vídeo, discutimos a estrutura e o mecanismo dos morfolnos, aplicações comuns para uso e maneiras importantes de avaliar a eficácia e os efeitos do silenciamento genético direcionado. Por serem fáceis de projetar, altamente específicos e econômicos, os morfonos continuarão a ser um ator significativo no campo da genética reversa, ajudando a analisar funcionalmente os genes envolvidos em doenças e desenvolvimento. Obrigado por assistir!

Transcript

Gene silencing techniques are commonly used in the field of developmental biology. Morpholino-based knockdown approaches routinely allow researchers to both identify and characterize genes involved in important cellular processes. Antisense morpholinos are now widely popular in many model systems, including mice, chicks, and zebrafish, due to their high efficacy, high specificity, and low cost.

This video will provide an overview of morpholino mechanisms and microinjection strategies, key experimental controls, and how morpholinos are being used in labs today to investigate vertebrate development.

Morpholinos were first developed as a way to inhibit the translation of RNA transcripts in living cells and organisms. Generally, morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone.

But although morpholinos may look a lot like DNA, they contain morpholine rings in place of the sugar groups found in phosphate sugar backbone. This simple conversion increases morpholino stability in cells, and lowers their cost of production.

Inside cells, morpholinos are targeted to the RNA of interest by complementary base pairing. The location on the RNA where the morpholino hybridizes determines its specific mechanism of action.

Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, whereas translation-blocking morpholinos bind within the 5′ untranslated region of the gene near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types of morpholinos reduce expression of functional target proteins.

When planning an experiment using morpholinos, there are a few important considerations to keep in mind. Morpholinos can be used in several model systems, so it is important to select a model that is able to address the biological question at hand.

Morpholinos are commercially synthesized, and professional design assistance is available at no cost to researchers, but because they are sequence-specific, gene information for all specific morpholino targets should be sourced prior to design.

In the zebrafish model system, there are often two copies of single genes found in other vertebrates, due to a whole-genome duplication event that occurred in an evolutionary ancestor of the zebrafish. Therefore, knockdown of both zebrafish genes may be necessary to successfully model protein deficiencies in human development.

Designing good experimental controls is just as important as designing your targeted morpholinos. Any given morpholino can bind to specific sequences on different genes. It is advisable to use independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene, in order to ensure that an observed phenotypic change is due to knockdown of your gene of interest.

Now that we’ve addressed morpholino experimental design, let’s have a look at how morpholinos are introduced into zebrafish.

Here, we will describe morpholino microinjection into zebrafish. For more insight and instruction on the details of microinjection, please reference the JoVE Science Education video entitled “Zebrafish Microinjection Techniques.”

Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. Morpholinos are stable in cells, since the zebrafish embryo is raised at 28.5°C.

Optimum injection concentrations and volumes must be empirically tested for each morpholino. Typically, the lowest dose at which there is a defined reliable phenotype in at least 50-75% of injected embryos is used in order to avoid embryonic lethality or unwanted off-target effects.

Most morpholino zebrafish phenotypes are identified in the first three days post-fertilization, and gene silencing is generally effective through day five. In the case of splice-blocking morpholinos, RT-PCR can be used to identify relative amounts of native and altered transcripts. For translation-blocking morpholinos, levels of gene knockdown may be assessed by Western blot.

The rapid external development and transparency of zebrafish embryos allows for easy observation of many early biological processes. Morpholino phenotypes can commonly be scored by analyzing morphology using brightfield or fluorescence microscopy, as well as by assessing behavior.

After the morpholino phenotype has been defined, RNA rescue can be performed to demonstrate target specificity. Following morpholino knockdown of the endogenous mRNA, synthetic mRNA is injected, which encodes the same protein, but does not contain the morpholino target sequence. If this injected RNA is able to restore the wild-type phenotype of the organism, then we can conclude that the observed morpholino phenotype is specifically due to the target gene getting knocked down.

Now that you have a feel for what morpholinos are and how controlled morpholino experiments can be performed, let’s look at how morpholinos are being applied in biological labs today.

In cell biology, morpholinos are used to understand early developmental processes. Cilia-generated fluid flow in Kupffer’s vesicle is one example, which controls left-right patterning in zebrafish. Fluid flow runs counterclockwise in control-injected embryos, whereas silencing of a gene that regulates ciliated cell organization disrupts fluid speed and direction.

Morpholinos are also very suited to quickly and reliably model human genetic diseases. Loss-of-function phenotypes can be easily reproduced by manipulating protein expression, as seen in a zebrafish model of human dysplasia displaying kidney cysts, pericardial edema, and a curled tail. Additionally, pathogenic mutations can be rapidly assayed in vivo by using wild-type or mutant mRNA to rescue morpholino disease phenotypes.

Since morpholinos can be introduced into living cells in different ways, they are highly valued in studying organ regeneration and development. Microinjection followed by electrical stimulation of morpholinos into specific tissues has allowed researchers to study fin growth and retina formation in adult zebrafish.

You’ve just watched JoVE’s introduction to gene silencing with morpholinos. In this video, we’ve discussed the structure and mechanism of morpholinos, common applications for use, and important ways to assess efficacy and effects of targeted gene silencing. Because they are easy to design, highly specific, and cost-effective, morpholinos will remain a significant player in the field of reverse genetics, helping to functionally analyze genes involved in disease and development. Thanks for watching!

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