Name: Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda um método fluorimétrico rápido para triagem de drogas que utiliza nanoclusters de ouro fluorescentes sintetizados em template de proteína carregada com fármaco. Esta técnica permite determinar afinidade de ligação sem instrumentação complexa.

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Y.N.T. gostaria de agradecer à Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR), Cingapura, pelo apoio financeiro sob a concessão JCO CDA 13302FG063.

Atenção: Por favor, consultar as fichas de segurança (SDS) de todos os produtos químicos envolvidos antes de usar. A experiência de rastreio de drogas envolve a síntese e manipulação de nanomateriais, que podem ter riscos adicionais em comparação com o seu homólogo grandes quantidades. Por favor, garantir todas as medidas de controlo necessárias para ser praticado durante todo o experimento, incluindo o uso de controles de engenharia (extractor de fumo) e equipamentos de proteção individual (EPI, por exemplo, calças de comprimento de segurança, sapatos fechados, luvas resistentes a produtos químicos, e óculos de segurança). 1. Preparação de reagentes químicos para Rastreio de drogas <ol><li> Os precursores para a síntese de Au CNs <ol><li> Dissolve-se 30 mg de uma solução de ouro (III), cloreto (99,99% base metais vestigiais, 30 p.% Em ácido clorídrico diluído) em 6,9 ml de água ultrapura para preparar 15 mM de (III) solução de cloreto de ouro. Cuidado: solução de cloreto de ouro é corrosivo e irritante. Utilizar EPI adequado para evitar o contato direto com os olhos ea pele. </li><li> Dissolve 74 mg de HSA ou de BSA em 1 ml de água ultrapura para preparar a 74 mg / ml de solução-mãe de proteínas. </li></ol></li><li> As soluções de fármaco <ol><li> Dissolve-se a quantidade desejada de droga, por exemplo, 1,9 mg de (um) de ibuprofeno, 2,8 mg de (b), a varfarina, 2,3 mg de (c), fenitoína, e 1,5 mg de (d) sulfanilamida em 20 ul de DMSO para preparar a 450 mM das soluções de droga. Nota: DMSO é seleccionado como solvente porque estas drogas são hidrofóbicos e têm baixa solubilidade em água. </li></ol></li><li> Outros reagentes <ol><li> Dissolve-se 600 mg de pastilhas de NaOH em 10 ml de água ultrapura para preparar a 1,5 M de solução de NaOH. Dissolve-se 2,4 g de ureia em 2 ml de água ultrapura para preparar a 20 M de solução de ureia. </li></ol></li></ol> 2. Síntese de Templated-Protein Au NCs <ol><li> HSA-templated Au NCs (HSA-Au CNs) <ol><li> Coloque dois frascos de vidro, cada uma contendo um micro barra magnética nele, em dois de temperatura separado de agitação magnética controlávelRER. </li><li> Ajustar a temperatura de um agitador magnético a 60 ° C, e Rotular o frasco de vidro em cima dele como &quot;60 ° C&quot;; enquanto o outro agitador magnético é mantida à temperatura ambiente (RT), em que o frasco de vidro em cima do que é rotulado como &quot;RT&quot;. </li><li> Adicionar 200 ul de solução de HSA, 200 ul de água ultrapura, e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de para cada frasco, sob agitação constante (definida como 360 rpm, a menos que especificado de outro modo) para permitir o encapsulamento de Au iões dentro do modelo de proteína. </li><li> 2 minutos mais tarde, adicionar 20 ul de uma solução de NaOH a cada frasco, de modo a activar a capacidade redutora do conjugado de HSA na formação de Au CNs e começar a gravar o tempo de reacção como 0 min. </li><li> Cada 20 minutos, extrair 50 mL de soluções de cada da amostra para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão com um leitor de microplacas. A configuração de varredura típico: λ ex = 370 nm, em = λ 410-850 nm. </li><li> Parar o agitador magnético após 100 min. </li><li> Arrefecer os frascos de vidro com água corrente em uma pia. Atenção: Os frascos de vidro estiverem quentes. Usar luvas resistentes ao calor para evitar a queima. </li><li> Traça-se a espectros de fotoemissão em todo o tempo, para cada amostra para obter a cinética de formação de Au CNs em diferentes condições de temperatura. </li></ol></li><li> BSA-templated Au NCs (BSA-Au CNs) <ol><li> Colocar num frasco de vidro contendo um micro barra de agitação magnética no topo de um agitador magnético. Deixar a temperatura como a temperatura ambiente. </li><li> Misturar 200 ml de solução de BSA, 200 ul de ureia, e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de dentro do recipiente de vidro sob agitação constante. </li><li> 2 minutos mais tarde, adicionar 20 ul de uma solução de NaOH para activar a capacidade redutora de BSA para formar Au CNs e começar a gravar o tempo de reacção como 0 min. Medir o espectro de fotoemissão da mistura de reacção por hora. Nota: O espectro de fotoemissão de BSA-Au NCs é medidomenos frequentemente porque a taxa de formação de BSA-au CNs é mais lento do que o de HSA-Au, à mesma temperatura, devido à menor eficácia de ureia para desdobrar a proteína. </li><li> Parar o agitador magnético após 7 h. Traçar o espectro de fotoemissão em todos os tempos para ver a cinética de formação de Au NCs por uréia desnaturação. </li></ol></li></ol> 3. Apresentação de pequeno Drogas Molecular <ol><li> Tela afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos para HSA <ol><li> Coloque cinco frascos de vidro, cada uma contendo uma barra de agitação magnética, em que, na parte superior de uma temperatura controlável multiponto agitador magnético. Rotular estes frascos como a, b, c e d, respectivamente, para cada fármaco, ou seja, o ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida. Rotular a um puro com HSA como controle. </li><li> Adicionar 200 mL de HSA a cada frasco. Adicionar 1 ml de solução de fármaco para os quatro frascos correspondentes. Adicionar 1 ml de DMSO com o controlo. Ligue o agitador e definir a velocidade de rotação para 360rpm e incubar durante 1 h para permitir a ligação à ASH de drogas para completar. </li><li> 1 h depois, adicionar 200 mL de água Milli-Q e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de para cada frasco, sob agitação constante. Ajustar a temperatura para 60 ° C, sob agitação constante durante 10 min. Adicionar 20 mL de NaOH 1,5 M a cada frasco e começar a gravar o tempo de reação como 0 min. </li><li> Desenhar se rapidamente 50 ml de solução a partir de cada frasco para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão (resultados rotulado como 0 min). Grave os espectros de emissão de cada amostra a cada 10 min. Recolher pelo menos quatro espectros no tempo diferente de quatro, que é 0, 10, 20, e 30 min. </li><li> Repita os passos 3.1.1 - 3.1.4 várias vezes para se obter resultados com uma tendência consistente. Parar o agitador magnético. </li><li> Traçar o espectro de fotoemissão resolvida no tempo para cada amostra (a - d, e controle). Identificar o pico de intensidade de todas as amostras e conspiração contra o tempo para comparar a cinética de formação de Au NCs em dimodelos fferent proteína carregado de drogas. </li></ol></li><li> Medir a constante de ligação de um fármaco específico para HSA <ol><li> Repita os passos 3.1.1 - 3.1.4. Substitua a solução de um fármaco com soluções de ibuprofeno em quatro concentrações diferentes (incluindo uma amostra de controlo usando HSA só que sem a carga de droga). Rotular o frasco de vidro de acordo com a concentração do fármaco correspondentemente. </li><li> 10 min mais tarde, arrefecer os frascos de vidro com água corrente em uma pia. Atenção: Os frascos de vidro estiverem quentes. Usar luvas resistentes ao calor para evitar a queima. </li><li> Desenhar 50 ul das soluções acima a partir de cada frasco para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão. </li><li> Repita os passos 3.2.1 - 3.2.3 mais duas vezes para se obter mais dois conjuntos de resultados em diferentes concentrações da droga. </li><li> Parar o agitador magnético. Traçar o espectro de fotoemissão e analisar os resultados. <ol><li> Para os dados brutos obtidos em cada lote individual traçar o espectro de fotoemissão de cadaamostra em software como o software OriginPro e descobrir a intensidade de pico. </li><li> Calcular e representar graficamente a intensidade relativa de fluorescência [(I 0 - I) / I 0] contra a concentração de fármaco, e onde I I 0 referem-se a intensidade de fluorescência de Au CNs formado no carregadas com droga HSA e HSA puro, respectivamente. </li><li> Calcula-se a constante de ligação através do ajuste dos dados a um modelo único local de ligação utilizando a equação de Michaelis-Menten: Y = Rmax × C / (K D + C), onde R max indica o sinal de resposta máxima, C é a concentração do ligando e K D a constante de ligação é. Execute isso em software como OriginPro. Selecione o menu Análise Fitting Nonlinear Curve Fit, em seguida, selecione a função monte de Crescimento / categoria Sigmoidal. No Settings: página Seleção de Função, clique em Ajustar a mostrar-se os resultados embutidos. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li>
<li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nuclear+Magnetic+Resonance+Affinity+Screening+Methods+for+Functional+Annotation+of+Proteins+and+Drug+Discover%22">Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover</a>. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Há vários passos críticos que precisam ser destacadas neste método. No protocolo de rastreio da afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos, Passos 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e são críticas para se obter bons resultados que mostram tendência consistente para a força de ligação relativa. Nestas etapas, as acções de adição de produtos químicos e de desenho soluções de reacção para a medição devem ser tão rapidamente quanto possível para minimizar o efeito de atraso no tempo e a mesma sequência de adi...

Albuminas do soro tais como albumina do soro humano (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são a proteína mais abundante no plasma e desempenham um papel fundamental na manutenção da pressão osmótica do compartimento de sangue. Eles também são reconhecidos como proteínas veículo para moléculas pequenas de baixa solubilidade em água, tais como esteróides, ácidos gordos, hormonas da tiróide, e uma vasta variedade de drogas. A propriedade de ligação (por exemplo, locais de ligação, a afinidade de ligação ou a resistência) dessas moléculas de soro de albuminas forma um tópico importante na farmacocinética. 1-4 vários métodos analíticos foram desenvolvidos para estudar as propriedades de ligação de drogas diferentes para as albuminas do soro, tal como cristalografia de raios-X, 5,6 ressonância magnética nuclear (RMN), 7-11 e de ressonância de plasmon de superfície (SPR), 12,13 etc. No entanto, estes métodos estão limitados por qualquer um processo de análise tediosa e consumidora de tempo (por exemplo, crescimento de cristal único para Crystallo de raios-Xestudo gráfico), a exigência de equipamento especializado e caro (SPR), ou em necessidade de marcação isotópica dispendioso (RMN) para a detecção. Por conseguinte, é altamente desejável desenvolver formas alternativas de pequena seleção da droga molecular de uma maneira rápida, simples e direta, e custo-eficiente. Nanopartículas de ouro (Au NCs) são um tipo especial de nanomaterial, que contêm várias dezenas de átomos de metal com tamanhos inferiores a 2 nm. 14-17 Eles têm atraído interesses de investigação extensas, devido à sua estrutura eletrônica discreta e dependentes de tamanho, 18, 19 e molecular como absorções e emissões. 20-23 Tais propriedades de materiais exclusivos, em particular a forte fluorescência, foram encontradas diversas aplicações, tais como detecção e visualização em sistemas biológicos. 24-32 ultrasmall fluorescente Au NCs pode ser sintetizado usando proteínas funcionais, tais como albuminas do soro, como molde. 33 Numa síntese típica da modelada por proteínas<html> Au CNs, uma certa quantidade de sais de Au são encapsulados no interior da primeira proteína e subsequentemente reduzido pela própria proteína. A capacidade de reduzir a proteína é atribuída a constitutivos funcionais resíduos de aminoácidos (por exemplo, tirosina) que podem ser activados pelo aumento do pH da solução para alcalino. Desdobramento da estrutura da proteína é considerada como um passo crítico para a formação de Au NCs. Isto porque, em uma proteína desdobrada, os grupos funcionais mais redutores podem ser expostas a A UA sais encapsulados. Proteína se desdobrar pode ser alcançada por tratamento com calor ou a exposição a agentes desnaturantes. Introdução de pequenas drogas moleculares também pode afetar o processo de desdobramento, ou seja, modificação da temperatura de desnaturação do ponto médio e a entalpia de desdobramento. 34,35 O efeito de todos esses fatores, por sua vez, pode ser refletido pela cinética de formação de fluorescente Au NCs e manifestado em a intensidade de fluorescência resultantes Au NCs. 36 e_content &quot;&gt; Este vídeo demonstra o método de rastreio de fármacos através da síntese de Au CN de proteínas de albumina carregadas com fármaco a uma temperatura mais elevada (60 ° C) ou na presença de agentes desnaturantes (por exemplo, ureia). A intensidade da fluorescência resultante Au CNs é a leitura do sinal. Em primeiro lugar, Au CNs são sintetizados em moldes HSA e BSA tratadas a 60 ° C ou na presença de ureia para mostrar como a proteína se desdobrar (induzida por tratamento térmico ou desnaturantes) afecta a cinética de formação de Au NCs. Em segundo lugar, Au CNs são sintetizados em moldes de proteína pré-carregadas com drogas diferentes, e o efeito de carga da droga sobre as intensidades de fluorescência relativas dos resultante Au CNs é estudada, que fornece a medida da força de ligação relativa. Finalmente, o protocolo de rastreio Au NC-droga é modificada para medição quantitativa de proteína-droga constante de ligação (K D) variando o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína de uma concentração fixa.

<table><tbody><tr><td>Solução de cloreto de ouro (III), 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>Albumina sérica humana corrosiva e irritante</td></tr><tr><td>, 96%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, 96%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofeno, 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>varfarina, 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>fenitoína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamida, 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>uréia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>221465</tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 384 poços</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de deslocamento de ar de 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; l pipeta de deslocamento de ar</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; l pipeta de deslocamento de ar</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.000 &#956; l Pontas</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>1.000 &#956; l Pontas</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>100 &#956; l Eppendorf dicas</td><td></td><td></td><td></td></tr> microtubo de <tr><td>1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frasco de vidro de 20 ml com tampa de</td><td></td><td></td><td></td>rosca</tr><tr><td>Frasco de vidro de 4 ml com tampa de</td><td></td><td></td><td></td> rosca</tr></tbody></table>

uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-targeting proteína pequena molécula rastreio de drogas

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Nós demonstramos um novo método de rastreio de fármacos para a determinação da afinidade de ligação de pequenas moléculas de droga a uma proteína-alvo através da formação de nanopartículas de ouro (Au fluorescentes CN) dentro da proteína carregadas com fármaco, com base no sinal diferencial fluorescência emitida pela UA CN. Proteínas, tais como albumina de soro de albumina humana (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são seleccionados como as proteínas modelo. Quatro pequenas drogas moleculares (por exemplo, ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida) de diferentes afinidades de ligação para as proteínas de albumina são testados. Verificou-se que a taxa de formação de Au CNs fluorescentes no interior do fármaco carregado proteína albumina sob condições desnaturantes (por exemplo, 60 ° C ou na presença de ureia) é mais lento do que se formou na proteína primitiva (sem droga). Além disso, a intensidade de fluorescência do SAE-formado como se encontra a ser inversamente correlacionadas com as afinidades de ligação destas drogas para as proteínas de albumina. Particularmente,quanto maior a afinidade da proteína de ligação de drogas, mais lenta é a taxa de formação de Au CNs, e, assim, uma intensidade de fluorescência menor do Au CNs resultante é observado. A intensidade de fluorescência das resultantes Au CNs, por conseguinte, fornece uma medida simples da força de ligação relativa de diferentes fármacos testados. Este método também é extensível para medir a constante de ligação específica à proteína droga (K D) variando simplesmente o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína a uma concentração fixa de proteína. Os resultados medidos correspondem bem com os valores obtidos usando outros métodos de prestígio mas mais complicados.

Proteína desdobramento é um procedimento importante para a formação de proteínas modeladas por Au CNs porque os grupos funcionais mais reactivos (por exemplo, resíduos de tirosina de uma proteína) pode ser exposto a reduzir os iões Au encapsulado e, assim, acelerar a velocidade de formação de Au NCs. Os agentes de desnaturação e de aquecimento externo são dois meios comuns para promover o processo de desdobramento da proteína. A Figura 1 demonstra o efeito do aquecimento e adição de agentes des...

Um protocolo para triagem de drogas moleculares pequenas baseado na síntese in-situ de nanoclusters de ouro fluorescentes ultrapequenos (Au NCs) usando proteína carregada de drogas como modelo é apresentado. Este método é simples para determinar a afinidade de ligação de drogas a uma proteína-alvo por um sinal fluorescente visível emitido pelos NCs de Au moldados por proteínas.

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

O objetivo geral deste novo método de triagem de fármacos com detecção fluorométrica é determinar a afinidade de ligação de pequenas moléculas farmacológicas a uma proteína-alvo por meio da formação de nanoclusters fluorescentes de ouro dentro do molde proteico carregado com o fármaco. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de descoberta de fármacos direcionados a proteínas, como a forma pela qual a força de ligação das moléculas farmacológicas pode afetar a estabilidade das proteínas contra desdobramento, levando à formação diferencial de nanoclusters fluorescentes de ouro com intensidades distintas. A principal vantagem desta técnica é que podemos transformar uma proteína-alvo em um biossensor fluorescente, permitindo a triagem rápida de fármacos de pequenas moléculas sem a necessidade de instrumentos sofisticados ou etapas tediosas de marcação.A combinação do meu próprio conhecimento e da descoberta da coautora, segundo a qual a proteína li carregada possui um efeito de estabilização distinto sobre nanopartículas plasmônicas, inspirou a ideia para este método. Inicie este procedimento com o preparo dos reagentes químicos para triagem de fármacos, conforme detalhado no protocolo descrito no texto, para preparar os nanoclusters de ouro com molde de albumina sérica humana ou HSA, colocando dois frascos de vidro, cada um contendo uma barra magnética micro, sobre dois agitadores magnéticos separados com controle de temperatura.Defina a temperatura de um agitador magnético em 60 graus Celsius. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de albumina sérica humana, 200 microlitros de água ultrapura e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro a cada frasco sob agitação constante para permitir a encapsulação dos íons de ouro dentro do molde proteico; dois minutos depois, adicione 20 microlitros de solução de hidróxido de sódio a cada frasco, a fim de ativar a capacidade redutora da albumina sérica humana na formação de nanoclusters de ouro. Inicie o registro do tempo de reação em zero minutos, a cada 20 minutos.Retire 50 microlitros de cada amostra e transfira para uma placa negra de 384 poços. Meça o espectro de emissão com um leitor de microplacas. Pare a agitação magnética após 100 minutos.Resfrie os frascos de vidro sob água corrente em uma pia. Trace os espectros de emissão fotônica em todos os momentos para cada amostra, a fim de obter a cinética de formação de nanoclusters de ouro em diferentes condições de temperatura. Para preparar os nanoclusters de ouro com molde de albumina sérica bovina ou BSA, coloque um frasco de vidro contendo uma barra magnética microstirradora na parte superior de um agitador magnético.Deixe a temperatura em temperatura ambiente. Misture 200 microlitros de solução de BSA, 200 microlitros de ureia e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro no frasco de vidro sob agitação constante. Dois minutos depois, adicione 20 microlitros de solução de hidróxido de sódio.Para ativar a capacidade redutora da BSA de formar nanoclusters de ouro e começar a registrar o tempo da reação como zero minuto. Meça o espectro de emissão fotônica da mistura reacional a cada hora. Coloque cinco frascos de vidro, cada um contendo um bastão de agitação magnética e previamente rotulados com uma droga ou HSA pura, sobre um agitador magnético multiponto com controle de temperatura.Adicione 200 microlitros de HSA a cada frasco. Em seguida, adicione um microlitro de cada solução de fármaco previamente preparada aos quatro frascos correspondentes. Além disso, adicione um microlitro de DMSO ao frasco controle no agitador r.Defina a velocidade de rotação como 360 RPM e incube por uma hora para permitir a ligação do fármaco à HSA. Uma hora depois, adicione 200 microlitros de água milli Q e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro a cada frasco sob agitação constante. Ajuste a temperatura para 60 graus Celsius sob agitação constante por 10 minutos. Após 10 minutos, adicione 20 microlitros de hidróxido de sódio 1,5 molar a cada frasco e comece a registrar o tempo de reação em zero minutos.As soluções de reação conjunta para medição devem seguir a mesma sequência de adição de fármacos e devem ser realizadas o mais rapidamente possível para minimizar o efeito do atraso temporal. Aspire rapidamente 50 microlitros de solução de cada frasco. Transfira para uma placa negra de 384 poços e meça o espectro de emissão. Registre os espectros de emissão de cada amostra a cada 10 minutos, coletando pelo menos quatro espectros em quatro momentos diferentes.Repita esses passos várias vezes para obter resultados com uma tendência consistente. Trace os espectros de emissão fotônica resolvidos no tempo para cada amostra. Identifique a intensidade máxima de todos os espectros e trace em função do tempo para comparar a cinética de formação de nanoclusters de ouro em diferentes moldes proteicos carregados com fármacos, a fim de medir a constante de ligação entre cada fármaco e a HSA.Substitua as soluções do fármaco por soluções de ibuprofeno em quatro concentrações diferentes. Dez minutos depois, resfrie os frascos de vidro sob água corrente na pia. Aspire 50 microlitros das soluções acima de cada frasco para uma placa preta de 384 poços e meça o espectro de emissão.Repita esses passos mais duas vezes para obter outros dois conjuntos de resultados em diferentes concentrações do fármaco antes de interromper a agitação magnética. Em seguida, trace os espectros de emissão fotônica e analise os resultados brutos obtidos em cada lote individual. Trace os espectros de emissão fotônica de cada amostra em softwares como o Origin Pro e determine a intensidade do pico.Calcule e plote a intensidade de fluorescência relativa em função da concentração do fármaco. Em seguida, calcule a constante de ligação ajustando os dados a um modelo de ligação de sítio único. Utilize a equação de cementina Mics para fazer isso em softwares como o Origin Pro.Selecione no menu a análise de ajuste de curva não linear, depois selecione a função hail na categoria sigmoide de crescimento na página de seleção de funções nas configurações. Clique em ajustar para exibir. Os resultados ajustados mostrados aqui são resultados representativos dos espectros de emissão fotônica resolvidos no tempo de nanoaglomerados de ouro produzidos sob diferentes condições de desnaturação proteica.Pode-se observar que os nanoagregados de ouro se formam mais rapidamente em temperaturas mais elevadas. Condições desnaturantes com ureia também podem facilitar a síntese direta de nanoagregados de ouro utilizando a proteína BSA como molde. Aqui são apresentados resultados típicos de triagem fluorométrica rápida de fármacos com base na intensidade de fluorescência de nanoagregados de ouro utilizando HSA carregada com fármaco como molde.Quanto maior a intensidade fluorescente, menor a força de ligação de uma molécula de fármaco à HSA. Esses espectros mostram o efeito da concentração de carregamento do fármaco na taxa de formação de nanoclusters fluorescentes de ouro dentro da HSA carregada com ibuprofeno. Quanto maior a concentração do fármaco, menor o sinal fluorescente dos nanoclusters de ouro resultantes; aqui se apresenta um resultado representativo da determinação da constante de ligação proteína-fármaco.É calculado ajustando a intensidade de fluorescência relativa de nanoaglomerados de ouro sintetizados no molde de HSA pré-carregado com concentrações variadas do fármaco ibuprofeno, utilizando a equação cementin de MICUs. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos para triagem múltipla de fármacos em paralelo, se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter agora uma boa compreensão de como sintetizar nanoaglomerados de ouro em proteínas carregadas com fármacos e de como determinar a afinidade de ligação de fármacos a uma proteína-alvo, detectável pelo sinal fluorescente emitido pelos nanoaglomerados de ouro resultantes.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, descrevemos a técnica de anisotropia de fluorescência para estudar as interações entre a proteína da síndrome de Shwachman-diamante marcada com fluoróforo (SBDS) e a 1 GTPase semelhante ao fator de alongamento (EFL1). Na incubação de proteínas SBDS com concentrações gradualmente crescentes de EFL1, observa-se um aumento constante na anisotropia, indicando uma interação bem-sucedida entre as duas proteínas.

Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

A fluorimetria de varredura diferencial é um método amplamente utilizado para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas para interações com proteínas. Aqui, apresentamos um método simples para estender essas análises para fornecer uma estimativa da constante de dissociação entre uma pequena molécula e seu parceiro proteico.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

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Neste estudo, aprimoramos as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um caso exemplar.

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Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

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Esse protocolo introduz uma metodologia de triagem fluorométrica otimizada para identificar inibidores naturais de produtos e pequenas moléculas na síntese de proteínas. Sua praticidade o torna adequado tanto para o ensino de graduação em técnicas de descoberta de fármacos quanto para a implementação em campanhas de química medicinal.

Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Aprenda um método fluorimétrico rápido para triagem de drogas que utiliza nanoclusters de ouro fluorescentes sintetizados em template de proteína carregada com fármaco. Esta técnica permite determinar afinidade de ligação sem instrumentação complexa.

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

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