Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

O objetivo geral deste novo método de triagem de drogas fluorométricas é determinar a afinidade de ligação de pequenas moléculas de drogas a uma proteína-alvo, formando nano clusters de ouro fluorescente dentro do modelo de proteína carregada com drogas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das descobertas de medicamentos direcionados a proteínas, como a forma como a força de vidding das moléculas de medicamentos pode afetar a estabilidade do desdobramento das proteínas, levando à formação de nano aglomerados de ouro fluorescente de diferentes intensidades. A principal vantagem deste tenix é que podemos transformar um alvo de proteína em um biossensor fluorescente para permitir a triagem rápida de pequenos medicamentos moleculares sem a necessidade de instrumentos sofisticados e etapas tediosas de rotulagem.

A combinação do meu próprio conhecimento, bem como do co-autor, ela descobriu que a proteína carregou, tem um efeito de estabilização distinto no plasmônico. A nanopartícula inspirou a ideia desse método. Comece este procedimento com a preparação dos reagentes químicos para triagem de drogas, conforme detalhado no protocolo de texto para preparar a albumina sérica humana ou nano aglomerados de ouro com modelo HSA, coloque dois frascos de vidro, cada um contendo uma barra de agitação micromagnética em duas agitações magnéticas controláveis de temperatura separadas.

Defina a temperatura de uma agitação magnética para 60 graus Celsius. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de albumina de soro humano, 200 microlitros de água ultrapura e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro a cada frasco sob agitação constante para permitir o encapsulamento de íons de ouro dentro do molde de proteína, dois minutos depois, adicione 20 microlitros de solução de hidróxido de sódio a cada frasco para ativar a capacidade de redução da albumina sérica humana informando nano aglomerados de ouro. Comece a registrar o tempo de reação em zero minutos a cada 20 minutos.

Retire 50 microlitros de cada amostra e transfira para uma placa preta de 384 poços. Meça o espectro de emissão com um leitor de microplacas. Pare a agitação magnética após 100 minutos.

Resfrie os frascos de vidro em água corrente em uma pia. Plote os espectros de emissão de fotos em todos os momentos para cada amostra para adquirir a cinética de formação de nanoaglomerados de ouro em diferentes condições de temperatura. Para preparar a albumina de soro bovino ou nano aglomerados de ouro com modelo BSA, coloque um frasco de vidro contendo uma barra de agitação micromagnética no topo de uma agitação magnética.

Deixe a temperatura como temperatura ambiente. Misture 200 microlitros de solução BSA, 200 microlitros de ureia e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro no frasco de vidro sob agitação constante. Dois minutos depois, a 20 microlitros de solução de hidróxido de sódio.

Para ativar a capacidade redutora do BSA para formar nano clusters de ouro e começar a registrar o tempo de reação como zero minutos. Meça o espectro de emissão de fotos da mistura de reação de hora em hora. Coloque cinco frascos de vidro, cada um contendo uma barra de agitação magnética e pré-rotulado com um medicamento ou HSA puro em cima de uma agitação magnética multiponto controlável por temperatura.

Adicione 200 microlitros de HSA a cada frasco. Em seguida, adicione um microlitro de cada solução de medicamento previamente preparada aos quatro arquivos correspondentes. Além disso, adicione um microlitro de DMSO ao interruptor de controle no agitador.

Defina a velocidade de centrifugação para 360 RPM e incube por uma hora para permitir a ligação do medicamento à HSA uma hora depois a 200 microlitros de água mili Q e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro para cada frasco sob agitação constante. Defina a temperatura para 60 graus Celsius sob agitação constante por 10 minutos. Após 10 minutos a 20 microlitros de hidróxido de sódio 1,5 molar para cada arquivo e começar a registrar o tempo de reação em zero minutos.

As soluções de reação conjunta para medição devem seguir a mesma sequência de adição de medicamentos e devem ser praticadas o mais rápido possível para minimizar o efeito de intervalo de tempo Retire rapidamente 50 microlitros de solução de cada frasco. Transfira para uma placa preta de 384 poços e meça o espectro de emissão. Registar os espectros de emissão de cada amostra de 10 em 10 minutos, recolhendo pelo menos quatro espectros em quatro momentos diferentes.

Repita essas etapas várias vezes para obter resultados com uma tendência consistente. Traçar os espectros de emissão fotográfica resolvidos no tempo para cada amostra. Identifique a intensidade de pico de todas as amostras e plote em relação ao tempo para comparar a cinética de formação de nano clusters de ouro em diferentes modelos de proteínas carregadas com drogas para medir a constante de ligação entre cada droga e a HSA.

Substitua as soluções medicamentosas por soluções de ibuprofeno em quatro concentrações diferentes. 10 minutos depois, resfrie os frascos de vidro em água corrente em uma pia. Retire 50 microlitros das soluções acima de cada frasco para uma placa preta de 384 poços e meça o espectro de emissão.

Repita essas etapas mais duas vezes para obter mais dois conjuntos de resultados em diferentes concentrações de drogas antes de interromper a agitação magnética. Em seguida, traçar os espectros de emissão de fotos e analisar os resultados para a matéria-prima obtida em cada lote individual. Plote os espectros de emissão de fotos de cada amostra em um software como o Origin Pro e determine a intensidade do pico.

Calcule e plote a intensidade relativa de fluorescência em relação à concentração do medicamento. Em seguida, calcule a constante de ligação ajustando os dados a um único modelo de associação de site. Usando a equação de cimentina de Mics para fazer isso em softwares como o Origin Pro.

Selecione o ajuste de análise de menu ajuste de curva não linear e, em seguida, selecione a função de granizo na categoria sigmoidal de crescimento na página de seleção de função de configurações. Clique em ajustar para exibir. Os resultados ajustados mostrados aqui são resultados representativos dos espectros de emissão de fotos resolvidos no tempo de nano aglomerados de ouro produzidos em diferentes condições de desnaturação de proteínas.

Pode ser observado em nano aglomerados de ouro se formam mais rapidamente em temperaturas mais altas. A condição de desnaturação da uréia também pode facilitar a síntese direta de nanoaglomerados de ouro usando a proteína BSA como modelo. Os resultados típicos da triagem rápida de medicamentos fluorométricos com base na intensidade de fluorescência de nano clusters de ouro usando HSA carregado com medicamentos como modelo são mostrados aqui.

Quanto maior a intensidade fluorescente, mais fraca é a força de ligação de uma molécula de medicamento à HSA. Esses espectros mostram o efeito da concentração de carga do medicamento na taxa de formação de nano aglomerados de ouro fluorescente dentro do HSA carregado com ibuprofeno. Quanto maior a concentração do medicamento, menor o sinal fluorescente dos nano clusters de ouro resultantes mostrados aqui é um resultado representativo da determinação da constante de ligação ao medicamento proteico.

É calculado ajustando a intensidade relativa de fluorescência de nano clusters de ouro sintetizados no modelo HSA pré-carregado com o medicamento ibuprofeno de concentrações variadas usando a equação de ciquinina MICUs Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 30 minutos para triagem de múltiplos medicamentos em paralelo, se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar rédeas, ir nano cluster na proteína carregada de drogas e determinar a afinidade de ligação de drogas a uma proteína alvo detectável pelo sinal fluorescente emitido pelos nano clusters de ouro resultantes.