Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

O objetivo geral deste novo método de triagem de fármacos com detecção fluorométrica é determinar a afinidade de ligação de pequenas moléculas farmacológicas a uma proteína-alvo por meio da formação de nanoclusters fluorescentes de ouro dentro do molde proteico carregado com o fármaco. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de descoberta de fármacos direcionados a proteínas, como a forma pela qual a força de ligação das moléculas farmacológicas pode afetar a estabilidade das proteínas contra desdobramento, levando à formação diferencial de nanoclusters fluorescentes de ouro com intensidades distintas. A principal vantagem desta técnica é que podemos transformar uma proteína-alvo em um biossensor fluorescente, permitindo a triagem rápida de fármacos de pequenas moléculas sem a necessidade de instrumentos sofisticados ou etapas tediosas de marcação.

A combinação do meu próprio conhecimento e da descoberta da coautora, segundo a qual a proteína li carregada possui um efeito de estabilização distinto sobre nanopartículas plasmônicas, inspirou a ideia para este método. Inicie este procedimento com o preparo dos reagentes químicos para triagem de fármacos, conforme detalhado no protocolo descrito no texto, para preparar os nanoclusters de ouro com molde de albumina sérica humana ou HSA, colocando dois frascos de vidro, cada um contendo uma barra magnética micro, sobre dois agitadores magnéticos separados com controle de temperatura.

Defina a temperatura de um agitador magnético em 60 graus Celsius. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de albumina sérica humana, 200 microlitros de água ultrapura e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro a cada frasco sob agitação constante para permitir a encapsulação dos íons de ouro dentro do molde proteico; dois minutos depois, adicione 20 microlitros de solução de hidróxido de sódio a cada frasco, a fim de ativar a capacidade redutora da albumina sérica humana na formação de nanoclusters de ouro. Inicie o registro do tempo de reação em zero minutos, a cada 20 minutos.

Retire 50 microlitros de cada amostra e transfira para uma placa negra de 384 poços. Meça o espectro de emissão com um leitor de microplacas. Pare a agitação magnética após 100 minutos.

Resfrie os frascos de vidro sob água corrente em uma pia. Trace os espectros de emissão fotônica em todos os momentos para cada amostra, a fim de obter a cinética de formação de nanoclusters de ouro em diferentes condições de temperatura. Para preparar os nanoclusters de ouro com molde de albumina sérica bovina ou BSA, coloque um frasco de vidro contendo uma barra magnética microstirradora na parte superior de um agitador magnético.

Deixe a temperatura em temperatura ambiente. Misture 200 microlitros de solução de BSA, 200 microlitros de ureia e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro no frasco de vidro sob agitação constante. Dois minutos depois, adicione 20 microlitros de solução de hidróxido de sódio.

Para ativar a capacidade redutora da BSA de formar nanoclusters de ouro e começar a registrar o tempo da reação como zero minuto. Meça o espectro de emissão fotônica da mistura reacional a cada hora. Coloque cinco frascos de vidro, cada um contendo um bastão de agitação magnética e previamente rotulados com uma droga ou HSA pura, sobre um agitador magnético multiponto com controle de temperatura.

Adicione 200 microlitros de HSA a cada frasco. Em seguida, adicione um microlitro de cada solução de fármaco previamente preparada aos quatro frascos correspondentes. Além disso, adicione um microlitro de DMSO ao frasco controle no agitador r.

Defina a velocidade de rotação como 360 RPM e incube por uma hora para permitir a ligação do fármaco à HSA. Uma hora depois, adicione 200 microlitros de água milli Q e 200 microlitros de solução de cloreto de ouro a cada frasco sob agitação constante. Ajuste a temperatura para 60 graus Celsius sob agitação constante por 10 minutos. Após 10 minutos, adicione 20 microlitros de hidróxido de sódio 1,5 molar a cada frasco e comece a registrar o tempo de reação em zero minutos.

As soluções de reação conjunta para medição devem seguir a mesma sequência de adição de fármacos e devem ser realizadas o mais rapidamente possível para minimizar o efeito do atraso temporal. Aspire rapidamente 50 microlitros de solução de cada frasco. Transfira para uma placa negra de 384 poços e meça o espectro de emissão. Registre os espectros de emissão de cada amostra a cada 10 minutos, coletando pelo menos quatro espectros em quatro momentos diferentes.

Repita esses passos várias vezes para obter resultados com uma tendência consistente. Trace os espectros de emissão fotônica resolvidos no tempo para cada amostra. Identifique a intensidade máxima de todos os espectros e trace em função do tempo para comparar a cinética de formação de nanoclusters de ouro em diferentes moldes proteicos carregados com fármacos, a fim de medir a constante de ligação entre cada fármaco e a HSA.

Substitua as soluções do fármaco por soluções de ibuprofeno em quatro concentrações diferentes. Dez minutos depois, resfrie os frascos de vidro sob água corrente na pia. Aspire 50 microlitros das soluções acima de cada frasco para uma placa preta de 384 poços e meça o espectro de emissão.

Repita esses passos mais duas vezes para obter outros dois conjuntos de resultados em diferentes concentrações do fármaco antes de interromper a agitação magnética. Em seguida, trace os espectros de emissão fotônica e analise os resultados brutos obtidos em cada lote individual. Trace os espectros de emissão fotônica de cada amostra em softwares como o Origin Pro e determine a intensidade do pico.

Calcule e plote a intensidade de fluorescência relativa em função da concentração do fármaco. Em seguida, calcule a constante de ligação ajustando os dados a um modelo de ligação de sítio único. Utilize a equação de cementina Mics para fazer isso em softwares como o Origin Pro.

Selecione no menu a análise de ajuste de curva não linear, depois selecione a função hail na categoria sigmoide de crescimento na página de seleção de funções nas configurações. Clique em ajustar para exibir. Os resultados ajustados mostrados aqui são resultados representativos dos espectros de emissão fotônica resolvidos no tempo de nanoaglomerados de ouro produzidos sob diferentes condições de desnaturação proteica.

Pode-se observar que os nanoagregados de ouro se formam mais rapidamente em temperaturas mais elevadas. Condições desnaturantes com ureia também podem facilitar a síntese direta de nanoagregados de ouro utilizando a proteína BSA como molde. Aqui são apresentados resultados típicos de triagem fluorométrica rápida de fármacos com base na intensidade de fluorescência de nanoagregados de ouro utilizando HSA carregada com fármaco como molde.

Quanto maior a intensidade fluorescente, menor a força de ligação de uma molécula de fármaco à HSA. Esses espectros mostram o efeito da concentração de carregamento do fármaco na taxa de formação de nanoclusters fluorescentes de ouro dentro da HSA carregada com ibuprofeno. Quanto maior a concentração do fármaco, menor o sinal fluorescente dos nanoclusters de ouro resultantes; aqui se apresenta um resultado representativo da determinação da constante de ligação proteína-fármaco.

É calculado ajustando a intensidade de fluorescência relativa de nanoaglomerados de ouro sintetizados no molde de HSA pré-carregado com concentrações variadas do fármaco ibuprofeno, utilizando a equação cementin de MICUs. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos para triagem múltipla de fármacos em paralelo, se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter agora uma boa compreensão de como sintetizar nanoaglomerados de ouro em proteínas carregadas com fármacos e de como determinar a afinidade de ligação de fármacos a uma proteína-alvo, detectável pelo sinal fluorescente emitido pelos nanoaglomerados de ouro resultantes.