Avaliação das propriedades imunomoduladora de mesenquimais humanas Células-Tronco (MSCs)
24 de dezembro de 2015
As propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas (MSC) aparecem cada vez mais relevante para a aplicação clínica. Usando um sistema de co-cultura de MSCs e leucócitos do sangue periférico de pré-corados com o éster succinimidilo corante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), descreve-se a avaliação in vitro de MSC imunomodulação em proliferação e subpopulações efectoras de leucócitos específicos.
O objetivo geral deste experimento é avaliar as propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas ou msc. Este método pode ajudar a elucidar os mecanismos envolvidos na imunomodulação por células-tronco mesenquimais humanas, um processo que pode ter relevância terapêutica. A principal vantagem desta técnica é que tanto a ocorrência da proliferação de leucócitos efetores quanto o número de divisões celulares podem ser avaliados, demonstrando que o procedimento será por calçado.
Um técnico do meu laboratório para isolar PBMC começa diluindo 25 mililitros de uma amostra de sangue total heparinizado com 25 mililitros de PBS em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adiciona-se 15 mililitros de gradiente de densidade de Ficoll-Paque a um novo tubo de 50 mililitros. Então, mantendo o tubo em um ângulo, a suspensão celular diluída é cuidadosamente sobreposta ao gradiente de densidade.
Cuidando disso, não há mistura entre as camadas. Um dos passos mais críticos deste experimento é a sobreposição do sangue sem perturbar o gradiente de densidade. Isso é essencial para garantir uma alta pureza e baixa contaminação por hemácias nas pbmc isoladas.
Agora, separe as células por centrifugação. Três camadas distintas devem ser aparentes. A camada superior de plasma, a camada inferior do gradiente de densidade do fial pack e uma fina camada intermediária de PBMC.
Usando uma pipeta PE, remova a camada superior tomando cuidado para não aspirar a camada da fase intermédia. Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir cuidadosamente os pbmc para um tubo cônico de 50 mililitros. Misture as células com 20 mililitros de PBS e, em seguida, centrifugue para remover quaisquer vestígios do gradiente de densidade.
Em seguida, lave o pellet em outros 20 mililitros de PBS para remover as plaquetas. Re-suspenda o segundo pellet em meio completo para leucócitos na concentração de um vezes 10 à sétima células por mililitro. Para montar um co-cultivo de MSC e leucócitos, aqueça previamente o meio completo para MSC a 37 graus Celsius por não mais de 30 minutos.
Em seguida, semeie cinco vezes 10 à quarta MSC por um mililitro de meio completo para MSC por poço em placas de 24 poços para adesão durante a noite a 37 graus Celsius, permitindo que as células atinjam 80% de confluência. Na manhã seguinte, aspire o meio e adicione o número apropriado de PBMC marcados com CFSE às MSC em um mililitro de meio completo para leucócitos. Na proporção de uma para 10 de MSC para PBMC, ative as células com 10 microgramas de PHA por mililitro de meio completo para leucócitos.
Em seguida, nos dias três e cinco do co-cultivo, transfira o número apropriado de co-cultivo para tubos cônicos de fundo redondo e avalie a proliferação dos leucócitos marcados com CFSE por meio de análise citométrica de fluxo para realizar um ensaio de supressão de efetores. Comece montando um co-cultivo de M-S-C-P-B-M-C conforme acabou de ser demonstrado, com 2,5 vezes 10 à sexta p BMCs em co-cultivo com 250.000 MSCs. Para garantir quantidade suficiente de p BMCs em co-cultivo com MSCs para seleção de subpopulações.
Após 48 a 72 horas a 37 graus Celsius, selecione os leucócitos imunomoduladores induzidos por CMM de interesse com as microesferas magnéticas apropriadas. Em seguida, adicione células T alogênicas positivas para CD4 marcadas com CFSE em um mililitro de meio completo para leucócitos por poço, em várias proporções experimentais. A seguir, adicione microesferas conjugadas com anti-CD3/CD28 em uma proporção de um para um de microesfera para célula, para estimular as células T positivas para CD4.
No terceiro dia do co-cultivo, avalie a proliferação das células T CD4 positivas marcadas com CFSE por citometria de fluxo. As CMM são células aderentes com morfologia fusiforme fibroblástica. E os PBMCs e leucócitos são células pequenas, redondas e não aderentes, o que permite a distinção clara dessas duas populações celulares. Em um co-cultivo, quando não há proliferação, as células marcadas com CFSE são observadas como um único pico altamente positivo e fortemente fluorescente quando as células foram ativadas.
A proliferação se manifesta como múltiplos picos menores com perda e deslocamento para a esquerda da intensidade de fluorescência quando ocorreu supressão da proliferação. Por exemplo, em um co-cultivo de MSC, os múltiplos picos menores diminuem em número com um aumento concomitante da intensidade de fluorescência, evidenciado pelo deslocamento dos picos para a direita e pelo aumento da nitidez do pico mais à direita, que representa as células não divididas em um ensaio de supressão por células efetoras. O efeito supressor das MSCs sobre a proliferação de células T CD4 positivas pode ser avaliado adicionalmente de maneira dependente da dose.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a imunomodulação por células-tronco mesenquimais humanas. Não se esqueça de que trabalhar com células humanas pode ser perigoso e de que sempre devem ser tomadas precauções.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo investiga as propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas (CTMs) utilizando um sistema de co-cultura com leucócitos do sangue periférico. A avaliação concentra-se na proliferação de leucócitos efetores e em subpopulações específicas, destacando a relevância terapêutica potencial das CTMs.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Pesquisa com Células-Tronco
- Proliferação Celular
Contexto
- As células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) possuem propriedades imunomoduladoras.
- Compreender as interações das MSCs com leucócitos é crucial para aplicações terapêuticas.
- A proliferação de leucócitos efetores é um aspecto fundamental da resposta imune.
- Sistemas de co-cultivo podem modelar efetivamente essas interações in vitro.
Objetivo do Estudo
- Avaliar os efeitos imunomoduladores das CMMs sobre a proliferação de leucócitos.
- Elucidar os mecanismos de imunomodulação pelas CMMs.
- Explorar a relevância terapêutica das CMMs em aplicações clínicas.
Métodos Utilizados
- Sistema de co-cultivo de CMM e leucócitos do sangue periférico.
- Uso do éster succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) para rastreamento celular.
- Avaliação da proliferação de leucócitos efetores.
- Análise de subpopulações específicas de leucócitos.
Resultados Principais
- Demonstrou a modulação induzida por CMM na proliferação de leucócitos.
- Identificou subpopulações específicas afetadas por CMM.
- Forneceram informações sobre os mecanismos de imunomodulação por CMM.
- Destacou o potencial terapêutico das CMM em contextos clínicos.
Conclusões
- As CMM exibem efeitos imunomoduladores significativos sobre os leucócitos.
- Os achados apoiam o uso terapêutico das CMM em ambientes clínicos.
- É necessária mais pesquisa para compreender completamente os mecanismos envolvidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da função imunomoduladora de CMM por meio de ensaios de proliferação de leucócitos baseados em CFSE fornece um método quantitativo e reprodutível para avaliar o potencial terapêutico em doenças mediadas pelo sistema imunológico. Essa abordagem apoia a validação de alvos ao permitir a redução de riscos mecanicistas da imunossupressão mediada por CMM antes do investimento pré-clínico. A adaptabilidade do ensaio a subpopulações específicas de leucócitos aumenta a confiança preditiva na seleção de candidatos líderes para pipelines imunomoduladores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a supressão mediada por CSM da proliferação de leucócitos efetores como uma leitura funcional da atividade imunomoduladora.
- Valor Operacional: Fornece um método padronizado, baseado em marcação, para quantificar o histórico de divisão e a cinética de proliferação sem uso de radioatividade.
- Valor Científico: Apoia a triagem fenotípica de doadores de CSM ou estratégias de pré-condicionamento mediante a medição da supressão da proliferação de leucócitos marcados com CFSE.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor científico: Permite o isolamento e o rastreamento de subpopulações específicas de leucócitos (por exemplo, células T CD4+) por meio da seleção com microesferas magnéticas antes da cocultura, possibilitando o perfil de imunomodulação específico da subpopulação.
- Valor operacional: Os perfis de diluição de CFSE gerados por citometria de fluxo fornecem dados quantitativos e multiparamétricos sobre a supressão da proliferação e o histórico de divisão.
- Valor científico: Facilita a avaliação da resposta dose-dependente da imunomodulação por MSC em diferentes proporções de MSC:leucócitos e condições de ativação (por exemplo, estimulação com PHA).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a potência imunomoduladora in vitro com a eficácia clínica potencial em doenças relacionadas ao sistema imunológico, modelando a comunicação cruzada entre MSCs e leucócitos.
- Valor Operacional: Permite amostragens longitudinais (por exemplo, dias 3 e 5) para avaliar a dinâmica temporal da supressão e recuperação.
- Valor Científico: Apoia a avaliação alinhada a biomarcadores ao correlacionar a supressão da proliferação com a expressão intracelular de citocinas em leucócitos co-cultivados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de proliferação de leucócitos baseado em CFSE integra-se aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta como uma ferramenta funcional de triagem imunomodulatória, conectando as etapas de validação de alvo e otimização de compostos líderes para terapêuticas baseadas em CMM.
- Biologia da Descoberta: Testa a hipótese de que as CMMs suprimem a proliferação de leucócitos, fornecendo uma compreensão mecanicista das vias imunossupressoras.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis de proliferação que permitem a comparação entre lotes de CMMs, doadores ou condições de priming.
- Análises: Gera dados de citometria de fluxo capazes de resolver picos de proliferação, rastreamento de divisões e respostas específicas a subpopulações em populações heterogêneas de leucócitos.
- Pesquisa Translacional: Modela in vitro as interações entre células imunes humanas e CMMs, apoiando a extrapolação para contextos clínicos de imunomodulação.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma modular e adaptável, aplicável a diferentes tipos de células imunes e condições de estímulo relevantes para doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer evidências diretas e quantificáveis da supressão de leucócitos mediada por CMM.
- Valor Operacional: Garante a padronização do ensaio por meio de razões definidas entre CMM:leucócitos, protocolos de marcação com CFSE e estratégias de seleção por citometria de fluxo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao identificar CMM com atividade imunomoduladora potente e reprodutível já nos estágios iniciais do desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a CMM com base na força funcional da imunomodulação, e não apenas em marcadores fenotípicos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de leucócitos primários, marcação com CFSE e análise de citometria de fluxo multicolorida.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo capazes de resolver picos de diluição de CFSE e sistemas de separação por microesferas magnéticas para isolamento de subpopulações.
- Necessita padronização das condições de ativação de leucócitos (por exemplo, concentração de PHA) e protocolos de pré-cultivo de CMM em diferentes locais.
- Requer otimização das proporções entre CMM e leucócitos e da duração da co-cultura para evitar artefatos de supercrescimento ou esgotamento de nutrientes.
- Limitado pela variabilidade entre doadores na resposta dos leucócitos, exigindo controles com doadores agrupados ou pareados para métricas reprodutíveis de supressão.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
2:23
MSC: Leukocyte Co-culture and Leukocyte Activation
3:31
Variation: Effector Suppression Assay
4:38
Results: Representative Suppressive Effects of MSC on Leukocyte Proliferation
5:51
Conclusion
