Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é analisar a expressão gênica intracelular diretamente em células vivas por meio da aplicação de nanopartículas fluorescentes específicas para genes. Isso é realizado primeiramente definindo as sequências-alvo apropriadas no gene de interesse. O segundo passo é fabricar nanopartículas com sequências de captura e marcadoras específicas.

Em seguida, as nanopartículas são adicionadas diretamente ao meio de cultura da célula viva. O passo final é incubar as células com as nanopartículas durante a noite a 37 graus Celsius e 5%CO2 em uma atmosfera umidificada. Em última análise, a microscopia de fluorescência é utilizada para visualizar a fluorescência específica de genes em células-alvo vivas, enquanto a análise de citometria de fluxo é usada para quantificar o número de células fluorescentes.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como imunohistoquímica, sondas moleculares ou análise por PCR, é que a expressão gênica pode ser observada visualmente em células vivas sem qualquer manipulação do cultivo celular. A demonstração do procedimento será realizada por Martina Teresa, bióloga e aluna de doutorado do nosso laboratório, e por Lynette Henkel, para a citometria de fluxo. Após determinar as sequências-alvo, solicite nanopartículas de ouro liofilizadas de fontes comercialmente disponíveis.

Essas partículas são compostas por uma partícula central de ouro ligada covalentemente a uma fita de captura, que está ligada a uma fita repórter. Quando o mRNA alvo se liga à fita de captura, a fita repórter e seu fluoróforo ligado são liberados na solução, permitindo que o Fluor quatro emita fluorescência. Antes da reconstituição.

As nanopartículas devem ser armazenadas a quatro graus Celsius, no escuro, em uma caixa de papelão. Para reconstituir as nanopartículas de ouro, adicione 20 microlitros de água bidestilada, obtendo uma concentração final de 100 nano molares. As nanopartículas reconstituídas podem ser armazenadas à temperatura ambiente, no escuro, por pelo menos um ano.

No dia da aplicação, dilua a solução estoque de nanopartículas de ouro até uma solução de trabalho 20 x em PBS, retire uma placa de 24 poços contendo células HEK 293 do incubador de cultura celular, aspire o meio e então adicione 237,5 microlitros de meio de cultura fresco. Em seguida, pipete 12,5 microlitros da solução de trabalho de nanopartículas em cada poço preparado e agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme das nanopartículas. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% CO₂ em atmosfera umidificada. No dia seguinte.

Analisar os cultivos celulares quanto à fluorescência específica do gene no sítio três utilizando um microscópio fluorescente padrão para preparar as células para citometria de fluxo. Lavar as células HEK 293 que exibem fluorescência induzida no sítio três uma vez com PBS e adicionar um mililitro de tripsina 0,05% EDTA, incubando as células por três minutos a 37 graus Celsius e 5% CO2. Após a incubação, adicionar 0,5 mililitros de meio CO e pipetar para cima e para baixo.

Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Adicione três mililitros de meio de cultura e centrifugue o tubo por cinco minutos a 300 ×g. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão fax gelado. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro e armazene-as no gelo, ao abrigo da luz, até a análise.

Antes da análise por citometria de fluxo, passe as células por um filtro de 30 micrômetros para evitar agregação celular. Em seguida, adicione iodeto de propídio às células numa concentração final de dois microgramas por mililitro por pelo menos dois minutos, leve as células ao vórtex do citômetro de fluxo e carregue o tubo de amostra no aparelho. Para detectar células positivas para SI três.

Utilize células-controle não tratadas para definir as portas hierárquicas na dispersão direta ou área FSC versus dispersão lateral ou área SSC, na altura FSC versus largura FSC e na altura SSE versus largura SSE, a fim de excluir detritos celulares e células duplas. Remova as células mortas da análise com base na coloração com iodeto de propídio, exibindo o canal PE contra o canal PE Texas Red, e então realize a porta final de classificação nas células positivas para PE no sítio três. Detecção de GA dh.

Um gene de controle constitutivo foi analisado em células HEK 293 para validar a viabilidade experimental. Nanopartículas de controle negativo scrambled apresentam pouca ou nenhuma fluorescência, enquanto o controle positivo de captação permanente fluoresce. Os controles mostram sinal forte após incubação durante a noite.

Essas nanopartículas demonstraram detectar especificamente os marcadores de células-tronco pluripotentes, expressão gênica de nano e GDF três, em células-tronco pluripotentes induzidas humanas e suínas ou CIPs. Importante, esses marcadores foram detectados apenas nas CIPs e não nas células fibroblásticas que serviram como camada de alimentação durante o cultivo de células IPS. Tanto a análise visual quanto a análise quantitativa por citometria de fluxo foram utilizadas para avaliar a eficiência de marcação das nanopartículas GA DH na edição graduada de nanopartículas de zero a 1000.

Realizou-se a transfeção com molaridade PICO em células HEK 293, o que demonstrou um aumento claro e dependente da concentração na fluorescência. Em seguida, realizou-se a análise quantitativa em células-tronco embrionárias murinas, que mostraram aproximadamente 40% de células positivas para CY3 após a introdução de nanopartículas de GA DH na concentração de 400 PICOMOLAR. Valores semelhantes foram obtidos para os marcadores de pluripotência.

Nano e GDF três uma vez dominados. Esta técnica pode ser realizada em até 16 horas se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar nanopartículas específicas para genes a fim de detectar diretamente a expressão gênica intracelular em células vivas utilizando microscopia de fluorescência.